鉴定调节神经发生的物质和条件的方法

专利名称：鉴定调节神经发生的物质和条件的方法
鉴定调节神经发生的物质和条件的方法对相关申请的交叉参考本申请根据35 U.S.C.§ 119(e)，要求于2005年7月8日和于2006年1月31日 提交的美国临时专利申请60/697,905和60/763,883的优先权，它们以其全文纳入本 文作参考。本发明的领域本发明涉及鉴定调节神经发生的物质和条件的方法和手段。而且，本发明涉及 用于移植入对象的神经细胞离体制剂的方法和组合物。本发明还涉及鉴定适合移植 的神经干细胞群的方法和手段。背景神经发生在动物和人脑中是一个重要过程，籍此，有机体在整个生命周期中不 断产生新的神经细胞。新产生的细胞能够分化成中枢神经系统的功能细胞和整合进 脑中已有的神经回路中。在整个成年期，神经发生局限在哺乳动物的脑的两个限定 区域侧脑室的室下带(SVZ)和海马齿状回。在这些区域，多能神经祖细胞(NPC)不 断分裂形成新的功能性神经元和神经胶质细胞(请参阅Gage 2000的综述)。显示有各 种因素能够剌激成年人海马的神经发生，例如，肾上腺切除术、自发锻炼、富有营 养的(生长)环境、海马依赖型学习和抗抑郁剂(Yehuda 1989、 vanPraag 1999、 Brown J 2003、 Gould 1999、 Malberg2000、 Santarelli 2003)。其它因素，如肾上腺激素、应激、 年龄和药物成瘾均对神经发生有负面影响(Cameron 1994、 McEwen 1999、 Kuhn 1996、 Eisch 2004)。能够调节神经发生的药物极有可能是对抗许多疾病一包括但不限于阿耳茨海 默病、帕金森病、外伤性脑损伤、(精神)发育障碍、抑郁症和心境障碍、中风和癫痫 症的治疗剂。例如，帕金森病是以黑质内多巴胺能神经元退化引起黑质纹状体通路 丧失为特征的进行性神经退化疾病。尽管还不知道帕金森病的成因，但它必然与多巴胺能(酪氨酸羟化酶(TH)阳性)中脑神经元的进行性死亡，诱导运动神经损伤有关。 当高达70%的TH阳性黑质纹状体神经元退化时，出现帕金森病的特征性症状。最 近试验了以替换掉损失的多巴胺能神经元或破坏异常的基底神经节回路为目标的外科手术(C. Honey等1999)，然而在新诊断出患者中阻止其疾病发展的主要目标尚未 实现。因此，目前尚未有令人满意的治愈、预防或治疗帕金森病或其症状的方法。 然而，考虑到神经退化对帕金森病的作用，基于神经发生的治疗为从该病的基础原 因着手直接治疗提供了手段。调节神经发生的物质也可以治疗抑郁和其它心境障碍。例如，认为神经发生对 抑郁症患者的海马起到了自我稳定的重要作用。病理刺激，例如抑郁，会使神经元 萎縮和死亡，这将引起与抑郁时间长短和严重性有关的海马体积縮小。据报道抗抑 郁药物能够逆转海马体积的縮小。据报道将已知的抗抑郁药用于动物模型显示了这 类刺激作用，而遗传模型则提示抗抑郁活性可能需要海马神经发生。例如，据临床 前报道，百忧解(Prozac)和其它抗抑郁药发挥抗抑郁效力均需要神经发生(Santarelli、 Saxe等2003)。而且，据报道，抗抑郁药开始发生治疗性作用所需的时间与神经发 生的时程有关。因此，证据表明目前提供的抗抑郁药治疗抑郁症的能力至少部分取 决于它们的神经发生刺激特性。尽管它们对神经发生有作用，目前提供的大部分抗抑郁药主要是研制来调节其 它过程的。例如，大部分药物均靶向参与复杂信号网络的特异性受体系统，而且是 多功能的。结果，大部分药物具有的非特异性作用机制，会引起不良负作用和削弱 效力。例如，主流的抗抑郁药(即SSRI)使至少10%的治疗群体发生显著的性(性欲衰 退和延迟射精)、GI(恶心)和中枢神经系统(头痛)副作用，并且通常需要4-6周才能开 始作用。此外，30-40%的抑郁症患者对口服抗抑郁药的治疗没有反应。因此，鉴定 特异性靶向神经发生的物质通过避开与目前抗抑郁药副作用有关的受体和通路，为 研发更特异和有效的抑郁治疗提供机会。基于神经发生的治疗还能有效治疗与原发性或转移性脑肿瘤的放疗或化疗有关 的认知衰退。这种衰退发生于 50%的患者中，然而目前几乎没有成功的治疗或预防 手段。在动物模型中，认为辐射诱发性脑损伤是由神经发生减少所致的海马功能障 碍引起的(Monje等，2002)。辐射使得神经祖细胞群丧失增殖能力，而剩下的神经前 体只能接受非神经元胶质的命运。当将移植的干/前体细胞植入辐射动物的海马时， 这些细胞分化成神经元的数量显著减少，表明微环境影响神经发生。辐射使得分泌 影响神经前体细胞增殖和命运的细胞因子的活化小胶质细胞的数量显著增加(Monje 等，2002)。例如，小胶质细胞分泌白介素(IL)-6， IL-6可能通过减少神经元分化，而 减少神经元的体外神经发生、细胞存活和积累(Monje等，2003)。因此，IL-6能够有 效调节海马的神经发生。鉴定神经发生的其它调节剂，包括能够刺激神经发生的物质，有可能可以逆转放疗和化疗的退化性或认知性影响。因此，鉴定能够调节神经发生的治疗剂可能有效治疗各种肿瘤疾病和/或神经疾 病。而且，接触药理学或其它物质，如食品添加剂或环境毒素，可以干扰神经发生， 产生对脑功能不利的后果，包括认知和记忆受损。因此，非常需要能够灵敏和有效 地试验调节神经发生的物质的方法。对上述文件的引用并非打算承认任何上述文件是有关的现有技术。所有与日期 有关的声明或与这些文件内容有关的陈述均基于本申请人所获得的信息而不构成与 日期或这些文件内容的正确性有关的任何承认。发明简述本发明提供了鉴定调节神经发生的化合物或条件(或如下所述的"神经发生调节 剂")的体外方法。在一些实施方式中，采用本发明公开的方法鉴定的神经发生调节 剂在体内调节神经发生。所述方法包括"营养"试验，其检测或鉴定能增加神经发 生的物质或条件。所述方法还包括"毒性"或"毒素"试验，其检测或鉴定通过对 神经发生细胞产生毒性来抑制或减少神经发生的物质或条件。有利地，为了检测各种的治疗方式对神经发生的作用，本发明公开的方法提供 了灵敏性、特异性和预测价值更高的工具。在一些实施方式中，利用本发明公开的 方法通过鉴定调节神经发生级联反应关键步骤的分子或其它治疗方式来研制改进的 抗抑郁药。所述改进的抗抑郁药包括与目前提供的药物疗法有关的显示能增强抑郁 和相关心境障碍的治疗效果的那些物质。本发明公开的方面包括可以定量和/或高通量方式实施的神经球的生长(或增殖) 试验和基于悬液中与非粘附神经球相对的单层或粘附形式的神经细胞的试验。因此，在第一方面，本文描述了称为神经球试验(NSA)的鉴定和描绘细胞培养物中的神经干细胞的方法。在NSA中，将细胞与神经组织例如侧脑室SVZ或海马DG 分离，在存在促分裂原例如表皮生长因子(EGF)和/或碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) 的情况下增殖，来形成球形细胞簇，称为神经球。经培养的神经球呈现神经干细胞 (NSC)的主要特征，包括自我更新的能力，或产生保留亲本细胞特点的后代细胞的能 力，以及多能性，或形成一种以上(直到全部)衍生出干细胞的组织的细胞类型的能力。 就中枢神经系统(CNS)而言，多能性包括形成神经元和神经胶质细胞(星形细胞和少 突胶质细胞)的能力。多能NSC还可具有分化成其它细胞类型，在某些条件下具体是 内皮细胞的能力。在各种实施方式中，本发明提供了检测调节神经球细胞培养物中神经发生的物质的改进方法。 一些实施方式中，在神经球中培养NSC具有一个或多个与利用游离 细胞的方法有关的优点。例如，在一些实施方式中，神经球刺激某些NSC所生存的体内环境条件，例如与其它NSC、各种分化阶段的祖细胞和/或CNS成熟细胞的细 胞间接触情况。因此，神经球可用于检测以某种机制作用的神经发生调节物质和条 件，例如涉及细胞间通信的那些，包括作为非限制性例子的正或负反馈。因此在一些实施方式中，本文描述了检测生长或增殖的NSA。在一些情况下， 所述检测神经球生长的方法基于检测或测定神经球中细胞存活率提高。在其它实施 方式中，所述方法基于检测或测定神经球中的细胞增殖增强。本文公开的这类方法 的非限制性例子包括检测或测定l)神经球的尺寸；2)如通过作为非限制性例子的 ELISA、染色法或其它试验检测神经球中细胞因子的表达；和3)神经球中的基因表 达。本发明还包括通过检测或测定神经球生长来鉴定调节神经发生的物质或条件的 方法。这类方法包括培养包括NSC例如作为非限制性例子的人NSC的神经球群体， 和任选将各个神经球与神经球群体分离。除了检测或测定神经球生长以外，可以将 所述培养的神经球接触受试物或受试条件，然后测定神经球的至少一种能够表征其 性质和/或神经发生程度的特性。表征神经发生的特性包括例如， 一种或多种基因的 表达；和一个或多个神经球或检测细胞群或其亚群中的神经干细胞、袓细胞或有丝 分裂细胞的个数和/或比率。可以将所述测定值与未接触受试物或受试条件的同一个 培养神经球群体或分离神经球比较。在另外实施方式中，本文公开的基于神经球的方法可以包括一种或多种特征。 这类特征的非限制性例子包括分离神经球或神经球内的细胞；例如在接触受试物或 受试条件和基于神经球的测定之后，测定所述解离细胞的至少一种特性；和/或将解 离细胞的特性与神经球的一种或多种特性相关联。在其它实施方式中，本文所述的 方法包括其它特征将神经球亚群与神经球群体分离；将神经球亚群中的细胞解离； 和确定包含NSC的解离细胞的比例。其它实施方式包括将接触受试物或受试条件的 一个或多个分离神经球中NSC的比例与未接触受试物或受试条件的神经球亚群中 NSC的比例进行比较的步骤。在第二方面，本文所述的检测调节神经发生的物质和条件的方法包括以下步骤 将单层培养物中的人神经干细胞群体接触受试物或受试条件；和测定表征神经发生程度和/或性质的神经细胞的至少一种特性。在各种实施方式中，基于单层的方法能 够(例如)通过鉴定、分离和/或富集单层培养物中的NSC，和/或通过控制检测细胞群中NSC的微环境来直接检测对NSC的神经发生调节作用。在其它实施方式中，将本发明的基于单层的方法与基于神经球的方法结合使用来帮助检测和鉴定神经发生调 节剂。在一些实施方式中，使本文公开方法中采用的所述单层NSC是从前一单层NSC 传代而来。因此本文描述了衍生自前一单层的单层后代细胞的应用。其它实施方式 中，所述NSC单层由本文所述的一个或多个神经球制备得到。因此这类单层不是由 前一NSC单层传代得到的。在本发明实践中采用的神经细胞包括神经球和单层形式，优选是分离自哺乳动 物，例如小鼠、大鼠、家兔或灵长类动物，最优选分离自人组织。因为据报道人NSC 难以在单层细胞培养物中增殖和维持，因此， 一些实施方式中，首先培养人神经细 胞和连续传代成为神经球，这样有助于使神经干细胞在细胞培养物中分离和扩增。 涉及单层细胞的本发明各方面部分基于解离神经球，然后对它们进行表面贴壁培养， 从而产生基本上均一的单层细胞而能够以适于检测后续神经发生的单层形式进行传 代。因此，在一些实施方式中，本发明的方法包括(a)在基层上将NSC培养为单层细 胞；(b)使所述细胞与一种或多种受试物接触；(c)测定表征神经发生性质和/或程度的 NSC的至少一种特征；和(d)将NSC的至少一种特征与同测试细胞类似培养但未施用 受试物的对照NSC的该特征进行比较。本文公开的其它方法包括(a)将单层NSC与 一种或多种受试物接触；和(b)测定表征神经发生性质和/或程度的NSC的至少一种特 征。 一些情况下，可以利用由前一单层细胞传代的单层细胞来实施这些实施方式。 其它情况下，所述单层细胞可以是由神经球制得的细胞。在其它实施方式中，本发明的方法包括(a)将NSC培养成神经球；(b)解离神经球 和在基层上将细胞培养成单层；(c)使所述细胞与一种或多种受试物接触；和(d)测定 表征神经发生性质和/或程度的NSC的至少一种特征。在另外的实施方式中，营养或毒性试验方法包括将NSC与一个或多个神经球解 离；在没有促分裂原的情况下将它们种板；和在没有促分裂原的情况下使它们接触受试物或受试条件来鉴定所述物质或条件对细胞有营养或有毒性作用。如本文所述，鉴定了营养化合物如组胺，和毒性剂如BAY-60-7550。在或选实施方式中，本发明的方法还包括以下步骤对神经球的解离细胞进行 分选来分离出NSC，然后如下所述将后者培养成单层细胞，用一种或多种受试物处 理，评估其作为神经发生特征的特性。 一些实施方式中，对NSC分选包括用细胞类型特异性标签标记NSC或非NSC，和用自动化方法例如荧光激活细胞分选法(FACS) 对细胞进行分选。其它实施方式中，细胞类型特异性标记能够测定例如包含NSC或 非NSC的神经球中的细胞比例。在其它实施方式中，本发明的方法包括在有助于检测神经发生调节作用的一种 或多种因子(在下文中称为"组成型因子")存在时培养NSC。 一种或多种组成型因子 的存在可以例如通过模拟出现神经发生的体内环境来有利地帮助鉴定神经发生调节 剂。 一些实施方式中，可用于本发明方法中的组成型因子是已知出现神经发生的脑 区的内源性分子或模拟和/或调节此类内源性分子作用的分子。出现神经发生的区域 包括但不限于齿状回、室下带和嗅球。组成型因子可以包括任何分子类型，治疗 方案或实验条件。在一些实施方式中，组成型因子包括选自下组的一种或多种神经 递质，包括但不限于5-羟色胺、5-羟色胺前体、去甲肾上腺素、多巴胺、AMPA、 GABA、谷氨酸和上述物质的组合。可以成为组成型因子的其它分子包括但不限于 促分裂原例如VEGF和IGF-1，以及离子。在第三方面，提供了鉴定适合移植的神经干细胞的方法，其中所述方法包括将 神经干细胞群体与神经细胞源分离；使神经干细胞接触受试物；和测定所述受试物 对神经发生的作用，其中显著作用表示来源于检测细胞群体的神经干细胞适合或不 适合移植。在各种实施方式中，使神经干细胞接触受试物对朝向神经元和/或神经胶 质细胞谱系进行分化的神经干细胞的比例；神经干细胞中有丝分裂细胞的比例；和/ 或检测群体中的神经干细胞数量具有显著影响。就已鉴定的适合移植的细胞而言， 可以将来自所述神经细胞来源的其它细胞移植到对象。然后可使所述移植细胞进行 体内神经发生，或者任选地通过施用一种或多种技术人员已知的或由本文公开的方 法所鉴定的神经发生剂或条件诱导它们进行神经发生。在另外的实施方式中，例如出于治疗和/或实验目的，用这些方法来鉴定或产生 适于体内移植的神经干细胞群体和/或来源。在各种实施方式中，此类方法包括以下 步骤将神经干细胞群体与神经细胞来源例如特定组织、宿主或细胞系分离；使神 经干细胞接触受试物；和测定表征细胞适合移植的一种或多种细胞特性。在各种实 施方式中，表征适合移植的特性包括但不限于表达表征神经发生程度和/或性质的 一种或多种基因，对受试物或受试条件有反应或无反应，在受试物或受试条件存在 时的存活率，和分化成特定细胞谱系的倾向。所述方法还可以包括产生已经用所述 方法之一鉴定的神经干细胞，将那些干细胞移植进动物，例如作为非限制性例子的 脊椎动物。另外的例子包括哺乳动物，例如人。还公开了制备用于移植的细胞的方法。作为非限制性例子，就据观察能够发生 神经的神经细胞而言，可以诱导来自神经细胞来源的其它细胞使其进行离体神经发 生，接着移植到对象。在一些实施方式中，可以仅诱导所述神经细胞，而在其它实 施方式中，在移植前可以先使所述神经细胞进行神经发生。当然还可以移植已经诱 导但还没有实现完全神经发生的细胞。可以通过接触或暴露于一种或多种技术人员 已知的或通过本文公开的方法鉴定的神经发生剂或条件而诱导离体神经发生。在第四方面，提供了对现有方法产生改进的方法。例如，现有方法所达到的程 度包括提供包含神经干细胞的细胞群；使所述细胞群与检测化合物接触；和测定表征神经发生的至少一种细胞特征，本文所述的方法可以通过使细胞群除了与受试物 之外，还与神经递质例如生物胺接触来对现有方法进行改进。在第五方面，提供了试验检测化合物潜在的神经发生作用的方法，其中所述方法包括提供包括神经干细胞的体外细胞群，其中使所述细胞接触生长培养基；在生 长培养基中提供神经递质；使细胞群接触检测化合物；和测定检测化合物对神经干细胞神经发生程度和/或性质的作用。在各种实施方式中，所述神经递质是生物胺或单胺，例如多巴胺、5-羟色胺或去甲肾上腺素，或调节一种或多种生物胺水平或活性的化合物，例如单胺重摄取抑制剂、单胺受体调节剂、或单胺氧化酶抑制剂。在任 选实施方式中，可以釆用非生物胺神经递质。在第六方面，提供了鉴定检测群体细胞表达的一种或多种基因("神经发生标记") 的方法，其中所述基因的表达表示受试物或受试条件调节神经发生。 一些实施方式 中，检测神经发生标记的方法包括使包括神经干细胞的细胞群接触受试物或受试条件；测定表征神经发生程度和/或性质的至少一种细胞特征；测定检测群体细胞表达的至少一种基因；和使基因表达与测定的表征神经发生的检测细胞特性相关联。 在第七方面，提供了检测神经保护剂的方法，其中所述方法包括使神经干细胞群接触抑制神经发生的物质或条件；使神经干细胞接触受试物；和测定受试物缓解 神经发生抑制的能力。 一些实施方式中，所述接触抑制神经发生的物质或条件可以 模拟体内条件，例如发生疾病的体内条件(需要以神经发生增加作为治疗干预手段)。因此这类接触的非限制性例子包括存在一种或多种阿片样物质或炎性细胞因子。另 外的例子包括能够抑制神经发生的细胞剂或因子，例如活性星形细胞释放的血管紧 张素或血管紧张素前体。另外，可以将接触辐射或一种或多种毒剂，例如磷酸二酯 酶(PDE)抑制剂(如PDE2 BAY-60-7550)当作神经发生的抑制剂。这些方法的实施方式 包括鉴定在接触抗神经发生剂或条件之后，拯救或恢复神经发生的物质或条件或其组合的方式。本发明的第八方面包括评估患者对神经发生调节剂的治疗是否有反应的方法， 其中所述方法包括获取需要治疗的患者的细胞样品，其中所述样品包括神经干细胞； 使所述样品接触神经发生调节剂；和测定神经发生标记基因的表达，其中所述标记 基因的表达或非表达预示患者是否会对神经发生调节剂的治疗有反应。本发明的实施方式包括以时间为轴测定受试物和受试条件对神经干细胞的一种 或多种特性的作用的自动化高通量方法。有利地，本文所述的方法相比已知方法提 供了更强的检测某种神经调节剂作用的能力。在以下附图及其描述中提出了另外实施方式的细节。所述实施方式的其它特征、 目的和优点可以从附图和详细描述、以及权利要求书中明显看出。附图简要说明

图1A显示了测定一种或多种受试物对NSC在培养物中增殖的作用的典型实验 所采用的96孔板的分配情况。图1B显示了在对照条件下进行试验时不会产生毒性或增殖的化合物(纳屈酮)的 典型剂量-反应曲线。因此横跨一定浓度范围的所述化合物对细胞既没有毒性也没有 营养性。图2A是显示各种浓度的多巴胺(正方形)对培养的人神经干细胞(hNSC)沿神经 元细胞谱系分化的影响的剂量-反应曲线。已减去背景培养基值，并根据神经元阳性 对照对数据进行了标准化。浓度为lpM或更高时多巴胺对神经元的分化呈现出较小 的作用。图2B是显示在存在和不存在组成型因子时，各种浓度的受试物(安非他明)对培 养的人神经干细胞沿神经元细胞谱系分化的影响的剂量-反应曲线。已减去背景培养 基值，并根据神经元阳性对照对数据进行了标准化。在检测浓度范围内(直到100nM) 安非他明本身(正方形)对神经元分化没有显著影响，然而，安非他明和作为"组成型 因子"的1(HiM多巴胺联用(圆形)则显著增强神经元分化(EC50约30^iM)。图2C是显示在存在和不存在组成型因子时，各种浓度的受试物(哌醋甲酯)对培 养的人神经干细胞沿神经元细胞谱系分化的影响的剂量-反应曲线。已减去背景培养 基值，并根据神经元阳性对照对数据进行了标准化。浓度高于约lnM的哌醋甲酯本 身(正方形)对神经元分化只有轻微影响，然而，整个检测的哌醋甲酯浓度范围内(约 3nM-10nM)，哌醋甲酯和作为"组成型因子"的10pM多巴胺的联用(圆形)则显著增 强神经元分化程度。图3A是显示各种浓度的神经递质去甲肾上腺素对培养的人神经干细胞沿神经 元细胞谱系分化的影响的剂量-反应曲线。已减去背景培养基值，并根据神经元阳性 对照对数据进行了标准化。显示两类独立实验，实验#1(正方形)和实验#2(圆形)的数 据。微摩尔浓度的去甲肾上腺素显著增强神经元分化，平均EQo约为4nM。图3B是显示各种浓度的神经递质去甲肾上腺素对培养的人神经干细胞沿神经 元细胞谱系分化的影响的剂量-反应曲线。已减去背景培养基值，并根据神经元阳性 对照对数据进行了标准化。显示两类独立实验，实验#1(正方形)和实验#2(圆形)的数 据。在检测的浓度范围内(约0.01nM-l(HiM)，去甲肾上腺素对星形细胞分化没有影响。图4A是显示各种浓度的5-羟色胺前体5-羟基L色氨酸(5-HTP)(圆形)对培养的 人神经干细胞沿神经元细胞谱系分化的影响的剂量-反应曲线。已减去背景培养基值， 并根据神经元阳性对照对数据进行了标准化。在浓度约为4pM或更高时，5-HTP显 著增强了神经元分化，而在较低浓度时则没有显著影响。图4B是显示在存在和不存在组成型因子时，各种浓度的受试物(神经递质多巴 胺)对培养的人神经干细胞沿神经元细胞谱系分化的影响的剂量-反应曲线。已减去背 景培养基值，并根据神经元阳性对照对数据进行了标准化。在检测浓度范围内(约 O.OlnM-lOpM)，多巴胺本身(正方形)对神经元分化仅有轻微影响，然而，多巴胺和 作为"组成型因子"的10pM(圆形)或3(HiM(三角形)5-HTP组合则显著增强神经元分 化，EC5。值为约3nM-10|aM。图5是显示在存在和不存在第二因子时，各种浓度的AMPA对培养的人神经干 细胞沿神经元细胞谱系分化的影响的剂量-反应曲线。已减去背景培养基值，并根据 神经元阳性对照对数据进行了标准化。在最高检测浓度时(约3(HiM)， AMPA本身(正 方形)对神经元分化仅有轻微影响，然而，整个检测的AMPA浓度范围内(约 3nM-10^iM)， AMPA和lOpM益智药化合物M6或环(脯氨酸-甘氨酸)(圆形)联用则显 著增强神经元分化水平。图6显示他克林能促进神经球内的NSC生长。图7显示DHEA能促进在96孔板内培养为单层的人NSC的分化。图8显示组胺能促进在96孔板内培养为单层的人NSC细胞增殖。因此，组胺 是一种营养化合物。图9显示PDE2抑制剂BAY-60-7550对在96孔板内培养成单层的人NSC诱导 毒性。因此，该抑制剂是毒性化合物。图10显示纳屈酮能拯救阿片样物质诱导的NSC神经元分化抑制(实心圆形表示作为阳性对照的用DHEA处理细胞的数据；实心三角形表示用纳屈酮和吗啡处理细 胞的数据；空心三角形表示仅用吗啡处理细胞的数据)。存在纳屈酮和吗啡能使细胞 分化恢复到接近阳性对照的水平。图11显示丁螺环酮和褪黑激素联用引起神经元分化(上图)，而抑制分化成星形 细胞ff图)。说明书中采用的某些术语的定义本文中将"神经发生"定义为神经细胞体内或体外的增殖(细胞生长)、分化、迁 移和/或存活。本发明的实施方式包括检测或测定作为神经发生的非限制性指标的增 殖或分化或存活。神经发生应涵盖发生在在正常发育过程中的神经发生，和在疾病、 损伤或治疗性介入之后发生的神经再生。神经发生与"星形细胞发生"截然不同，后者指星形细胞状细胞在体内或体外 的增殖、分化、迁移和/或存活。星形细胞状细胞的非限制性例子包括星形细胞、活 性小神经胶质细胞、星形细胞前体细胞和增强细胞(potentiatedcell)、以及星形细胞祖 细胞或衍生细胞。星形细胞可以是成年人、胎儿或胚胎的星形细胞，可以位于动物 或人类的中枢神经系统或其它部位，包括组织例如神经组织。星形细胞发生包括在 正常发育过程中发生的星形细胞的增殖和/或分化，和在疾病、损伤或治疗性介入例 如通过用高剂量星形细胞发生剂像本文所述丁螺环酮治疗之后的星形细胞发生。神经发生任选包括少突胶质细胞的发生，指少突胶质细胞状细胞体内或体外的 增殖、分化、迁移和/或存活。少突胶质细胞状细胞的非限制性例子包括少突胶质细 胞、少突胶质细胞前体细胞和增强细胞、和少突胶质细胞祖细胞和衍生细胞。少突 胶质细胞可以是成年人、胎儿或胚胎的少突胶质细胞，可以位于动物或人类的中枢 神经系统或其它部位，包括组织例如神经组织。少突胶质细胞发生包括在正常发育 过程中发生的少突胶质细胞的增殖和/或分化，和在疾病、损伤或治疗性介入之后发 生的少突胶质细胞保护或发生。本文所述细胞的增殖或生长是指一个或多个细胞的群体通过有丝分裂复制和增 加其个数的能力。可以通过计算细胞个数或例如在细胞球尺寸增加的情况下通过计 算全部细胞物质的增加来测定。减少或抑制细胞生长的物质、化合物或条件是本文 所用的"有毒"的意思。毒性形式包括例如通过细胞生长抑制作用来抑制有丝分裂， 和例如通过细胞毒性作用来使细胞死亡。增加细胞生长的物质、化合物或条件可以 称为"营养"齐l」。基于检测或测定细胞生长降低或抑制的方法可以称为"毒性试验"， 而基于检测或测定细胞生长增加的方法可以称为"向性"或"增殖"或"生长"试验。术语"神经细胞"包括神经干细胞(NSC)、神经祖细胞和这类干细胞和祖细胞的 后代，包括源自它们的分化细胞。 一实施方式中，所述神经细胞是成年人、胎儿或 胚胎的神经干细胞或细胞群。 一些实施方式中，所述神经细胞是成年人、胎儿或胚 胎的祖细胞或细胞群，或含有干细胞和祖细胞混合物的细胞群。神经细胞包括所有 脑部干细胞、所有脑部祖细胞和所有脑部前体细胞。将"神经发生调节剂"定义为相对于没有该物质或试剂时神经发生的程度或性 质，能够促进、抑制或者在其它方面调节体内或体外神经发生的程度或性质的物质 或试剂。神经发生的调节指增加或减少能够神经发生的细胞或细胞群的神经发生。调节 的非限制性例子包括直接增加或减少例如神经细胞群的神经发生，或增加或减少神 经发生的抑制剂。后者的有代表性的非限制性例子是减少星形细胞或星形细胞发生。本文采用的术语"干细胞"(例如神经干细胞(NSC))指能够自我更新和分化成神经元、星形细胞和/或少突胶质细胞的未分化细胞。本文采用的术语"祖细胞"(例如神经祖细胞)指本身不是干细胞的衍生自干细胞 的细胞。 一些祖细胞能够产生能够分化成超过一种细胞类型的后代。本发明实施方式的详述适和用于本文所述的试验方法的神经干细胞和/或祖细胞可以获自哺乳动物，包括人(死后或手术后)和实验动物(例如啮齿动物、非人灵长动物、狗、猫等)。神经干 细胞和/或祖细胞还可以获自其它脊椎动物，包括爬行动物、两栖动物、鱼和鸟或获 自无脊椎动物。人或动物可以是雄性或雌性，可以是胎儿、青年、成年或老年，也 可以是正常或表现出或易于发生神经疾病或失调的对象。因此， 一些实施方式中， 用于本发明方法中的神经细胞分离自施用过一种或多种受试物的试验动物。其它实 施方式中，神经细胞分离自诊断患有神经疾病的对象。 一些方面，所述神经疾病是 一种与神经发生的性质和/或程度的改变有关的疾病，或是一种神经退化疾病。人NSC可以在培养物中长时间扩增来产生稳定的多能NSC细胞系。可以冷冻 保存来自这类细胞系的人NSC，接着重建用于实验。因此， 一些实施方式中，本发 明实施时采用来自已建立细胞系的NSC。人和啮齿动物NSC的分离和纯化如美国专 利第6，767，738、 6,265,175、 6,013,521和5，766，948号所述，均以其全文纳入本文作 参考。可以从任何含有神经干细胞或祖细胞的神经组织中获得NSC。示例性组织包括嗅球(OB)、海马的齿状回(DG)和侧脑室的室下带(SVZ)。从这类组织获取NSC的方 法已为技术人员所知(参见例如，美国专利第5,753,506号；和Gritti等， J. Neurosd. 16:1091-1100(1996))。可以通过将分离自剪碎组织的细胞培养成神经球 (参见例如实施例l)和证明这些细胞具有一种或多种NSC的特征性质来鉴定这些细 胞是NSC。 一些实施方式中，将神经球细胞或神经球内的细胞传代来证明它们能够 形成第二、第三或更多代的祌经球(即自我更新的能力)。另外方面，将神经球细胞或 神经球内的细胞在某种条件下培养使它们分化成神经元、星形细胞和/或少突胶质细 胞。除了原代细胞以外，本公开神经发生试验和方法中还可采用神经干细胞和/或祖 细胞系。非限制性例子包括来自小鼠海马的MHP36细胞(Gray等，Philos. Trans. Royal Soc. Lond. B. Biol. Sci. 354:1407-1421 (1999))、来自大鼠中脑的CSM14.1细胞(Haas 等，J. Anat. 201 :61-69 (2002))和沿神经细胞谱系分化的胚胎干细胞。如本文所述，本发明一方面利用神经球来鉴定和/或表征NSC例如人NSC。这 些方法还可以称为神经球试验或NSA。将啮齿动物和人NSC培养成神经球的方法已 为技术人员所知。典型的方法如实施例l所述。在说明性而非限制性的实施方式中， 将分离的神经细胞在促分裂原，例如表皮生长因子(EGF)和/或碱性成纤维细胞生长因 子(bFGF)存在的条件下培养，以此，使它们分化和形成球形细胞簇，即指神经球。 一些实施方式中，神经球包括处于各种分化阶段的细胞类型，包括NSC、祖细胞和 分化神经元和神经胶质细胞的混合物。因此，各种公开实施方式中，例如通过将组 成细胞解离和在一种或多种促分裂原存在下培养它们而将用于本文提供方法中的神 经球连续传代。有用的促分裂原包括但不限于EGF、 bFGF、 FGF、 VEGF和LIF。可以例如通过切块或用酶例如用胰蛋白酶来物理解离神经球。有利地，由于通 过将解离细胞再接种，己分化和正在分化的细胞会死亡，因而神经球的连续世代(第 二代、第三代等)中所包含NSC的比例增加。在各种实施方式中，用于本发明提供方 法的神经球传代至少2或3次或更多。其它实施方式中，将它们传代至少4或5次， 或更多，例如至少6次或更多次以保证用于本文所述方法中的神经球基本上只含有 多能NSC，而没有具有球形成潜能的祖细胞。实施例2描述了检测受试物对培养的神经球一个或多个方面的作用的自动化高 通量方法。值得注意的是，该技术允许在对照条件下，以时间为轴观察、检测和测 定单个神经球的各方面。例如，在实施例2所述的实施方式中，在非分化条件下观 察位于96孔板各孔内的单个神经球一段时间，以时间为轴通过测定尺寸(例如，以它说明书第13/38页们的直径或其它尺寸表示)来检测神经球的增殖。本发明包括通过利用特定或限制尺寸范围的神经球来测定NSC生长或增殖的方 法，例如通过检测神经球的可视横截面积来确定。
一些实施方式中，所述方法包括利用面积小于约1.4mm2的神经球，例如面积为约0.01-1.4 mm2的神经球。在其它实 施方式中，本方法可以采用面积为约0.01、约0.02、约0.04、约0.05、约0.06、约 0.08、约O.l、约0.2、约0.3、约0.4、约0.5、约0.6、约0.7、约0.8、约0.9、约1.0、 约1.1、约1.2、约1.3或约1.4mi^的神经球。当然本发明实施中可以采用尺寸范围由任何上述值所限定的神经球，例如尺寸为约0.1-0.2mm2、约0.1-0.3mm2、0.1-0.4mm2、约0.1-0.5mm2 、约0.1-0.6mm2、约0.1-0.7mm2、约0.1-0.8mm2、0.1-0.9mm2、约O.l-l.Omm2、约0.2-0.3mm2、约0.2-0.4mm2、约0.2-0.5mm2、0.2-0.6mm2、约0.2-0.7mm2、约0.2-0.8mm2、约0.2-0.9mm2、约0.2-1.0mm2、0.3-0.4mm2、约0.3-0.5mm2、约0.3-0.6mm2、约0.3-0.7mm2、约0.3-0.8mm2、0.3-0.9mm2、约0.3-1.0mm2、约0.4-0.5mm2、约0.4-0.6mm2、约0.4-0.7mm2、0.4-0.8mm2、约0.4-0.9mm2、约0.4-1.0mm2、约0.5-0.6mm2、约0.5-0.7mm2、0.5-0.8mm2、约0.5-0.9mm2、约0.5-1.0mm2、约0.6匿0.7mm2、约0.6-0.8mm2、0.6-0.9mn^和约0.6-1.0 mr^的神经球。将神经球解离或改变尺寸变成这些特定尺寸 或尺寸范围的方法已为技术人员所知和本文所公开。非限制性例子包括利用组织切 块机进行手工分离。可以例如通过将具有上述尺寸范围的一个或多个神经球沉积于多孔板的孔中而 将这类尺寸神经球有利地用于自动化或部分自动化方法。平板的非限制性例子包括 那些具有384或1536个孔的平板。可以通过任何常规方法来沉积神经球，包括利用 条件培养基，使神经球在解离前、解离时在该培养基中生长。当然，可以任选地通 过在分配到各孔后加入新鲜培养基(像作为非限制性例子的维持培养基)来喂养所述 神经球。 一些实施方式中，所述新鲜培养基占孔容积的约50%-75%。然后可以经由 培养基使神经球接触一种或多种受试物(或化合物)和/或一种或多种受试条件。然后随时间测量孔内神经球的尺寸，从而检验受试物或受试条件对神经球有无 作用。 一些实施方式中，以每天、每2天、每3天或以基于7天-约1、约2、约3 或更多周的更低频率来测量面积的增加。当然，神经球尺寸的增加表示其生长，而 尺寸没有增加或减小表示没有生长和/或细胞死亡。 一些实施方式中，对孔的完整内 容物或区域进行测量，从而可以全部看到和测量到其中的一个或多个神经球。这样 可以有利地测量受试物或受试条件对孔内所有神经球的作用。任选地，可以通过在亮视野光线条件下利用低放大倍数以及细胞分析仪和平板 阅读器使捕获视野中完整孔图像的过程自动化。低放大倍数的非限制性例子包括约2x、约3x、约4x或约5x直到10x。所述自动化可以包括例如通过测定所分析每孔中神经球直径来测量神经球尺寸。因此所述公开发明包括鉴定调节神经发生的物质或条件的方法，包括使横截面积小于约0.6mm2,例如至少为约0.2mm、0.6mn^的神经球接触受试物或受试条件； 在测定所述细胞表征神经发生的特性后鉴定所述受试物或受试条件对所述神经球的 调节神经发生的作用。所述调节可以随时间增加、减少或没有改变神经球的尺寸。 因此，所述分离神经球的特性包括所述神经球的一种或多种尺寸。一些实施方式中，可以全部或部分自动化的方式进行神经球尺寸的测量，例如 本文所述利用仪器来目测神经球和/或利用仪器来测量神经球尺寸。其它实施方式中， 所述神经球可以包括人神经干细胞，而还有实施方式中，在接触受试物或受试条件 后的一个或多个，例如两个或更多个时间点进行所述测量。其它实施方式中，可以采用本文所述的方法或技术人员已知的其它技术来测定 增殖。 一些实施方式中，单个神经球分离自神经球群体，用一种或多种受试物或受 试条件处理所述分离的神经球。 一些实施方式中，将"分离的"神经球维持在能够 随时间观察同一神经球的条件下。本文所公开的各种实施方式中，基于神经球的方法能够检测之前无法检测到的 对神经发生的作用，例如时间依赖性作用(例如瞬时改变)或经由多阶段方法发生的作 用(例如，对信号级联反应的应答)。例如， 一些实施方式中，用化合物或治疗方案A 处理神经球，在一段确定的时间中观察，接着用化合物或治疗方案B(或A和B的混 合)处理。另外实施方式中，接着解离神经球中的细胞(通常在测定神经球的一个或多 个方面之后)，测定所述细胞的一种或多种特征。例如，可以解离所述神经球，将其接种成单层培养物(例如，如实施例3所述)， 利用本文所述技术或技术人员己知的其它技术测定它们分化的程度和/或性质。还有 实施方式中，例如采用以下所述的细胞类型特异性标记法或技术人员已知的另一种 技术在非分化条件下确定神经球的细胞类型组成。因此，本发明基于神经球的方法 能够测定治疗方案对各神经球的作用，以及根据这类神经球包含的细胞的一种或多 种特征(例如细胞类型组成、发育命运等)对这些作用进行后续评估。本发明方法相比 现有技术方法有利的是，大大提高了检测神经发生程度和/或性质的变化的灵敏度。 而且，本发明方法提供了用于快速和经济地筛选各种治疗方案对神经发生的作用的自动化高通量方法。本发明的另一方面是通过测定受试物或条件对单层培养物中的NSC的一个或多 个方面的作用来检测调节神经发生的物质和/或条件的方法。在各种实施方式中，与 神经球所含的球形细胞簇相反，细胞排列成单层，相对于多细胞环境中进行的方法 提高了其检测某些神经发生调节剂和/或条件的能力。不受特定理论的局限，认为神 经球细胞通常含有神经干细胞、祖细胞和/或分化细胞的混合物，这种非均一组成使 其难以解释实验结果。例如，在某种条件下，受试物对神经球一种或多种特性的作 用可以被非NSC所介导(例如，由于邻近细胞通过细胞与细胞接触、分泌因子等对NSC起作用)。而且，例如因为在传代时，NSC经历了自发分化和/或不对称细胞分 裂(例如产生一个NSC和一个祖细胞)，因此即使是连续传代的神经球也可以含有相 当比例的非NSC。本文所述的单层方法(例如)通过对受试群体中的神经干细胞的微环 境进行更多控制和/或能够直接观察受试物对NSC的作用而有助于检测某种神经发 生作用。因此， 一些实施方式中，单层方法中所观察到的作用基本上可归因于受试 物或受试条件对NSC的作用，邻近细胞或其它微环境变量基本上没有作用。本公开物的这个方面部分基于稳定培养单层的神经细胞，例如人神经干细胞的 方法。培养人NSC的单层培养物的示例性方法如实施例3所述。 一些实施方式中， 通过酶解离，例如利用ACCUTASEtm的醇活性和用移液管研磨而将NSC与神经球分 离。然后对细胞进行洗涤、计数和将其置于包被有聚赖氨酸和层粘连蛋白的表面上。 在一些实施方式中，聚赖氨酸所含的聚-L-赖氨酸的比例高于聚-D-赖氨酸，优选包含 基本不含聚-D-赖氨酸的聚-L-赖氨酸。其它实施方式中，所述细胞直接分离自神经组 织或衍生自已建立的NSC系。在含有EGF、 bFGF、肝素和白血病抑制因子(LIF)的 培养基中完成人NSC单层培养物的长期培养和传代。为了人NSC的生长和维持，对 实施例3采用的这些生长因子的比例进行优化。用酶例如用ACCUTASETM将细胞与 基层分离，将细胞再次接种到包被有聚L-赖氨酸和层粘连蛋白的表面上，从而实现 细胞传代。重要的是，培养NSC单层的方法使细胞传代从而保留所述干细胞的特性。这样 能使细胞接触确定成分培养基中的特定因子，和在确定的基材上培养，有助于利用 所述细胞来检测或测定神经发生。因此本公开物包括培养NSC的方法，包括在存在 本文所述的因子和培养基时将所述细胞在包被平板上传代成单层培养物。所述培养 的、或传代的细胞可用于本文所述的单层方法和试验中。 一些实施方式中，将所述 细胞用于鉴定调节神经发生的物质或条件的方法中。所述方法可以包括使含有人神经细胞的单层细胞培养物接触受试物或受试条件，在测定了表征所述细胞神经发生 的特性后，将所述受试物或条件鉴定为能调节所述细胞的神经发生的物质或条件。 一些实施方式中，所述神经细胞包括神经干细胞(NSC)。或者，实施本公开方法时可 以采用分离自神经球和转化成单层培养物而非传代成单层培养物的细胞。还有实施方式中，使接种成单层的细胞在贴到固体表面之前接触所述物质或条 件。贴壁后，如本文所述培养细胞。使用物质时，在培养的随后日子里，分析物质 对细胞的作用之前，还可以将另一种物质加入细胞。本发明的非限制性例子包括在7 天，例如约7天或更长时间中进行的方法，其中最后一天测定或检测表征神经发生的特性。更长时间的方法包括约9、约ll、约13、约15、约17、约19，或约21天 或更长时间。使用物质时，可以使细胞在任何随后日子里接触物质，如当所述方法 进行7天时在第1天、第2天、第3天、第4天、第5天或第6天接触物质。当使 用条件时，可以在所述方法的持续期间，使细胞接触和维持在所述条件中。如本文所述，本发明的方法可以包括测定表征神经发生程度和/或性质的一种或 多种神经细胞特性，和将所测定的特性与一个或多个细胞对照组比较。在各种实施 方式中，表征神经发生性质和/或程度的NSC的特征包括测定神经细胞体外和/或体 内的增殖、分化、迁移和/或存活。可以利用本文所述的技术，和/或利用技术人员已 知的其它技术来测定所述NSC和/或祖细胞的增殖、分化、迁移和/或存活。一些实施方式中，表征神经发生的性质和/或程度的所述特征是NSC的增殖能 力。实施例4描述了测定单层培养物中的NSC在各种条件下增殖的自动化高通量方 法的一种实施方式。 一实施方式中，如上所述用ACCUTASETM酶解离神经球，计数 和在包被有聚L-赖氨酸和层粘连蛋白的多孔板上培养成单层。典型实验中，每孔中 接种100|Lil 50,000个细胞。为了测定受试物对细胞增殖能力的影响，加入一种或多种 受试物，在存在促分裂原的情况下培养细胞。实施例4中，在96孔板中以两复孔形 式测试5种受试物，从而获得8-点剂量-反应曲线。使细胞在培养物中维持一段确定 的时间后，对细胞进行固定、染色和用自动化平板阅读器和定制软件进行计数。将 存在受试物时的剂量反应曲线与没有受试物的对照进行比较。对照条件下或该物质 既无毒性也无营养的典型剂量-反应曲线如图1B所示。可以通过细胞掺入311胸苷、溴代脱氧尿苷(BrdU，胸苷类似物)、或另一种增殖 活性指示剂的能力来测定增殖。还可以评估细胞中增殖标记物，例如增殖细胞核抗 原(PCNA)或cdc2的表达。在这些实施方式中，可以利用下述报道物系统来测定基因 表达。表征神经发生性质和/或程度的特征还可以包括NSC分化成神经元、星形细胞、 少突胶质细胞和/或另一种细胞类型例如内皮细胞的能力。实施例5描述了与实施例4的增殖试验类似的测定NSC分化的自动化高通量方法。 一实施方式中，除了在缺 乏EGF和bFGF时培养细胞之外，如增殖试验所述对神经球进行酶解离、计数和接 种成单层培养物。在培养了一段确定时间后，固定和用(例如)特定细胞类型特异性抗 体标记细胞。例如，胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)抗体特异性标记星形细胞，e-微管 蛋白III(TUJ-l)和神经丝抗体例如NF-200特异性标记神经元，01和04抗体特异性 标记少突胶质细胞。本领域技术人员了解对各种细胞谱系具有特异性的标记物，这 些标记物也可购得或通过已知方法产生。除非标记了一抗，不然细胞随后要与标记 的二抗例如酶或荧光标记的抗体接触，以便观察或分选细胞。免疫标记细胞的方法 以及检测和分选免疫标记细胞的方法为技术人员已知。可以通过相对于对照细胞分 化的接种细胞比例或分化成一种或多种特定细胞谱系的细胞比例来确定受试物对单 层培养物细胞的分化的作用。还公开了评估不同物质对NSC分化的作用的高通量高容量试验。所述试验基于 本文所述的稳定单层NSC培养方法的有效性。或者可以将所述试验小型化成分化检 测系统。本文中实施例5包括这类对浓度反应曲线形式进行多次分析的分化检测试 验的一种实施方式。所述试验方法可以包括将固定密度的NSC例如人NSC接种到多 孔板的孔中。本发明的一些实施方式中，具体密度是约60,000、约70,000、约80,000 或约90,000个细胞/cm2。在其它实施方式中，采用的密度为约78,125个细胞/cm2。 用于本方法的多孔板的非限制性例子包括包被有10吗/ml聚-D-赖氨酸和50吗/ml小 鼠层粘连蛋白基层的96、 384和1536孔板。可以在无促分裂原测试培养基中培养细胞或在细胞接种后立即使细胞接触本文 所述受试的分化物质或条件。稳定的分化相容性培养物可用于技术人员已知的自动 化设备，例如能够在接种后3-4天用新制备(新鲜)的培养基替换50%培养基的设备， 所述新制备培养基任选地含有受试的分化物质或化合物。可以影响神经发生的条件 的非限制性例子包括细胞所处环境的氧浓度、pH和二氧化碳浓度。就氧浓度而言， 本文公开的无论是基于单层或神经球的方法在实施时可以采用更好地模拟体内环境 或脑环境例如较低氧压(例如约5-8%)的浓度。可以通过如本文所述和技术人员己知的固定和染色来进行NSC分化结果的测 定。 一些实施方式中，可以利用自动化设备每孔获得多个波长下的多张照片。可以 通过测定Tujl染色数量并用该数量除以通过自动化计数Hoechst染色细胞核确定的细胞个数，从而对神经元分化进行定量。可以通过测定GFAP染色数量并用该数量除以通过自动化计数Hoechst染色细胞核确定的细胞个数，从而对星形细胞分化进行 定量。图4A所示为证明NSC分化成神经元的数量随5-羟色胺(5-HTP)浓度的增加而 增加的浓度反应曲线。还可以用类似的方法釆用其它细胞类型特异性抗体确定某物 质对星形细胞或少突胶质细胞分化的作用。如本文所述，并非所有神经球细胞都是NSC，本发明的单层培养物方法的优点 是能够检测受试物对NSC —个或多个方面的作用(相对于祖细胞和/或分化细胞)。一 些实施方式中，可以例如用NSC和/或其它细胞类型(例如神经元和胶质细胞)特异性 的抗体标记来自神经球的单层培养物，来确定初级单层培养物中NSC和/或分化细胞 的细胞比例。然后在存在一种或多种受试物的实验条件下培养细胞之后可以采用类 似的标记方法。以这种方法，通过培养细胞的一个或多个方面的变化所测定的受试 物的作用可以是由NSC群的变化所引起。例如，可以根据作为最初种入平板的NSC 个数测定培养物产生的NSC个数，从而测定NSC增殖。类似地，可以相对于最初种 入平板的NSC个数来确定分化细胞的个数。或者，可以相对于最初群体中分化细胞 个数来分析实验条件下分化细胞的个数。其它实施方式中，可以通过解离培养神经球和例如通过用NSC特异性抗体结合 荧光活化细胞分选方法(FACS)对NSC进行分选来检测表征神经发生的NSC各方面。 或者，可以利用细胞类型特异性抗体，通过FACS来分选细胞，留下未分化细胞群。 除了基于抗体的方法，还可以通过(例如)携带连接到报道构建物的诱导型启动子的载 体如质粒的转化来标记细胞，如以下更详细的描述。然后可将分选的NSC种板，进 行单层培养，用受试物进行处理(如实施例4和5所述)。有利地，在单层培养物上进 行实验前预先分选NSC可以富集培养物细胞群中的NSC。这种浓縮可以有助于将检 测到细胞特性的变化更精确地归因于NSC神经发生特性的变化，和/或降低培养物中 非NSC影响NSC特性的可能性。一些实施方式中，表征神经发生的性质和/或程度的特征是一种或多种基因的表 达程度或性质。例如， 一些实施方式中，通过用含有(例如)连接到编码报道构建物的 核酸序列的其表达表征神经发生性质和/或程度的基因启动子的一种或多种载体转化 培养NSC来分析基因表达的调节。所述报道构建物可以提供荧光、化学发光、发色 或生物发光信号，例如由绿色荧光蛋白(GFP)、萤光素酶(luc)、黄色荧光蛋白(YFP) 等所提供的那些信号。 一实施方式中，采用能以流式细胞计数仪(FACS分析)或其它 自动化方法检测的化学发光或荧光底物来测定基因表达。其它实施方式中，所述报道构建物提供了可通过例如分光光度法检测的比色信号，如邻硝基苯基-D-吡喃型半 乳糖酐(ONPG)存在时e半乳糖苷酶所提供的信号。
具体实施方式
中，所述报道物系 统能够定量检测基因表达。实施例6和7描述了分别应用于啮齿动物和人培养NSC的基因报道物系统。已经显示当细胞沿神经元或神经胶质细胞谱系分化时，有多基因-特异性启动子在大鼠神经干细胞(rNSC)中特异性活化。这些启动子包括但不限于具有NeuroDl (ND1)、 mGluR2、神经丝重链(Neurofilament heavy, NFH)、 GAP43、胶质原纤维酸 性蛋白(GFAP)、髓磷脂碱性蛋白(MBP)和干蛋白基因特异性的启动子。作为本发明 的一部分，己经确定这些启动子在人神经干细胞(hNSC)中具有类似的预测功能。还可以通过基因编码的一种或多种多肽的产生或分泌来检测基因表达调控。检 测蛋白质产生和/或分泌的方法可以包括生物测定、结合测定、免疫测定等，为技术 人员所熟知。一些实施方式中，表征神经发生程度和/或性质的特征是NSC的膜电位。NSC 和/或祖细胞的膜电位变化是由离子通道即横跨细胞膜的一类整合蛋白所引起的。细 胞膜内有两类离子通道门控和非门控。非门控通道总是打开，不受外在因素显著 影响。它们对维持静息膜电位非常重要。相反，门控通道响应特定的电、机械或化 学信号而打开和关闭。当有净离子流入或流出细胞时，会干扰跨膜电荷分离并因此 影响静息膜电位。电荷分离减少称为去极化，电荷分离增加称为超极化。可以采用 技术人员已知的技术测定培养细胞膜电位的变化。一些实施方式中，表征神经发生程度和/或性质的特征是NSC和/或祖细胞的形 态。可以通过观察和/或测定以下参数来估计细胞形态，这些参数包括但不限于树 突棘的密度、形态和连结性、树状分支、棘回縮、轴突形成和生长的速率和技术人 员已知与NSC或祖细胞的增殖、分化、迁移和/或存活有关的其它参数。例如，认为 海马的神经可塑性是与学习和记忆有关变化的基础，可以通过新突触的产生和已有 突触连结的消失得以表现。中枢神经系统的神经元间突触相互作用的位点是在树突 过程中发现的称为棘的突起。己知树状棘为了响应各种刺激，会发生密度、形态和 连结上的改变，是神经可塑性位点的主要候选者。 一些实施方式中，海马神经元中 棘密度或连接性的改变可能与神经发生的能力以及学习和记忆形成的改变有关。可 以在此过程中，或在约21天或约1个月或更长时间段之后测定或检测这些特征。在本文所述的筛选试验中，检测其调节神经发生能力的候选化合物可以是任何 类型的生物或化学分子，包括但不限于药物、小分子、肽、肽模拟物、核酸、核苷类似物，如叠氮胸苷、双脱氧肌苷、双脱氧胸苷、双脱氧胞苷或阿糖胞苷、糖、 脂质、细胞如干细胞或其任何组合。受试物还可以包括治疗方案，如辐射。如果需 要，具体试验形式中，可以可检测地标记候选化合物或使其连接于固体支持物。一 些实施方式中，所述受试物是有机小分子，例如通过组合化学方法制备的分子。其它实施方式中，所述受试物是分子量低于约10kDa、低于约8kDa、低于约6kDa、低 于约4kDa、低于约2kDa或低于约lkDa的分子。还有实施方式中，所述分子能够或 认为其能够透过血-脑屏障。制备包括简单或复杂的有机分子、含金属化合物、糖、肽、蛋白质、肽模拟物、 糖蛋白、脂蛋白、核酸、抗体等的大化合物文库的方法为技术人员所熟知，如Huse 的美国专利第5,264,563号；Francis等，Curr. Opin. Chem. Biol. 2:422-428(1998); Tietze等，Curr. Biol.， 2:363-371 (1998); Sofia, Mol. Divers. 3:75-94 (1998); Eichler 等，Med. Res. Rev所述。还可购得用于本发明方法中的含有大量天然和合成化合 物的文库。一些实施方式中，本发明的方法在有助于检测化合物或其它治疗方案的神经发 生调节作用的一种或多种因子(下文中称为组成型因子)存在时进行。利用神经递质来 帮助检测受试物对单层培养物中的人NSC增殖的作用参见实施例8和图2-5。组成 型因子可以包括单个组合物或分离的组合物，可以与受试物或受试条件同时或不同 时作用于神经干细胞受试群体。本文提供的方法中对组成型因子的利用不受它们的 顺序或给药方式的限制。可用于本发明的方法中的组成型因子可以包括任何分子或 治疗方案，包括那些加强、拮抗或者调节神经发生的因子。各种实施方式中，组成 型因子在与受试物联用时对神经干细胞受试群体一种或多种特性的作用超过了加成 作用。例如， 一些实施方式中，组成型因子与一种或多种受试物发挥了协同作用。 还有实施方式中，组成型因子加强了受试物的神经发生调节作用，和/或受试物加强 了组成型因子的作用。评估协同作用、加强作用和其它联合药理学作用的方法为技 术人员所知，如Chou和Talalay在Adv Enzyme Regul.， 22:27-55 (1984)中所述。而 本文所述方法中采用的组成型因子与一种或多种受试物联用时的作用超过了加成作 用，实施本公开方法不需要特定的反应类型或水平，只要组成型因子的存在能以某 种方式有助于检测一种或多种神经发生调节剂或神经发生作用即可。一些实施方式中，所述组成型因子包括化合物或其它CNS内源性组分，或刺激 和/或抑制这类化合物的一种或多种生理学作用的分子。有利地，用一种或多种组成 型因子处理NSC，能使NSC更易于发生受试物诱导的神经发生程度和/或性质的变化。 一些实施方式中，在存在组成型因子时培养NSC，可以通过提高本发明方法的 信噪比而有助于检测神经发生调节剂。不受任何具体理论所局限，所述组成型因子 可以通过模拟NSC的体内环境而有助于检测神经发生调节剂。因此， 一些实施方式中，认为所述组成型因子能够刺激体内已知存在NSC和/或神经发生的脑区环境。因此，本发明还包括通过含有内源因子而建立体内脑环境或化学的模型的方法。 而体外模型通常无法完全再现有机体或体内环境，本文公开方法提供的改进包括通 过建立更好的体内环境模型来更好地复制内源性环境。例如，通过往培养环境中加入特定物质来改进所述NSC单层分化试验使其更好地模拟体内脑环境。 一些实施方 式中，加入的物质可以是一种或多种组成型因子。所述因子的非限制性例子包括神 经递质，例如那些(生物)胺和非胺。建立体内环境模型能够鉴定在体外实验中不存在 的特定体内条件下会调节NSC分化的物质。实施例8是本发明方法中示范性地包含 了 5-羟色胺。在一些实施方式中，可用于本文提供方法中的组成型因子包括一种或多种神经 递质，如产生所述方法所用的神经干细胞的物种、CNS区域和/或组织的内源性神经 递质(任选为生物胺)。然而，本文提供的方法并不局限于鉴定因子，还可以包括能改 进内源性环境复制的任何化合物或物质。所述因子不需要全都存在于体内环境中， 而可以是任何的一种或多种化合物或物质。因此本发明包括测定受试化合物的神经发生活性的方法，所述方法包括测定接 触神经递质的神经干细胞的神经发生。在一些实施方式中，所述细胞来自存在含有 神经递质的生长培养基中的含有神经干细胞的体外细胞群。在测定神经发生之前， 使所述细胞接触受试化合物。在具体实施方式
中，所述组成型因子是生物胺，如多巴胺、肾上腺素、去甲肾 上腺素、5-羟色胺、组胺或其代谢产物、前药或类似物。还有实施方式中，所述生物 胺是乙酰胆碱、酪胺、色胺、真蛸胺、(3-苯基乙胺、苯酚胺或多胺，或另一种生物活 性胺。在各种实施方式中，可以将生物胺用作组成型因子来帮助检测任何受试物或 条件。例如，图4A和4B说明了利用生物胺(5-HTP)来帮助检测另一种生物胺(多巴 胺)的神经发生调节作用，后者刺激神经干细胞沿神经元细胞谱系分化。此外，图 2A-2C说明了利用多巴胺作为组成型因子来帮助检测另一种非生物胺化合物，包括 安非他明(图2B)和哌醋甲酯(图2C)的神经发生作用。在各种实施方式中，将除多巴胺以外的生物胺用作组成型因子。例如，在一些 实施方式中，所述组成型因子是5-羟色胺、去甲肾上腺素、组胺、或其代谢产物、前药或类似物。例如，图4八和48说明了利用能在体内快速代谢形成5-羟色胺的5-羟色胺前药5-羟基-色氨酸(5-HTP)作为组成型因子来帮助检测神经递质受试物(多巴 胺)的神经发生调节作用。在其它实施方式中，相对于只用受试物所获得的曲线，存 在组成型因子使受试物的剂量-反应曲线往左偏移。例如，如图4B所示，加入组成 型因子(例如，5-HTP)可以调节受试物的IC5o或EC5o值。有利地，在存在组成型因子 时分析受试物能够检测到在没有组成型因子时检测不到的神经发生调节作用。例如， 不受理论限制，认为许多化合物在较高剂量(例如，在高于约5、 15或30nM)时均出 现干扰和/或抵消本文所述试验中测定的一种或多种特性的毒性作用。因此，图4B 所示的例子是典型的另外实施方式，其中如本文所公开地评估其中两种或多种物质、 两种或多种条件或者物质和条件的组合的作用来鉴定它们的组合作用。这些方法包 括一种物质是本文所述的"组成型因子"，另一种物质或条件分别是"受试物"或"受 试条件"的实施方式。还有实施方式中，将去甲肾上腺素用作组成型因子。去甲肾上腺素对神经干细 胞沿神经元和星形细胞谱系分化的作用如图3A(神经元)和3B(星形细胞)所示。根据 本文公开的这些和其它内容，能进行常规实验的技术人员即可以容易地将去甲肾上 腺素和/或其它生物胺用作本文所述方法的组成型因子。在一些实施方式中，用作组成型因子的生物胺是一种"痕量胺"(TA)、或其代 谢产物、前体、前药或类似物。TA是结构上与典型的生物胺(如多巴胺、5-HT、去 甲肾上腺素)相关的内源性的CNS-活性胺。某些食品，例如巧克力、乳酪和酒也可以 提供重要的饮食来源的TA和/或TA相关的化合物。可以用作组成型因子的哺乳动物 TA的例子包括但不限于色胺、对-酪胺、间-酪胺、真蛸胺、脱氧肾上腺素和P-苯 基乙胺(P-PEA)。其它有用的TA相关化合物包括但不限于5-羟色胺、安非他明、 蟾毒色胺(bufotenin)、 5-甲氧基色胺、二氢甲氧基色胺和苯福林。已经显示TA可以结合和激活许多称为痕量胺相关受体(TAAR)的独特受体，其 包括与典型的生物胺受体有同源性的G蛋白偶联受体家族(TAAR1-TAAR9)。例如， 酪胺和e-PEA均能激活TAAR1。然而，大部分TAAR仍然与特定的配体有关联， 说明存在另外的内源性TA或TA相关配体。此外，结合研究表明在CNS中己知TA 结合非TAAR位点，表明存在其它TA受体和/或通路。因此，各种实施方式中，所 述组成型因子是TAAR配体和/或介导TA的一种或多种生物学作用的物质。一些实施方式中，所述组成型因子是P-PEA，己经表明其对哺乳动物CNS具有 显著的神经调节作用，发现其在海马中水平相对较高(如，Taga等，BiomedChromatogr.， 3(3): 118-20(1989))。根据"PEA假说"，卩-PEA水平降低会引起抑郁， 而P-PEA水平过量会引起狂躁性发作。并非受限于特定理论，认为神经发生受损是 抑郁病因中的主要因素，因此可能需要p-PEA来获得足够的神经发生水平，或者可 能促进或调节神经发生。因此，在各种实施方式中，将P-PEA用作组成型因子来加 强对刺激神经发生的物质和/或可用于治疗抑郁的物质的检测。还有实施方式中，所 述组成型因子是P-PEA的代谢产物、前药、前体或其它类似物，如P-PEA前体L-苯丙氨酸，己经显示除了 (3-PEA外，其前体也可以有效治疗抑郁；P-PEA代谢产物 卩-苯基乙酸((3-PAA)，显示其在锻炼对抑郁症状产生的正面影响中起到了作用；或 p-PEA类似物哌醋甲酯、安非他明和相关化合物，可用来治疗认知障碍，例如ADHD。由于例如通过MAO-A和/或MAO-B进行快速的胞外代谢，其为TA代谢提供 了主要通路，因此大多数TA的半衰期都较短(如短于约30秒)。因此，在一些实施 方式中，通过调节MAO-A和/或MAO-B的活性来调节TA水平。例如，在一些实施 方式中，通过施用MAO-A和/或MAO-B抑制剂来增加内源性TA水平(和增强TA信 号传导)，本文提供了这些例子。还显示TA具有与多巴胺、去甲肾上腺素和5-HT信 号传导途径有关的神经调节作用，例如，通过用生物胺转运蛋白来抑制再摄取。因 此，在一些实施方式中，将TA用作生物胺调节剂，如本文所更全面描述。另外的实施方式中，所述组成型因子是调节生物胺的水平或活性的化合物、物 质或条件("生物胺调节剂")。例如，在一些实施方式中，所述生物胺调节剂是一种 "摄取抑制剂"，其通过抑制一种或多种单胺神经递质运离突触间隙和/或其它胞外区 域来增加它们的胞外水平。术语"摄取抑制剂"包括抑制生物胺转运的化合物(例如， 摄取抑制剂)和/或抑制转运蛋白(例如多巴胺转运蛋白(DAT)、 NE转运蛋白(NET)、 5-HT转运蛋白(SERT)和/或神经元外单胺转运蛋白(EMT))结合单胺底物的化合物(如 摄取阻断剂)和/或介导除去胞外生物胺的其它分子。例如，图2B和2C分别显示了 将安非他明和哌醋甲酯用作组成型因子。己知这些和其它神经兴奋药能够有效抑制 生物胺的转运，从而增加生物胺在突触间隙中的水平，使它们能够在本文提供的各 种试验中促进神经发生的作用。如Koe， J. Pharmacol. Exp. Ther. 199: 649-661 (1976) 中所述，通常根据生物胺摄取抑制剂对特定生物胺的效力对它们进行分类。然而， 提到对一种或多种生物胺有活性的化合物并不是穷举或者涵盖了所有体内调节的单 胺，而只是作为对熟练医师选择用于本文提供的方法的化合物一般指导。在一些实施方式中，所述生物胺调节剂是一种摄取抑制剂，相对于一种或多种 其它生物胺，其可以选择性/优先抑制一种或多种生物胺的摄取。在各种实施方式中，可用于本文提供的组合中的生物胺摄取抑制剂包括(i)选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(SSRI)，例如帕罗西汀(如3,912,743和4,007,196所述)、萘法唑酮(如4,338,317所述)、 氟西汀(如4,314,081和4,194,009所述)、珊特拉林(sertaline)(如4,536,518所述)、依他 普仑(如4,136,193所述)、西酞普兰(如4,136,193所述)、氟伏沙明(如4,085,225所述) 和阿拉丙酯；(ii)5-羟色胺和去甲肾上腺素再摄取抑制剂(SNRI)，如文拉法辛(如 4,761,501所述)、杜罗西汀(如4,956,388所述)、米那普仑(如4,478,836所述)、西布曲 明(BTS 54 524)(如Buckett等，Prog. Neuro-psychopharmacol. Biol. Psychiatry 12: 575-584 (1988)中所述)和它的伯胺代谢产物(BTS 54 505)、阿莫沙平、马普替林，和 三环抗抑郁剂阿米替林、地昔帕明(如3,454,554所述)和米帕明；(iii)去甲肾上腺素再 摄取抑制剂，如他舒普仑、托莫西汀、去甲替林、尼索西汀、瑞波西汀(如4,229,449 所述)和托莫西汀(如4,314,081所述)；(hO去甲肾上腺素和多巴胺再摄取抑制剂，如 丁氨苯丙酮(如3,819,706和3,885,046所述)和(S,S)-羟基丁氨苯丙酮(如6,342,496所 述)；和(v)选择性多巴胺再摄取抑制剂，如美地沙明、阿米庚酸(如3,758,528和 3,821,249所述)、GBR12909、 GBR12783和GBR13069(如Andersen, Eur J Pharmacol, 166:493-504 (1989)中所述)。在一些实施方式中，所述生物胺调节剂是一种生物胺"释放剂"，其例如通过调 节突触前受体(如自身受体、异身受体(heteroreceptor))、调节生物胺的封装(如形成小 泡)和/或释放(如小泡融合和释放)，和/或其它调节生物胺释放的方式来刺激突触前位 点释放生物胺。有利地，生物胺释放剂独立于突触前神经元活性提供了使突触间隙 或其它胞外区内一种或多种生物胺水平增加的方法。可用于本文提供的组合中的生 物胺释放剂包括，例如5-HT-释放剂芬氟拉明和对-氯安非他明(PCA);以及多巴胺、 去甲肾上腺素和释放5-羟色胺的化合物阿米庚酸(如3,758,528和3,821,249所述)。在一些实施方式中，所述生物胺调节剂是一种生物胺"代谢调节剂"，其通过抑 制一种或多种生物胺的代谢来增加其胞外浓度。例如，在一些实施方式中，所述代 谢调节剂是一种酶单胺氧化酶(MAO)的抑制剂，其催化生物胺胞外分解成无活性物 质。可用于本文提供的方法中的MAO抑制剂包括MAO-A同种型抑制剂，其优先使 5-羟色胺(血清素)(5-HT)和去甲肾上腺素(NE)脱氨基，和/或MAO-B同种型抑制剂， 其优先使苯乙胺(PEA)和苄胺脱氨基(MAO-A和MAO-B均代谢多巴胺(DA))。在各种 实施方式中，MAO抑制剂可以是不可逆或可逆的(如，MAO-A的可逆抑制剂(RIMA)) 和可以具有不同的抗MAO-A和/或MAO-B效力(如非选择性双重抑制剂或同种型选 择性抑制剂)。可用于本文所述方法中的MAO抑制剂的例子包括氯吉兰(dorgyline)、L-盐酸司来吉兰(L-deprenyl)、异唑肼(Marplan)、死藤水(ayahuasca)、尼亚拉胺、异丙 异烟肼、异丙氯肼、吗氯贝胺(Aurorix)、苯乙肼(Nardil)、反苯环丙胺(Pamate)(与苯 乙肼同类)、托洛沙酮、左旋盐酸司来吉兰(Selegiline)、哈梅拉(harmala)、 RIMA(如， DaPrada等，J Pharmacol Exp Ther 248: 400-414 (1989)中所述的吗氯贝胺；溴法罗明； 和Curet等，J Affect Disord 51 : 287-303 (1998)中所述的贝氟沙通)、Ann. Neurol.， 40(1) : 99-107 (1996)中所述的拉扎贝胺(Ro 19 6327)和Aubin等， J. Pharmacol. Exp. Ther.， 310: 1171-1182 (2004)中所述的SL25.1131 。在一些实施方式中，所述生物胺调节剂调节生物胺受体，如5-羟色氨受体(如 5-HTV7受体)、多巴胺受体(如Dl-D5受体)和减肾上腺素能受体(如a和P肾上腺素 能受体)的活性。生物胺受体调节剂包括通过任何作用机制作用的化合物。受体调节 剂的例子包括5-HT1A激动剂或部分激动剂，如8-羟基-2-二丙胺基四氢萘 (8-OHDPAT)、 丁螺环酮、吉哌隆、伊沙匹降和氟噁克生；5-HT1A拮抗剂，如WAY 100,635; 5-HT2c激动剂或部分激动剂，如间-氯苯基哌嗪；5-HT2A/2C拮抗剂，如利坦 色林、依托哌酮和萘法哇酮；多巴胺受体激动剂，如7-OH-DPAT和喹吡罗；多巴胺 受体拮抗剂，如氟哌啶醇(hal叩eridole)、 U-99194A和氯扎平；肾上腺素能拮抗剂， 如咪唑克生和氟洛克生；肾上腺素能激动剂，如莫达非尼、沙丁胺醇、克仑特罗、 阿屈非尼和SR58611A(Simiand等，Eur J Pharmacol, 219:193-201 (1992)中所述;和 非典型性抗精神失常药，如氯扎平(Clozaril)、奥兰扎平(Zyprexa)、喹硫平(Seroquel)、 利培酮(Risperdal)、齐拉西酮(Geodon)、阿立哌唑(Abilify)禾卩舍吲哚(Serlect)。另外的 CNS-活性单胺受体调节剂为技术人员已知，并可参见例如《默克(公司)索引(the Merck Index)》，第12版(1996)。可用于本文提供的组合中的其它生物胺调节剂包括三环抗抑郁药，例如阿莫沙 平、氯米帕明(clomiprimine)、度硫平、多塞平、洛非帕明(如4,172,074中所述)、曲 米帕明和普罗替林；四环抗抑郁药，如米氮平(如4,062,848中所述)、米安舍林(如 3,534,041中所述)、马普替林(如3,399,201中所述)和司普替林；非典型性抗精神失常 药，如氯扎平、奥兰扎平、喹硫平、利培酮、齐拉西酮、阿立哌唑和舍吲哚；以及 曲唑酮。还有实施方式中，用于本发明方法中的所述组成型因子包括己知在成人脑中发 生神经发生的海马齿状回(DG)区域中的一种或多种内源性因子。例如，齿状回的主 要神经元是接收内嗅皮质的星形细胞的向心输入的粒细胞，其轴突形成输入到DG 的孔通道。所述DG神经元进而通过称为苔藓纤维的轴突束突出到CA3区。位于孔受体、AMPA受体和其它受体亚型的神经递质谷氨 酸。因此，在一些实施方式中，用于本发明方法中的所述组成型因子包括NMDA受 体调节剂(如W-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)，它是一种特异性激动NMDA受体的非内 源性氨基酸衍生物)或NMDA受体调节剂，如AP5(2-氨基-5膦酰基戊酸)、DTG、 (+)-喷他佐辛、DHEA、 Lu28-179、 BD 1008、 ACEA1021、 GV150526A、舍曲林或氯吉 兰。在一些实施方式中，所述组成型因子可以包括AMPA受体激动剂，如a-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸(AMPA)，或AMPA受体拮抗剂，如7-氨磺酰基苯并-(0-喹喔啉-2,3-二酮(NBQX)。技术人员知道能够激动或拮抗NMDA和/或AMPA受体的 其它因子，这些因子可作为组成型因子。另一个重要的神经发生区是侧脑室的室下带(SVZ)，它被认为是成年哺乳动物脑 中神经发生的最初位点。源于SVZ的神经元干细胞和/或祖细胞沿喙形迁移流(RMS) 迁移到嗅球。 一些神经细胞沿RMS经历了各种神经发生阶段，如迁移、增殖和各种 程度的分化。因此，在一些实施方式中，用于本发明方法中的所述组成型因子包括 SVZ、 RMS和/或嗅球中的一种或多种内源性因子。这些区域存在各种有能力影响神 经发生的分子。例如，，氨基丁酸(GABA)是一种在培养的SVZ/RMS祖细胞中发现 的与各种神经疾病/病症，包括帕金森病和癫痫症有关的抑制性神经递质。在一些实 施方式中，所述组成型因子是GABA或模拟和/或调节GABA的作用的分子，如巴 氯芬或如临时申请第60/731,937号中所述的化合物。还有实施方式中，其它神经递 质、生长因子、激素、或者SVZ、 RMS或嗅球中的其它内源性分子都可用作组成型 因子。组成型因子的其它非限制性例子包括一种或多种生长因子，其包括但不限于 LIF、 EGF、 FGF、 bFGF和VEGF。还有实施方式中，所述组成型因子包括一种或多 种优选以生理相关性浓度存在的离子。例如，钙离子对CNS的信号传导途径有重要 作用，钠离子是维持神经元静息膜电位的重要离子。此外镁和其它离子可以作为辅 因子或调节其它受体亚型的功能。氯离子也介导一些受体，如GABA受体的作用。 在其它实施方式中，所述组成型因子包括模拟离子作用或模拟胞内或胞外离子浓度 变化的分子。在一些实施方式中，所述组成型因子与已知促进或抑制神经发生的生理状态， 如应激、衰老、锻炼和神经疾病/损伤有关。例如，皮质类固醇是肾上腺相应于应激 而释放的激素，显示能影响正在发育和成人的齿状回中的神经发生。因此，在一个 方面，本公开方法的组成型因子可包括皮质类固醇，如皮质酮或氢化可的松。另外的实施方式包括建立如下所述体内疾病状态的模型。还有实施方式中，所述组成型因子可以是可能存在于体内的外源性提供的因子。非限制性例子包括亲代谢性谷氨酸(mGlu)受体调节剂，如Barlow于2005年12月14 日提交的名称为"Methods of Treating Conditions of the Central and Peripheral Nervous Systems by Modulating Neurogenesis(通过调节神经发生来治疗中枢和周围神经系统 病症的方法)"的美国临时申请中所提供的化合物；蕈毒碱剂，如沙可美林或如临时 申请第60〃27,127号中所述的化合物；组蛋白脱乙酰酶调节剂，如丙戊酸、MS-275、 阿片西啶(apicidin)，或如临时申请第60/715,219号中所述的化合物；(J受体调节剂， 如DTG、喷他佐辛、SPD-473或如临时申请第60/719,282号中所述的化合物；GSK3-0调节剂，如TDZD-8或如临时申请第60/721,303号中所述的化合物；甾类拮抗剂 或部分激动剂，如他莫昔芬，曾色满(cenchroman)、舒经酚、屈洛昔芬或雷洛昔芬； 或磷酸二酯酶抑制剂，如异丁司特或如临时申请第60/729,966号中所述的化合物。 本发明方法中的组成型因子也可以包括模拟和/或调节一种或多种神经调节剂、神经 递质或生长因子的生理作用的分子。在一些实施方式中，所述外源性提供的组成型因子是益智药类化合物。例如， 图5显示了利用合成的益智药类化合物(M6或环-(脯氨酸-甘氨酸))来帮助检测CNS 受体配体a -氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸(AMPA)对神经干细胞沿神经元细胞谱 系分化的调节作用。技术人员还知道其它的益智药类化合物，包括但不限于吡拉 西坦、左乙拉西坦(leviteracetam)、奈非西坦，茴拉西坦、奥拉西坦、皮拉米拉西坦 (pyramiracetam)、吡硫醇、麦角生物碱、加兰他敏、司来吉兰、甲氯芬酯、去氨加压 素、长春西汀、普卡霉素、米拉醋胺和麦角溴烟酯。其它实施方式的示例如图5所 示，其中如本文所述对两种或多种物质的作用进行分析来鉴定它们的联合作用。图5 中，可以认为AMPA是一种如本文所述的"组成型因子"，而益智药类化合物是一种 能够加强AMPA活性的"受试物"。或者，以本文公开的同样有效的方式，可以认为 AMPA是"受试物"而益智药类化合物是由AMPA所加强的"组成型因子"。因此， 实施方式包括检测或鉴定与单独施用第一种、第二种或其它物质相比与第一种物质 或条件联用能够增强、加强、促进或支持神经发生的第二种或其它物质的方法。还有实施方式中，所述外源性提供的组成型因子是非甾类消炎药(NSAID)，如塞 来考昔、罗非考昔、美洛昔康、吡罗昔康、戊地昔布、帕瑞考昔、艾托考昔、依托 度酸、尼美舒利、阿西美辛、丁苯羟酸、二氟尼柳、乙水杨胺、依托芬那酯、氟洛 布芬(flobufen)、伊索昔康，凯布宗、氯那唑酸、甲氯芬那酸、安乃近、莫非布宗、尼氟酸、羟布宗、对乙酰氨基酚、非那西丁(phenidine)、丙帕他莫、异丙安替比林、 水杨酰胺、替诺昔康、噻洛芬酸、奥沙普秦、氯诺昔康、萘丁美酮、阿斯匹林、米 诺环素、贝诺酯、阿洛普令、双水杨酯、布洛芬、萘普生、氟比洛芬、酮洛芬、非 诺洛芬、芬布芬、苯噁丙酸、舒洛芬、吡罗昔康、美洛昔康、双氯芬酸、酮咯酸、 芬氯酸、吲哚美辛、舒林酸、托美丁、羟布宗、保泰松、非普拉宗、阿扎丙宗、氟 芬那酸或甲芬那酸。在一些实施方式中，所述外源性提供的组成型因子是一种阿片类受体拮抗剂 (如，p、 5禾t]/或k拮抗剂)，如爱维莫潘(alvimopan)、赛普罗町(cyprodime)(如WO 93/02707中所述)、纳屈酮(如3,332,950中所述)、纳洛酮(如3,254,088中所述)、纳美 芬(如3,814,768和3,896,226中所述)、纳屈吲哚(NTI)(如4,816,586中所述)、纳洛芬(如 2,364,833禾B 2,891,954中所述)、纳屈本(naltriben)(NTB)(如4,816,586中所述)、 DPI-2505 (如5,658,908中所述)、甲碘化物(methiodide)、纳洛肼、萘啶(nalide)，戊烯 二氢吗啡酮、二烟酸烯丙吗啡、异硫氰酸纳屈吲哚、去甲-宾那托芬 (nor-binaltorphimine， nor-BNI)、 b-芬那太明(b-funaltrexamine， b-FNA)、环佐辛、甲 碘化物、BNTX、ICI-174,864、LY117413、MR2266或如4,816,586、4，891,379、4,191,771 、 6,313,312、 6,503,905或6,444,679中所述的化合物。另外的实施方式中，采用本发明的方法来测定一种或多种受试物抵抗已知能抑 制神经发生的物质或刺激物的保护性功能的能力。因此，在一些实施方式中，所述 组成型因子包括但不限于辐射、化疗药物和滥用药物，将本发明方法用来检测一 种或多种受试物或治疗方案来使NSC能够抵抗组成型因子的神经发生抑制作用的能 力。因此，本发明包括检测抑制或减少神经发生的毒性的降低的方法。所述方法可 以包括使人神经细胞的第一单层细胞培养物与抑制神经发生的物质或条件接触，使 人神经细胞的第二单层细胞培养物与某种物质或条件接触，所述物质或条件能抑制 神经发生；测定与所述第一单层相比，所述第二单层中对抗神经发生的毒性的降低。 另外的实施方式中，所述方法还可以包括鉴定能够用作神经保护剂或条件来降低对 抗神经发生的毒性的物质或条件。在一些实施方式中，所述方法可以是根据物质如 炎性细胞因子和星形细胞的给药毒性，检测或鉴定神经保护剂或条件。还有另外的实施方式中，还公开了检测"毒性"物质或"毒性"的方法。这些 方法检测或鉴定通过对能够神经发生的细胞产生毒性来抑制或减少神经发生的物质 或条件。毒性试验方法包括在不含促分裂原时使NSC接触受试物或受试条件来鉴定 所述物质或条件对细胞是有营养的还是有毒的。或者，由一个或多个神经球分离NSC，接着在不含有促分裂原的平板上培养。或者，NSC是已经除去促分裂原的培养基中传代的单层细胞。实施例9描述了如何鉴定示例性毒剂如BAY-60-7550。本发明还包括基于通过利用能够复制所述条件的物质或条件来建立体内疾病或 病症的模型的方法。这些体外方法能够鉴定可用于治疗疾病的物质。作为非限制性 例子，阿片类物质引发的抑郁是一种可以由慢性接触阿片类物质而引起的疾病。本 文公开了一种利用NSC如人NSC的单层培养物的分化来建立这种疾病的模型的方 法，其基于使所述细胞接触阿片类物质来建立所述疾病的模型。然后可以利用本文 公开的试验方法来检测缓解或逆转该疾病的物质或条件。在一些实施方式中，通过纳入能够产生体内炎症反应的炎性细胞因子、细菌毒 素或其它物质来建立所述疾病或病症的模型。另外的例子包括活性星形细胞释放的 成分，如血管紧张素或血管紧张素前体。可以将存在一种或多种此类物质的方法用 作筛选工具来鉴定或检测能够逆转或减轻所述物质对神经发生的负作用的化合物或 条件。另一疾病模型体现在检测或测定产生星形细胞或星形细胞发生。已知星形细胞 对神经元有毒性，星形细胞增殖和/或浸润进脑损伤区域会引发许多疾病和病症。非 限制性例子包括中风和其它形式的脑损伤。因此，本发明的另外实施方式包括检测 或鉴定抑制NSC分化成星形细胞的物质和/或条件的方法，和检测或鉴定会增加向星 形细胞分化的物质和/或条件的类似方法。实施例10描述了建立体内疾病模型的示例 性方法。在各种实施方式中，本发明方法包括与对照比较，如以下实施例所述。例如， 一些实施方式包括将受试物处理的NSC的特征与对照NSC，例如与受试细胞同时培 养但未给予受试物的NSC的相同特征进行比较的步骤。然而，本发明方法中，与对 照进行比较不是必须的。例如，在一些实施方式中，之前在特定条件下表征了 NSC 行为或特征，这使得不一定需要与对照进行比较。当使用对照时，可以采用能够帮 助检测神经发生调节作用或其它作用或感兴趣的结果的任何类型的对照。例如，在 一些实施方式中，对照是除了未接触候选化合物外，与受试制品作相同处理的制剂 或有机体。另一种类型的对照是除了经过改良而对受试化合物的神经发生调节作用无反应以外与受试制剂类似的制剂，如不表达被受试化合物激动或拮抗的受体的细 胞。后一种情况下，在基本上相同的条件下，将受试制剂对受试化合物的应答与对 照制品对相同化合物的应答(或没有应答)作比较。在一些实施方式中，与没有所述化合物或治疗方案的对照化合物或对照条件相的化合物或其它治疗方案通常促使神经发生提高至少约5%、或至少约10%、约25%、约50%、约100%、约500%或更高，或者使神经发生降低至少 约5%、或约10%、约25%、约50%、约90%或更高，本发明的方法不限于检测这类 变化，还可检测神经发生的性质、程度或其它方面的任何变化。例如，在一些实施 方式中，将本发明的方法用于检测受试物保护NSC不受另一种物质作用的能力。本发明的另外方面包括出于实验、治疗或其它目的鉴定用于体内移植的含有 NSC和/或祖细胞的细胞群方法。在一些实施方式中，将本发明方法用于检测例如来 自特定组织、宿主(如来自诊断患有神经病的宿主)、物种、细胞系或其它来源的具有 移植所需的一种或多种特征的特定细胞群。移植所需的特征可以包括，例如，受试 物或治疗方案调节细胞增殖、分化、迁移、存活和/或活力的能力，和细胞抵抗受试 物或治疗方案对细胞增殖、分化、迁移、存活和/或活力的作用的能力。将一些公开 方法用来鉴定存在一种或多种组成型因子时，能够响应或抵抗受试物或其它治疗方 案的细胞群。在一些实施方式中，公开了鉴定适合移植的神经干细胞的方法。所述方法可以 包括使神经干细胞亚群与神经干细胞群分离；使神经亚群接触能够增加神经发生的 物质或条件；和检测所述亚群中神经发生的增加，其中神经发生增加表明所述神经 干细胞群适于移植。亚群中沿神经元细胞谱系或胶质细胞谱系分化的神经干细胞的 比例增加可以表示神经发生增加。或者，有丝分裂细胞的比例增加或神经干细胞的 数量增加都表示神经发生增加。还有实施方式中，鉴定适于移植的神经干细胞的方法可以包括使神经干细胞亚 群与神经干细胞群分离；使神经亚群接触能够增加神经发生的物质或条件；和检测 所述亚群中表示存在神经发生的一种或多种基因的表达，其中所述表达表示来自所 述细胞群的神经干细胞适于移植。在一些实施方式中，采用体内方法来确认和/或说明利用上述细胞培养技术检测 到的受试物的神经发生调节作用。有利地，体内方法能够检测化合物对正常对象和 有神经损伤和疾病的对象的神经发生的作用。可以采用人对象或实验动物模型。例 如，技术人员知道由于中风或神经损伤引起的实验动物外伤模型。还可以利用测定 受试物调节神经发生能力的体内试验来提供人类治疗用途制剂中感兴趣化合物的安 全性、毒性、药代动力学和疗效的证据。这类体内技术之一包括用发现能够调节神经发生的一种或多种物质处理培养的 NSC和将所述NSC给予试验动物。 一些实施方式中，例如用报道构建物转化细胞来对这类细胞进行标记，并观察这种细胞在试验动物中的迁移、存活、分化或其它特 征。由于神经发生参与学习和记忆，还可以通过将受试物给予对象和观察对象完成 一个或多个与认知功能有关的任务的能力来进一步研究受试物对神经发生的调节作 用。技术人员知道测定啮齿动物或其它哺乳动物的认知功能的方法。在一些实施方 式中，采用本发明方法体外检测受试物对神经发生的调节作用，和采用体内方法来 确定所述物质的潜在治疗用途，例如作为抗抑郁药、抗焦虑药或认知增强剂。技术人员知道各种递送方法，可以利用这些方法将受试物递送到感兴趣组织中 的NSC或祖细胞。所述递送方法取决于各种因素，如感兴趣的组织、所述化合物的 性质(即稳定性和血脑屏障渗透力)和实验持续时间。例如，可以将微型渗透泵植入神 经发生区，如侧脑室。或者，通过直接注射进脑或脊柱的脑脊液中，或注射进眼内 给予化合物。还可以将化合物给予外周区域(如静脉内或皮下注射或口服给药)，然后 透过脑血屏障。采用本发明方法发现能够调节神经发生的化合物可直接用作治疗剂来预防或治 疗各种神经系统疾病，此时它能够有效地促进、抑制或调节神经发生。还可以利用 本发明方法所鉴定的化合物来促进、抑制或调节离体神经发生，从而接着可以将含 有神经干细胞、神经祖细胞和/或分化的神经细胞的细胞组合物施用到个体来预防或 治疗同样的适应症。还可以釆用本发明方法来鉴定会对神经发生产生不良作用的物 质和/或条件，从而例如患有神经发生减小相关性神经疾病的患者可以避免使用这类 物质和/或条件。可以用本发明方法发现能够调节神经发生的化合物来治疗的神经系统疾病包括但不限于神经变性疾病，如帕金森病、阿耳茨海默病、亨廷顿舞蹈病、Lou Gehrig病、多发性硬化、老年痴呆、皮克病、帕金森痴呆综合征、进行性皮质下胶质增生、 进行性核上性麻痹、丘脑退化综合征和遗传性失语。还包括神经干细胞症、神经祖 细胞症、局部缺血症、神经外伤和损伤、情感失常、神经心理病、视网膜退行性病、 视网膜损伤和外伤、学习和记忆病、精神分裂症和其它精神病、无脑回畸形综合征、 抑郁症、双极抑郁症、双极病、焦虑综合征、焦虑病、恐怖症、压力和相关综合征、 认知功能病、攻击、药物和酒精成瘾、强迫行为综合征、季节性心境障碍、边缘型 人格障碍和大脑性瘫痪。其它方面，可以用本发明方法检测的化合物来治疗的神经系统疾病包括但不限于痴呆、癲痫症、损伤相关癫痫症、颞叶癫痫症、脊髓损伤、脑损伤、脑手术、外伤相关脑损伤、外伤相关脊髓损伤、癌症治疗相关脑损伤、癌症治疗相关脊髓损伤、感染相关脑损伤、炎症相关脑损伤、感染相关脊髓损伤、炎 症相关脊髓损伤、环境毒素相关脑损伤、环境毒素相关脊髓损伤、孤独症、注意力 缺陷症、发作性睡病、睡眠病和认知病。还可以将本发明方法鉴定的化合物用于正 常个体来增强学习和/或记忆，或治疗学习和/或记忆有缺陷的个体，和治疗各种周围 神经系统(PNS)疾病，包括但不限于PNS神经病(如血管型神经病、糖尿病型神经 病、淀粉样神经病等)、神经痛、瘤、髓磷脂相关病等。技术人员知道可以用调节神经发生的化合物有效治疗的其它病症(参见例如，美国公开申请第20020106731号)。实施例给出以下实施例来说明而非限制本发明的权利要求范围。实施例l:由原代组织建立神经球培养物将感兴趣的对象(如人胚胎)组织切块并置于含有含0.6%葡萄糖的冰冷PBS溶液 (西格玛公司(Sigma)P4417)的皮氏培养皿中。将切碎的小块置于无菌eppendorf管内， 用0.1。/。的胰蛋白酶溶液(沃辛顿生物化学公司(Worthington Biochem) LS003707)37"C 处理10-20分钟。然后除去胰蛋白酶，接着用0.1%的胰蛋白酶抑制剂(西格玛公司 T6522)37'C培养10分钟。除去胰蛋白酶抑制剂后，用DNA酶(西格玛公司D4527) 在37'C处理样品10分钟，接着除去DNA酶，用传代培养基(30。/oHamsF12(集博克 公司(Gibco) 11765-062)、 70% DMEM (集博克公司11965-118)、 1% PSA (集博克-BRL 公司(Gibco-BRL) 15420-062)、 2% B27 (集博克-BRL公司17504-044)、 20ng/ml EGF 和FGF-2+肝素(5微克/毫升)或者10ng/ml LIF(肯强公司(Chemicon) LIF1010))进行培 养。然后先用大口径移液枪头(如P1000)再用较小口径的移液枪头(如P200)吹打组织， 枪头各吹打约20次，从而获得单细胞悬液。用血细胞计数器进行细胞计数和用台盼 蓝(西格玛公司)评估活力。将细胞悬液接种到T25或T75烧瓶中使密度达到200K个 细胞/毫升。每3或4天为烧瓶除去一半培养基，换上新鲜培养基，注意不要破坏细 胞球。使细胞球在最初生长阶段均处于传代培养基中。用组织切片机(麦奇文公司 (Mcllwain))机械切割细胞球进行传代。约4周后，将人神经球转移到维持培养基 (30%Hams F12(集博克公司11765-062)、 70% DMEM (集博克公司11965-118)、 1% PSA (集博克-BRL公司15420-062)、 1% N2 (集博克-BRL公司17502-048)， 20ng/ml EGF(西格玛公司E9644))中。第15-20周，使人培养物在添加有10ng/mlLIF(肯强公 司LIF1010)的维持培养基中生长。啮齿动物细胞球仍留在传代培养基中进行长期培 养。36实施例2:测定含有单个神经细胞球的人NSC的生长的自动化高通量方法如实施例1所述，使人神经干细胞(hNSC)在维持培养基+LIF中长成神经球。利 用切割间距设置为200pm的麦奇文组织切片机切割正好两次(两次切割之间转动90 ° )、接着进行第三次45。切割来进行手动分离之后，使神经球在维持培养基中培养 正好3天。这样使约24%的神经球的面积落入0.02-0.61111112的特定尺寸范围内，从而 能够接种到多孔板(384-或1536孔)中。例如，在手动分离后培养的第三天，轻柔搅动神经球产生均匀分布的神经球悬 液，用无菌移液器在底部透明的384孔板(如考思特公司(Costar) 3712)各孔间转移小 体积(例如l(Hil)溶液，从而使各孔均含有一个或多个尺寸为0.02-0.6的神经球。然后 加入维持培养基使各孔体积相同(如30Hl)，将一种或多种受试物加入指定孔中。通常 对受试物以一定浓度范围重复试验四次。对照孔包括含有维持培养基+LIF的阳性对 照和和含有维持培养基+LIF而不含EGF/bFGF的阴性对照。在37°C/5%C02的条件 下培养平板一段时间。作为自动化分析来增加通量的例子，利用IN Cell Analyzer 1000㊣平板阅读器拍 摄各孔图像，利用定制的INCellDevel叩erToolbox⑧软件来测定各神经球的直径。 在这种高通量分析中，可以拍摄亮视野图像，从而可以通过采用多孔板(384或1536 孔)中小孔组合[拍摄视野图像；挑选神经球；测量；经数天/数周后重复一次]和低放 大倍数(最高放大倍数为2X-4X)来捕获全部神经球。必须使用细胞分析器来拍摄由单 孔所限定的视野中的图像，然后鉴定和测量视野中的神经球。可以在数天或数周后 重复一次，从而对各孔中同样的神经球进行再次测量。服从必需聚焦(放大)和亮视野光线条件而能够获得所需成像效果的多孔板包括 经考司特黑色无菌组织培养物处理过的384孔板(产品目录编号为3712)。经过规定 的培养时间段后进行多次测量。如果神经球的培养时间超过数天，需要用新鲜溶液 换掉维持培养基。数据通常表示成超过基线的变化％，公式如下[(时间为0时的面 积)一(时间为X时的面积)/(时间为0时的面积)XIOO]。如图6所示，化合物他克林 可以促进神经球的生长。实施例3:将人细胞球转移到单层培养物中如实施例1所述，人神经干细胞(hNSC)在维持培养基中长成神经球。每7-14天， 通过在组织切块机(麦奇文仪器公司(McIlwain Instruments))上将所述细胞机械切割成 直径为200pm的球而对其进行常规传代，每3-4天用新鲜培养基换掉一半培养基。 用ACCUTASETM(酶、磷酸盐缓冲盐水和购自圣地亚哥市创新细胞技术有限公司(Innovative Cell Technologies)的酚红的组合)，或者胰蛋白酶(沃辛顿生物化学公司 LS003707)进行酶处理分散后将神经球转移到贴壁单层培养物中。简单而言，将神经球转移到eppendorf管，静置1分钟，用预热到37'C的 ACCUTASETM处理10分钟。用P200枪头轻柔吹打约20-30次使神经球分散。200g 离心2分钟后，用维持培养基(30。/。HamsF12(集博克公司11765-062)、 70% DMEM (集博克公司11965-118)、 1% PSA (集博克-BRL 15420-062)、 1。/。N2(集博克-BRL公 司17502-048)、 20ng/mlEGF(西格玛公司E9644))洗涤细胞，用血细胞计数器进行 细胞计数和用台盼蓝(西格玛公司)评估活力。将细胞接种在包被有10pg/ml聚-L-赖氨 酸(西格玛公司P5899)和50吗/ml小鼠层粘连蛋白(L2020)的表面外。用含有30% Hams F12 (集博克公司11765-062)、 70% DMEM (集博克公司 11965-118)、 1% PSA (集博克-BRL公司15420-062)、 1% N2(集博克-BRL公司 17502-048)、 20ng/ml EGF (西格玛公司E9644), 10ng/ml LIF (肯强公司LIF1010)、 20ng/ml bFGF (R和D 233-FB)和5吗/ml肝素(西格玛公司H3149)的培养基实现贴壁 hNSC的传代和长期生长。贴壁细胞的常规传代方法如下每2-3天简单地将贴壁细 胞在温热ACCUTASETM条件下培养直到细胞起翘脱落，用维持培养基冲洗来收集细 胞，然后1000rpm离心3分钟。对细胞计数和再次接种在包被有10pg/ml聚-L-赖氨 酸和50pg/ml小鼠层粘连蛋白(L2020)的表面上。这样做，可以通过使人神经干细胞 接触规定培养基中的特定因子和在规定基质上培养而将其稳定培养成单层。这样做 还可以将细胞传代成单层形式从而保留干细胞性质。如下所述，可以通过使NSC与促成特定细胞命运的各种物质接触来确认单层培 养的NSC分化成多种细胞谱系的能力。获取NSC，置于96孔板内，用不含EGF或 bFGF(无促分裂原的受试培养基)的上述受试化合物进行处理。或者，最初受试培养 基如上所述，而在规定时间段后(例如在第4天)更换受试培养基，换上无促分裂原受 试培养基。包括以下对照对照1:含有l(HiMDHEA不含促分裂原的受试培养基(神 经元分化的阳性对照)；对照2:含有EGF和bFGF的受试培养基(阴性对照)；对照3: 含有50ng/ml BMP-2和0.5%FBS不含无促分裂原的受试培养基(星形细胞分化的阳性 对照)；和对照4:含有2ng/mlIGF-l不含促分裂原的受试培养基(少突胶质细胞分化 的阳性对照)。如上所述对平板进行培养、洗涤和固定。用细胞类型特异性抗体对固定细胞进 行染色。这类抗体的例子包括GFAP(星形细胞)、TUJ-1和NF-200(神经元)和01和 04(少突胶质细胞)。确认了它们能够分化成所述多种神经元细胞谱系(细胞类型)(数据38未显示)。这表明NSC保留或维持了其在单层培养物中分化的特征特性。 实施例4:利用单层培养物进行自动增殖(生长或营养性)试验如实施例2所述，用10pg/ml多聚-L-赖氨酸和50pg/ml小鼠层粘连蛋白包被将 经组织培养物处理过的底部透明的无菌96孔板(如考司特3712)。将维持培养基中的 10-15个神经球(参见实施例2)转移(估计约为100,000个细胞/球)到eppendorf管，如 实施例2所述用酶使细胞分散。每lOOpl孔中放置约50,000个细胞。培养约1小时 使所述细胞贴壁，每孔加入100pl受试化合物。图1A显示两次检测5种化合物来获 得8点剂量反应曲线的典型试验的分配图。用Perkin-Elmer MultiPROBE II PLUS HT Ex(实验方案8-点；人CRC; 96孑L)在实验培养基(30% Hams F12 (集博克公司 11765-062)、 70% DMEM (集博克公司11965-118)、 1% PSA (集博克-BRL公司 15420-062)、 1% N2 (集博克-BRL公司17502-048)、 20 ng/ml EGF (西格玛公司 E9644)、 10ng/ml LIF (肯强公司LIF 1010)， 20ng/ml bFGF (R&D 233 -FB)禾口 5 pg/ml 肝素(西格玛公司H3149))中制备化合物。每板均有含有受试培养基(阳性对照)和含有受试培养基不含生长因子(阴性对照) 的对照。在37"和通入5%<:02的条件下总共培养平板7天。在第4天，取出细胞平 板，加入新鲜化合物/培养基。培养后，用0.1MTris-缓冲盐水(TBS)将各孔洗涤l次， 每孔加入100^1固定/核染色溶液(8吗/ml Hoechst 33342和含3.7%甲醛的0.1M TBS 溶液)室温培养30分钟。然后用0.1M TBS洗涤细胞4次。用IN Cell Analyzer 1000 平板读数器和IN Cell Devel叩er Toolbox⑧软件测定每孔或每幅图像(即视野)中的细 胞个数。如图1B所示为非神经发生(非回归性)和无毒化合物(纳屈酮)的典型剂量-反 应曲线。实施例5:利用单层培养物进行自动分化试验可以用常规方法鉴定分化NSC并如实施例3所述手动计算单层中的神经元、星 形细胞和其它细胞的相对数量。可采用如实施例3所述的稳定的单层NSC培养方法 和任选的小型化分化系统估计不同物质对NSC分化的作用的高通量、高容量试验。以约78,125个细胞/cm2的具体密度将细胞接种到包被有10吗/ml聚-D-赖氨酸和 50吗/ml小鼠层粘连蛋白的高通量多孔板(包括96、 384和1536孔板)中，从而进行小 型化分析以浓度反应曲线形式对人NSC进行多次分析。将细胞在不含促分裂原的实 验培养基中培养，接种细胞后马上使其接触本文所述的分化物质。可以采用利用自 动化设备(像作为非限制性例子的珀金埃尔默仪器公司(Perkin Elmer)的Evolution P3、 珀金埃尔默仪器公司的Multiprobe II Plus和美国宝特公司(Bio-Tek)的ELx405 SelectCW)进行的稳定分化兼容性培养在实验开始后第3-4天用新制备的培养基和分化物 质换掉50%的培养基。如本文所述进行固定和染色，接着利用自动化设备(英瑟分析公司的高通量成像系统)在多个波长处对每孔拍摄多幅照片，从而测定NSC分化结果。通过测定被Tujl 染色的个数，再除以由自动化计数Hoechst染色细胞核所确定的细胞个数，对神经元 分化进行定量。通过测定被GFAP染色的个数，再除以由自动化计数Hoechst染色细 胞核所确定的细胞个数，对星形细胞分化进行定量。如图4A所示的浓度反应曲线证 明了随着5-羟色胺(5-HTP)浓度的增加，分化成神经元的NSC也增加。可以采用类 似方法利用其它细胞类型特异性抗体，例如GFAP(星形细胞)、NF-200(神经元)和01 和04(少突胶质细胞)，来确定不同物质对星形细胞或少突胶质细胞分化的作用。 实施例6:啮齿动物基因报道物体外试验在含有bFGF(30MHamsF12(集博克公司11765-062)、 70% DMEM(集博克公司 11965-118)、 1% PSA(集博克-BRL公司15420-062)、 1% N2(集博克-BRL公司 17502-048)、 20ng/ml bFGF(R和D 233-FB)、 lmM L-谷胺酰胺)的维持培养基中培养 啮齿动物神经干细胞(rNSC)。所有塑料或玻璃器皿均用10(ig/ml聚-L-鸟氨酸和5吗/ml 小鼠层粘连蛋白包被。将细胞与胰蛋白酶在室温下培育1分钟使细胞分散，用5ml 维持培养基重悬，1000g离心3分钟，用小孔径Pasteur移液器轻柔吹打使其重悬于 lml维持培养基中。然后用血细胞计数器进行细胞计数和用台盼蓝(西格玛公司)估计 活力。将0.5吗海肾(renilla)荧光素酶和5吗启动子特异性海肾(seapansy)荧光素酶组 成的混合物与连接于绿色荧光蛋白(GFP)、黄色荧光蛋白(YFP)或荧光蛋白DsRed的 基因特异性启动子联用。将所有基因报道构建物克隆进相同的慢病毒载体主链中。利用GFP载体对照进行平行试验来观察电穿孔的有效性。每次电穿孔通常使用 2xl()S个细胞。将重悬细胞与待转染DNA在100nL核因子(Nucleofactor)溶液中混合。 然后将该混合物转移到电穿孔小瓶中进行电穿？L，将细胞与500nL维持培养基混合。 每次电穿孔时将9.5mL维持培养基加到等体积的含有两倍浓度待测药物的维持培养 基中。在5。/。C02和37t:下培养细胞2天，吸出培养基，加入适当量的裂解缓冲液。 立即对细胞提取物进行读数或者冷冻以后再分析。例如在TecanGeniosPro阅读器上 分析荧光素酶的启动子特异活性或荧光蛋白水平。实施例7:人基因报道物的体外试验使人皮层干细胞在含有EGF/LIF(30。/oHamsF12(集博克公司11765-062)、 70% DMEM(集博克公司11965-118)、 P/。PSA(集博克公司-BRL 15420-062)、 1%N2 (集博克-BRL公司17502-048)、 20ng/ml EGF(西格玛公司E9644)、 20ng/ml LIF (肯强公司 LIF1010))的维持培养基中长成神经球。每10-14天在组织切块机上将其切成4块进 行细胞传代。球直径优选不超过50(Him。通过吸走旧的培养基，加入新鲜培养基， 每3-4天喂养一次细胞。或者可以如实施例3所述将神经球传代成单层。如实施例6 所述用启动子特异性基因报道构建物转染细胞，并测定启动子激活水平。实施例8:利用神经递质作为组成型因子来帮助检测体外的神经发生调节作用如实施例3和4所述，将维持成神经球的人NSC在包被有层粘连蛋白/聚-L-赖 氨酸的平板上平铺成单层，分析其增殖和/或分化，不同之处在于将所述受试物调整 为包含各种浓度的一种或多种神经递质来帮助检测神经发生调节剂。图4B显示神经 递质(5-羟色胺或5-HTP)帮助检测受试物(多巴胺)对NSC增殖作用的结果。根据各显 微镜视野中的平均细胞密度，减掉对照实验的平均细胞密度来测定增殖。将数据绘 制成含有和不含2种独立浓度5-HTP时多巴胺的剂量反应曲线。在所述实施例中，各曲线均显示分别减掉了背景细胞密度水平(从多巴胺曲线上 仅减掉培养基中的值，从存在多巴胺时相应的值中减掉含有10pM 5-HTP和30pM 5-HTP的培养基中的值)的平均细胞密度是受试物浓度的函数。尤其当所述受试物的 浓度较高时，所述受试物(多巴胺)对NSC增殖(正方形)具有小剂量依赖型作用，存在 lOpM 5-HTP(圆形)时能够显著增强，存在30pM 5-HTP(三角形)时能够进一步增强该 作用。数据显示神经递质和受试物可以协同增强神经元的分化。该实施例显示可以利用脑中存在的一种或多种内源性因子来建立体内脑环境的 模型。在存在多巴胺(体内脑化学的组分)时培养细胞，如实施例5所述测定神经元分 化。仅多巴胺不能促进NSC分化成神经元。然而，加入通常在脑中发现的神经递质 5-HTP能使细胞对接触多巴胺变得敏感，导致响应于多巴胺NSC分化浓度依赖性增 加。实施例9:对单层NSC进行自动化的毒性/营养性试验通过如上所述地优化单层培养条件，如上所述地小型化培养系统，本发明发展 了一种能够测定物质对NSC的营养性作用的高通量自动化试验。简单而言，在存在组胺时，如实施例5所述培养细胞。组胺溶解于作为载体的 DMSO中，使细胞接触最高浓度为0.3%的载体。通过固定和使细胞接触Hoechst染 料来确定细胞个数。利用InCell Analyzer 1000自动获得图像和通过自动计数染色细 胞核来确定细胞个数。组胺能够以浓度依赖性方式促进细胞生长(参见图8)。可以用类似方法确定物质的毒性作用。如上所述使NSC接触BAY-60-7550，定会以浓度依赖性方式引起细胞死亡，表明其在较高浓度具 有毒性(参见图9)。实施例10:建立体内疾病模型利用内源衍生性因子DHEA建立正常神经元分化水平。使这些细胞同时接触阿 片样物质吗啡能抑制正常的NSC分化。开展试验来鉴定可以恢复神经发生的物质。 使细胞接触吗啡和纳屈酮(吗啡作用的抑制剂)。接触纳屈酮使神经发生复苏(参见图 10)。如上述单层试验中所述，对细胞进行种板、培养、成像和分析。可以采用针对星形细胞发生的试验来鉴定能够抑制NSC分化成星形细胞的物 质。5-HTla激动剂丁螺环酮能促进其分化成神经元和星形细胞(参见图11)。已显示仅褪黑激素对星形细胞发生没有作用，然而往丁螺环酮的浓度反应曲线中加入高浓 度的褪黑激素会阻碍其分化成星形细胞，而保留其分化成神经元的能力。如上所述对细胞进行种板、培养、成像和分析。本文引用的所有参考文献，包括专利、专利申请和出版物，无论之前是否特别 将其纳入过，均以其全文纳入本文作参考。现在，由于充分公开了本发明，本领域技术人员将认识到无需进行过度试验， 可以将大量的等效参数、浓度和条件用以实现相同目的而不背离本发明的精神和范 围。尽管以与其特定实施方式结合的方式对本发明进行了描述，应该理解本发明还 可以有其它修改形式。本发明涵盖总体上遵循本公开原理，包括那些背离本发明却 属于本发明所属领域内己知或通用实践范围内和可以应用于本发明上下文提到的必要特征的任何变体、应用或适应性修改。
权利要求
1.一种鉴定调节神经发生的物质或条件的方法，所述方法包括使含有人神经细胞的单层细胞培养物与受试物或受试条件相接触，和测定所述细胞中表征神经发生的特性后将所述物质或条件鉴定为能调节所述细胞的神经发生，其中所述神经细胞任选包含人神经干细胞(NSC)。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述接触或者还有所述鉴定是在 EGF、 bFGF、 FGF、 VEGF、 LIF、单胺或神经递质存在下进行的。
3. 如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，调节神经发生的表现为有丝分 裂阶段神经细胞比例的变化。
4. 如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，调节神经发生的表现为所述神 经细胞中一种或多种基因表达的变化。
5. 如权利要求I或2或3或4所述的方法，其特征在于，所述细胞培养物含有 NSC，调节神经发生的表现为所述培养物中NSC比例的变化。
6. 如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，调节神经发生的表现为所述培 养物中神经元群或星形细胞群的变化。
7. 如权利要求1或2或3或4或5或6所述的方法，其特征在于，进行所述接 触时存在第二种物质或条件，其中，所述第二种物质或条件能在所述细胞培养物中 增强对神经发生的调节。
8. 如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述第二种物质或条件是单胺神经 递质，任选性地选自5-羟色胺、多巴胺、去甲肾上腺素和上述物质的类似物、代谢 产物或前药。
9. 如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述第二种物质或条件是调节一种 或多种神经递质或单胺的水平或作用的物质，例如调节单胺神经递质的再摄取的物 质。
10. 如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述第二种物质或条件是单胺受 体调节剂。
11. 如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述第二种物质或条件是MAO 抑制剂。
12. —种检测毒性降低的方法，所述方法包括使人神经细胞的第一单层细胞培养物与能够抑制神经发生的物质或条件相接 触，使人神经细胞的第二单层细胞培养物与受试物或受试条件以及所述抑制神经发 生的物质或条件相接触；和测定与所述第一单层相比，所述第二单层中神经发生毒性的降低。
13. 如权利要求12所述的方法，还包括将能够降低神经发生毒性的物质或条件 鉴定为神经保护性物质或条件。
14. 一种鉴定适合移植的神经干细胞的方法，所述方法包括 由神经干细胞群分离神经干细胞亚群； 使所述细胞亚群与调节神经发生的物质或条件相接触；和检测所述亚群中神经发生的增加或减少，其中，神经发生增加表示所述神经干 细胞群适合移植。
15. 如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述神经发生增加的表现为所述 亚群中沿神经元细胞谱系或胶质细胞谱系分化的神经干细胞比例增加。
16. 如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述神经发生增加的表现为有丝 分裂细胞比例增加。
17. 如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述神经发生增加的表现为神经 干细胞数量增加。
18. 如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述神经发生增加的表现为星形 细胞比例减少或星形细胞发生的减少。
19. 一种鉴定适合移植的神经干细胞的方法，所述方法包括-由神经干细胞群分离神经干细胞亚群； 使所述细胞亚群与增加神经发生的物质或条件相接触；和检测所述亚群中表征存在神经发生的一种或多种基因的表达，其中，所述表达 表示所述细胞群中的神经干细胞适合移植。
20. —种进行神经发生试验的方法，其包括 使含有神经干细胞的细胞群与受试化合物相接触；和 测定所述细胞表征神经发生的一种或多种特征，改进包括 还使所述细胞群与神经递质相接触。
21. 如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述神经递质是单胺，任选性地 选自多巴胺、5-羟色胺或去甲肾上腺素。
22. —种分析受试化合物的神经发生活性的方法，所述方法包括 在存在含有神经递质的生长培养基的条件下，使含有神经干细胞的体外细胞群与受试化合物相接触；和测定所述神经干细胞的神经发生。
23. 如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述神经递质是单胺，任选性地 选自多巴胺、5-羟色胺或去甲肾上腺素。
24. 如权利要求22或23所述的方法，其特征在于，所述测定包括检测所述神 经干细胞的生长。
25. —种鉴定调节神经发生的物质或条件的方法，所述方法包括 使横截面积至少为约0.2-0.6mn^的神经球与受试物或受试条件相接触；禾口 测定所述细胞表征神经发生的特性后，将所述受试物或受试条件鉴定为能够调节所述神经球中的神经发生。
26. 如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述分离神经球的特性包括神经 球的一种或多种尺寸。
27. 如权利要求25或26所述的方法，其特征在于，所述神经球含有人神经干 细胞。
28. 如权利要求25或26或27所述的方法，其特征在于，在接触所述受试物或 受试条件后的两个或更多个时间点进行所述测定。
全文摘要
本发明公开了鉴定调节神经发生的物质和条件的方法和手段。本公开物还涉及鉴定适合移植的神经干细胞群的方法和手段。
文档编号G01N33/50GK101263389SQ200680028952
公开日2008年9月10日 申请日期2006年7月7日 优先权日2005年7月8日
发明者C·巴洛, J·C·皮尔斯, K·I·劳瑞, K·特罗纳, T·A·卡特尔 申请人:脑细胞股份有限公司