专利名称：：用于抗体分型的蛋白质芯片及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及蛋白质芯片，尤其涉及一种用于单克隆抗体分型的蛋白质芯片及其制备方法和应用。技术背景生物芯片技术是基于生物大分子(核酸、蛋白质等)相互作用的大规模并行分析方法，已成为当今生命科学研究领域发展最快的技术之一。蛋白质芯片是检测蛋白质之间相互作用的生物芯片，它是基于抗原和抗体特异性结合的原理，利用微点阵技术将多种蛋白质结合在固相基质上，从而使传统的生物学分析手段能够在极小的范围内快速完成，达到一次实验同时分析多个生物标本或检测多种指标的目的。随着制备和检测技术的曰趋成熟，蛋白质芯片己经成为生物、医学研究中的重要技术平台。微孔板蛋白质芯片是将数量相对较少，经过高度纯化，具有相关生理作用的功能蛋白质固定于一个反应仓中，研究蛋白质与其他生物分子的相互作用。抗体尤其是单克隆抗体，在有关蛋白质的功能研究、免疫学研究和药物靶点的发现以及抗体药物的研制方面有极其重要的应用。人类蛋白质组计划最重要的工作之一就是要进行人类所有蛋白质的识别，进行蛋白质的测序是一个重要的技术方案，而另外一个非常有效的方案是建立在经典的抗体识别的基础上的，即建立高覆盖的抗体组，来识别所有的人类表达蛋白。抗体药物是以细胞工程技术和基因工程技术为主体的抗体工程技术制备的药物。由于其特异性高，性质均一，可针对特定靶点制备，抗体药物应用于各种疾病治疗、特别是肿瘤治疗的前景备受关注。美国食品药品监督管理局已批准了17种治疗性抗体，其中8种抗体类药物用于肿瘤治疗(SternM，HerrmannR，Overviewofmonoclonalantibodiesincancertherapy:presentandpromise，CriticalReviewsinOncologyHematology,2005，54(1):11-29)。因此，高通量抗体制备技术体系的建立对于蛋白质组研究和抗体药物的开发起着推动的作用。目前主要有三种高通量抗体制备技术即杂交瘤技术，工程抗体技术和人记忆B细胞分选技术(TraggiaiE，BeckerS，SubbaraoK，etal.，AnefficientmethodtomakehumanmonoclonalantibodiesfrommemoryBcells:potentneutralizationofSARScoronavirus，NatMed，2004，10(8):871-5)。各种高通量技术制备的单克隆抗体都需要进行相关亚型的分型检测，普遍使用的方法为ELISA方法，但是ELISA检测工作量大，试剂与样品需求多。在高通量的进行抗体制备中，需要一种快速、灵敏的方法进行单克隆抗体的分型。
发明内容本发明要解决的技术问题是提供一种用于抗体分型的蛋白质芯片，在正确进行单克隆抗体分型的同时，能减少试剂与样品用量，提高检测效率。为此，本发明还要提供该蛋白质芯片的制备方法和应用。为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现在本发明的一个方面，提供了一种用于抗体分型的蛋白质芯片，包括基片和固定于该基片上的蛋白质，所述固定于基片上的蛋白质为分型用抗体，该分型用抗体识别包括IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA和IgM的抗体亚型。所述分型用抗体的浓度可由抗体浓度梯度芯片确定。所述基片选材为玻片、硅片、硝酸纤维素膜、尼龙膜和高分子材料中的一种或它们的任意组合。在本发明的另一方面，提供了一种用于抗体分型的蛋白质芯片的制备方法，包括如下步骤(1)构建分型用抗体浓度梯度芯片，并利用该浓度梯度芯片确定合适的分型用抗体浓度；(2)常规清洁处理固体基片，并将基片表面进行活化使其具有吸附蛋白的活性；(3)用芯片点样仪将分型用抗体按步骤(1)确定的合适浓度点制在基片上；(4)37。C干燥后，04匸保存待用。在本发明的另一方面，提供了一种应用上述蛋白质芯片进行抗体分型的方法，包括如下步骤(1)选取上述的蛋白质芯片；(2)在适于与所选芯片上的分型用抗体进行相互作用的条件下，加入待测样品，并使其反应足够时间；(3)洗去未与分型用抗体结合的样品后，加入经标记的抗体，并使其在合适的条件下反应足够时间，所述标记抗体可与结合在分型用抗体上的样品进行特异性结合；(4)洗去未与样品特异性结合的标记抗体；(5)检测杂交结果，以确定待测样品的抗体亚型。其中，步骤(3)所述的标记抗体釆用的标记物包括荧光素、生物素、放射性元素和酶。在本发明的另一方面，提供了一种用于抗体分型的试剂盒，包括(1)本发明的蛋白质芯片；(2)酶标抗体；(3)底物显色液；(4)用于稀释待测样品的稀释液；(5)蛋白质芯片的洗涤液；(6)分型用抗体的标准品。在本发明的另一方面，还提供了一种上述蛋白质芯片在制备抗体药物中的应用。本发明的用于抗体分型的蛋白质芯片，能快速、简便、正确地对单克隆抗体进行分型鉴定，每种待检测单克隆抗体仅需要使用芯片上的2孔就可进行鉴定，待检测样品仅需0.5-10ul;而ELISA实验中，每种待检测单克隆抗体需要96孔板包被12孔进行鉴定，待检测样品需要1.2ml。无论是待检测单克隆抗体的用量还是检测试剂、显色试剂的用量，与ELISA实验比较，本发明的蛋白质芯片检测的用量都大大减少，降低了成本，提高了工作效率。下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。图1是本发明的分型用抗体浓度梯度芯片的设计示意图；图2是本发明的使用IgM浓度梯度芯片确定分型抗体浓度的扫描结果图；图3是本发明的用于抗体分型的蛋白质芯片的设计示意图；图4是本发明的蛋白质芯片进行抗体分型的检测结果图。具体实施方式本发明用于抗体分型的蛋白质芯片的基本原理为酶联免疫吸附实验,该蛋白质芯片包括识别IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA、IgM六种抗体亚型的抗体。实施例1分型用抗体浓度梯度芯片设计及最佳抗体浓度的筛选单克隆抗体分型用抗体试剂盒IS0-2(Sigma)中的6种分型用抗体(分别识别IgGl，IgG2a，IgG2b，IgG3，IgA，IgM)使用pH7.0，50mMPBS浓度梯度稀释(1:10，1:40，1:160，1:640，1:2560，1:10240,1:40960)，与阴性质控点(pH7.0，50mMPBS)组成3X3的平面阵列式芯片，抗体浓度梯度芯片的设计示意图如图1所示，在图1中，Al、A2、A3、Bl、B2、B3、Cl为l:10，1:40，1:160，1:640，1:2560，1:10240，1:40960稀释的分型用抗体，C2、C3为芯片阴性质控点。使用构建好的分型用抗体浓度梯度芯片，加入梯度稀释(1:10，1:40，1:160，1:640，1:2560，1:10240)的单克隆抗体细胞株的培液50ul进行检测，芯片杂交结果以IgM为例，如图2所示。芯片实验结果如表1所示，在l:IO稀释度下，所有6种分型抗体均能识别相对应的单克隆抗体，而在l:40稀释度下，IgG2b分型抗体未能识别对应的单克隆抗体，后又选择l:20的稀释度进行检测，可以正确识别。因此统一选择1:20稀释的浓度为构建抗体分型芯片的分型抗体试剂浓度，选择l:100稀释的单克隆抗体细胞株的培液50ul进行检测。表l分型用抗体浓度梯度实验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>实施例2单克隆抗体分型芯片设计、其检测过程及结果(1)抗体分型芯片设计将1:20稀释的6种分型用抗体与阴性质控点组成3X3的平面阵列式芯片，芯片设计示意图如图3所示，在图3中，A2、A3、Bl、B2、B3、Cl分别对应l:20稀释的分型抗体IgGl、IgG2a、IgG2b、IgA、IgM、IgG3，Al、C2、C3为芯片阴性质控点。(2)抗体分型芯片制备微孔板按照Millipore的实验手册使用70%甲醇进行活化，PBS平衡后，使用点样仪进行芯片制备，每种样品喷点25nl。芯片制备完成后，37"C干燥1小时，04"C保存待用。(3)抗体分型芯片检测将待检测样品按照一定比例使用5%脱脂奶粉稀释后，直接加入单克隆抗体分型芯片的检测孔中，每种样品两或三复孔，加入的样品量为50ul。室温振荡孵育l小时后，使用PBST(0.5%Tween20)洗涤芯片3次，加入使用5X脱脂奶粉稀释的HRP(辣根过氧化物酶)标记的羊抗鼠抗体(1:3000)，室温振荡孵育0.5小时后，PBST洗涤3次，每孔加入30ulOPD显色液(Sigma)显色，室温显色2分钟后，目测或扫描仪进行扫描记录实验结果。(4)检测结果对本研究室制备的针对8种蛋白的14株单抗以及2种多抗进行芯片鉴定，检测加入l:100稀释的单克隆抗体细胞株的培液50ul进行，杂交检测结果如图4和表2所示，其中单抗7种为IgGl型，3种为IgG2a型，3种为IgG2b型(与IgA型有交叉)，l种IgM型(与IgG3型有交叉)；2种多抗均为5种亚型的混合抗体，在图4中，l为mAb-Ol，2为mAb-09，3为pAb-02。该芯片检测结果与传统的ELISA检测结果完全一致。表2抗体名称与分型结果抗体编号蛋白名称ELISA检测结果芯片检测结果mAb-01LM02IgG2aIgG2amAb-02BIRC5IgG2b(与IgA有交叉)IgG2b(与IgA有交叉)mAb-03MYCIgGlIgGlmAb-04GNAZIgG2aIgG2amAb-05PLAUIgG2b(与IgA有交叉)IgG2b(与IgA有交叉)mAb-06Paf-AHIgGlIgGlmAb-07Paf-AHIgG2aIgG2amAb-08Paf-AHIgG2b(与IgA有交叉)IgG2b(与IgA有交叉)mAb-09Paf-AHIgM(与IgG3有交叉)IgM(与IgG3有交叉)mAb-lOMLPIgGlIgGlmAb-11MLPIgGlIgGlmAb-12MLPIgGlIgGlmAb-13MLPIgGlIgGlmAb-14MLPIgGlIgGlpAb-OlPECIIgGl，IgG2a,IgG2b，IgM，IgG3IgGl，IgG2a，IgG2b,IgM，IgG3pAb-02MLPIgG]，IgG2a，IgG2b，IgM,IgAIgGl，IgG2a，IgG2b，IgM,IgA本发明制备的单克隆抗体分型芯片实现了快速直接地进行抗体分型，通过一次制备(8小时之内可以完成10块以上96孔3X3的单克隆抗体分型芯片)，可实现对300种单克隆抗体进行三重复的检测。实验证明，制备完成的单克隆抗体分型芯片在4'C干燥的环境保存二个月以后，仍然能够正确对单克隆抗体进行分型鉴定。权利要求1.一种用于抗体分型的蛋白质芯片，包括基片和固定于该基片上的蛋白质，其特征在于，所述固定于基片上的蛋白质为分型用抗体，该分型用抗体识别包括IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA和IGm的抗体亚型。2.如权利要求1所述的蛋白质芯片，其特征在于，所述分型用抗体的浓度可由抗体浓度梯度芯片确定。3.如权利要求1所述的蛋白质芯片，其特征在于，所述基片选材为玻片、硅片、硝酸纤维素膜、尼龙膜和高分子材料中的一种或它们的任意组合。4.一种权利要求1所述的用于抗体分型的蛋白质芯片的制备方法，其特征在于，包括如下步骤(1)构建分型用抗体浓度梯度芯片，并利用该浓度梯度芯片确定合适的分型用抗体浓度；(2)常规清洁处理固体基片，并将基片表面进行活化使其具有吸附蛋白的活性；(3)用芯片点样仪将分型用抗体按步骤(1)确定的合适浓度点制在基片上；(4)37'C干燥后，04。C保存待用。5.—种应用权利要求1所述蛋白质芯片进行抗体分型的方法，其特征在于，包括如下步骤(1)选取权利要求l所述的蛋白质芯片；(2)在适于与所选芯片上的分型用抗体进行相互作用的条件下，加入待测样品，并使其反应足够时间；(3)洗去未与分型用抗体结合的样品后，加入经标记的抗体，并使其在合适的条件下反应足够时间，所述标记抗体可与结合在分型用抗体上的样品进行特异性结合；(4)洗去未与样品特异性结合的标记抗体；(5)检测杂交结果，以确定待测样品的抗体亚型。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的标记抗体采用的标记物包括荧光素、生物素、放射性元素和酶。7.—种用于抗体分型的试剂盒，其特征在于，包括(1)权利要求l所述的蛋白质芯片；(2)酶标抗体；(3)底物显色液；(4)用于稀释待测样品的稀释液；(5)蛋白质芯片的洗涤液；(6)分型用抗体的标准品。8.权利要求1所述的蛋白质芯片在制备抗体药物中的应用。全文摘要本发明涉及蛋白质芯片，公开了一种用于抗体分型的蛋白质芯片，包括基片和固定于该基片上的蛋白质，所述固定于基片上的蛋白质为分型用抗体，该分型用抗体识别包括IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA和IgM的抗体亚型。本发明还公开了一种上述蛋白质芯片的制备方法及应用。本发明的用于抗体分型的蛋白质芯片，能快速、简便、正确地对单克隆抗体进行分型鉴定，且能减少试剂与样品用量，提高检测效率。文档编号G01N33/50GK101236198SQ20071003690公开日2008年8月6日申请日期2007年1月29日优先权日2007年1月29日发明者赛叶,周佳菁,凯宋,张庆华,彭海林,王升年,肖华胜申请人:上海生物芯片有限公司