专利名称：一种以羟甲基戊二酰辅酶a还原酶为靶点的胆固醇代谢调控药物筛选系统及方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及细胞靶标筛选化合物系统，更具体的，本 发明涉及建立羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGCR)细胞耙标快速筛选调节 胆固醇药物的系统和方法。
背景技术：
胆固醇不仅是生物膜的关键组成成分，还是胆汁酸、甾醇类激素等合成的 前体。然而，体内高水平胆固醇如高胆固醇血症可直接导致动脉粥样硬化，是 中风和冠心病的主因；老年痴呆症、肥胖症、糖尿病等的发生也与胆固醇代谢 紊乱密切相关。由于高胆固醇的致病性，在心血管等疾病的治疗与预防方案中 都把降胆固醇作为重要组成。
细胞内胆固醇的起始性合成是胆固醇代谢的重要组成，人体每天更新的约 1克胆固醇中，有2/3为自身合成获得。HMGCR是胆固醇合成过程中的限速酶， 它催化羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原为甲羟戊酸。
HMGCR所催化的HMG-CoA还原为甲羟戊酸是内源性胆固醇合成途径中 的关键步骤，目前临床应用最广泛的降胆固醇药物-他汀(Statin)类药物，就是 HMGCR酶活性的竞争性抑制剂，它针对HMGCR的COOH端结构域，竞争性 抑制甲羟戊酸的形成，从而降低胆固醇合成，刺激低密度脂蛋白(LDL)受体表 达，增强对血浆LDL的清除，从而达到降低血液胆固醇的目的。然而，服用他 汀类药物将使HMGCR蛋白量代偿性非常显著增多，导致患者不得不提高药物 剂量来抑制细胞内增多的HMGCR。这就使得该类药物在降胆固醇方面的作用， 表现为"用量上升、药效递减"，长期服用最后可形成严重不良的药物剂量增高 依赖性。而且己有报道，服用高剂量他汀类药物会引起肌肉毒性，严重者可发 生横纹肌溶解症。
从众多未知的化合物中筛选新的有效降胆固醇药物已成为心脑血管疾病
药物研发任务的重中之重。同时，寻找一种快速有效的化合物筛选系统也变得 尤为迫切。但是，传统的方法筛选化合物普遍存在着诸如周期长，操作繁琐， 特异性和敏感性差，不规范，不适用于大批量检测等明显的不足。
因此，本领域迫切需要开发一种方便快速、操作简单且具有良好的特异性 和敏感性的筛选胆固醇药物的系统。
发明内容
本发明的目的在于提供一种方便快速、操作简单且具有良好的特异性和敏 感性的筛选胆固醇药物的系统及其构建方法。
在本发明的第一方面，提供一种融合蛋白，所述的融合蛋白包括
(a) 羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的八次跨膜结构域；
(b) 可检测信号元件；和
(c) 任选的位于(a)和(b)之间的连接元件。
在另一优选例中，所述的羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的八次跨膜结构域具 有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列或与其同源性超过70% (优选的是同源性超 过80%;更优选的是同源性超过90%;进一步优选的是同源性超过95%)的氨
基酸序列。
在另一优选例中，所述的可检测信号元件选自(但不限于)荧光蛋白、
荧光素酶、半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、抗体可识别的短肽。
在另一优选例中，所述的抗体可识别的短肽选自(但不限于)Fag、 T7、 Myc、 HA。
在另一优选例中，所述的荧光蛋白选自绿色荧光蛋白或增效的绿色荧光 蛋白。
在另一优选例中，所述的连接元件具有i-io个氨基酸。
在另一优选例中，所述的羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的八次跨膜结构域位 于氨基端，而所述的可检测信号元件位于羧基端。
在另一优选例中，所述的羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的八次跨膜结构域位 于羧基端，而所述的可检测信号元件位于氨基端。
在本发明的第二方面，提供一种核酸分子，所述的核酸分子编码所述融合
蛋白；或与所述的核酸分子相互补。
在本发明的第三方面，提供一种载体，它含有所述的核酸分子。 在另一优选例中，所述的载体选自质粒、病毒、或人工染色体。
在本发明的第四方面，提供一种基因工程化的细胞，所述的细胞含有所述 的载体；或所述的细胞基因组中整合有所述的核酸分子。
在本发明的第五方面，提供所述的融合蛋白的用途，用于筛选调节胆固醇 的物质。
在另一优选例中，所述的调节胆固醇是降低胆固醇或提高胆固醇。
在本发明的第六方面，提供一种筛选以羟甲基戊二酰辅酶A还原酶为靶点 的调节胆固醇的潜在物质的方法，所述方法包括步骤
(a) 将候选物质与所述的细胞接触；
(b) 观察候选物质对细胞中可检测信号的影响；
其中，若所述候选物质可降低(优选的是显著降低，如降低20%;更佳地 降低40%;最佳地降低60%或更低)所述细胞中的可检测信号的水平，则表明该 候选物质是降胆固醇的潜在物质；
若所述候选物质可提高(优选的是显著提高，如提高20%;更佳地提高40%; 最佳地提高60%或更高(如提高200%))所述细胞中的可检测信号的水平，则表 明该候选物质是提高胆固醇的潜在物质。
在另一优选例中，步骤(a)包括在测试组中，在所述的细胞的培养物中添 加候选物质；和/或
步骤(b)包括检测测试组的细胞中的可检测信号的水平，并与对照组比较， 其中所述的对照组是不添加所述候选物质的所述的细胞。
在另一优选例中，所述的方法还包括步骤对获得的潜在物质进行进一步
的细胞实验和/或动物试验，以选出对于调节胆固醇有效的物质。
另一方面，本发明还提供一种通过所述的方法获得的调节胆固醇的物质。
优选的，该物质是具有调节(提高或降低)细胞胆固醇合成水平的活性物质。 另一方面，本发明还提供一种药物组合物，它包含安全有效量的所述的调 节胆固醇的物质，以及药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而 易见的。
图1显示了 HMGCR(TMl-8)-EGFP表达质粒结构示意图。
图2显示了 HMGCR (TMl-8)-EGFP融合蛋白在CHO细胞瞬时转染系统 中，25-羟胆固醇对融合蛋白的降解调控良好。
图3显示了荧光显微观察检测到25-羟胆固醇或羊毛甾醇对HMGCR (TMl-8)-EGFP融合蛋白降解调控良好。图4显示了蛋白免疫杂交方法检测到 25-羟胆固醇对HMGCR(TMl-8)-EGFP融合蛋白降解调控良好。
图5显示了在瞬时转染系统中，蛋白免疫杂交方法检测到25-羟胆固醇对 HMGCR(TMl-8)-Luciferase融合蛋白降解调控良好。
具体实施例方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次发现，将羟甲基戊二酰辅酶A还原 酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase,简称HMGCR，为胆固醇 合成的限速酶)的氨基端蛋白片段与可检测信号元件连接，导入到细胞后，可 在细胞内表达该蛋白片段与可检测信号元件的融合蛋白，所述融合蛋白既保留 了 HMGCR氨基端结构的功能和活性，又能够方便地被检出，从而可极好地用 于筛选调节(优选降解)HMGCR的物质，所述调节HMGCR的物质可作为调节 胆固醇的潜在药物。
本发明人基于HMGCR氨基端结构域的降解可以导致内源性胆固醇合成减 少，成功构建了羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的瞬时表达系统和稳定表达系统。 基于本发明的系统，可以快速有效地从众多功能未知的化合物中筛选出针对 HMGCR的氨基端结构域，并有效促进该蛋白泛素化降解的活性小分子化合物， 为新药开发提供一个便捷有利的技术平台。重要的是，针对这一靶点的药物， 将可能解决现有的他汀类药物的剂量增高依赖问题及药物毒性问题等缺陷，从 而为治疗高胆固醇血症引起的严重疾病(如动脉粥样硬化、冠心病等)提供更
好的治疗手段。
融合蛋白
本发明提供一种融合蛋白，该融合蛋白包括HMGCR氨基端结构，和可检 测信号元件，该分子可用于观察候选物质对于HMGCR的影响作用，筛选调节 HMGCR的物质。
HMGCR是一种广泛存在于哺乳动物中的、高度保守的蛋白。HMGCR蛋 白主要由两部分组成，氨基端为八次跨膜结构域，该结构域位于细胞膜上，其 作用是调控蛋白的稳定性，当细胞内甾醇水平过高时，HMGCR的氨基端结构 域通过直接或间接与甾醇结合，起始细胞内由膜蛋白Insig介导的泛素-蛋白酶 体途径最终导致HMGCR的降解。HMGCR蛋白的羧基端为催化结构域，行使 还原酶的功能。
本发明人在实践中发现，全长的HMGCR难以制备并表达携带可检测信号 的融合蛋白，即使在有些情况下表达成功，但稳定性和检测效果均不够理想， 再现性差，无法利用全长的HMGCR构建携带检测信号的融合蛋白来筛选调节 HMGCR的物质。因此，本发明人选择了多种HMGCR的片段与可检测信号元 件融合来构建筛选系统，结果发现，采用具有HMGCR氨基端八次跨膜结构域 的蛋白片段与可检测信号相连接，可建立极其优异的筛选系统，用于筛选调节 HMGCR的物质。
适当氨基酸替换、增加或减少的HMGCR氨基端八次跨膜结构域在本发明 中也是可用的，只要其保留了 HMGCR氨基端八次跨膜结构域的大部分生物活 性(如保留80%、 90%、 95%、 99%、或100%的活性)。适当替换氨基酸是本领 域的公知的技术， 一般来说，在该蛋白片段的非必要区域改变单个或多个氨基 酸基本上不会改变生物活性。见Watson等Molecular Biology of The Gene，第 四版，1987， The Benjamin/Cummings Pub. Co. P224。
应理解，虽然本发明的HMGCR氨基端八次跨膜结构域的编码基因获自仓 鼠，但是获自其它哺乳动物的与该HMGCR氨基端八次跨膜结构域的编码基因 高度同源(如具有70%以上，优选超过80%，更优选超过90。/。，进一步优选超过 95%的同源性)的基因也在本发明考虑的范围之内。比对序列相同性的方法和工 具也是本领域周知的，例如BLAST。
在本发明的一种优选方式中，所述的HMGCR氨基端八次跨膜结构域具有 SEQIDNO: 1 (346aa)所示的氨基酸序列。
多种可检测信号元件可与HMGCR氨基端八次跨膜结构域连接，从而用于 构建筛选调节HMGCR的物质的系统。
所述的可检测信号元件包括但不限于荧光蛋白、荧光素酶、半乳糖苷 酶、碱性磷酸酶、抗体可识别的短肽。适用于本发明的可检测信号元件通常 具有6-1000个氨基酸，较佳地具有10-700个氨基酸；更佳地具有10-400个 氨基酸。然而，不在6-1000个氨基酸范围内的其它长度的可检测信号元件也 被包含在本发明中，只要其能够与HMGCR氨基端八次跨膜结构域良好地连 接且基本上不影响HMGCR氨基端八次跨膜结构域的功能、活性、折叠或空 间构象。作为本发明的最优选的方式，所述的可检测信号元件是荧光蛋白或 荧光素酶。
所述的抗体可识别的短肽包括但不限于Flag、 T7、 Myc、 HA。
在本发明的一种最优选的方式，所述的荧光蛋白是绿色荧光蛋白(GFP) 或增效的绿色荧光蛋白(EGFP)。绿色荧光蛋白是指一种标记蛋白，其内源荧光 基团在受到紫外光或蓝光激发时可高效发射清晰可见的绿光，且见光不易淬 灭。所述的绿色荧光蛋白还包括各种在野生型绿色荧光蛋白基础上进行改进的 蛋白，比如进行基因优化；或通过氨基酸替换提高GFP脱辅基蛋白在高温(如 37℃)条件下的正确折叠，以及改变GFP光谱特性等。"增效的绿色荧光蛋白" 为对绿色荧光蛋白进行改进后的蛋白，例如，可克隆自质粒pEGFP-Nl或 pEGFP-N3 (购自Clontech)。本发明人在试验中发现，HMGCR氨基端八次跨膜 结构域与绿色荧光蛋白的融合蛋白表达系统能够最灵敏地反映候选物质对于 HMGCR的调控作用，提示绿色荧光蛋白与HMGCR氨基端八次跨膜结构域的 融合对于HMGCR氨基端八次跨膜结构域的空间结构影响或其它方面干扰最 小。此外，应用绿色荧光蛋白的另一优点是成本低廉，通过荧光分析即可体现 结果，较之免疫杂交等方法更直观、更灵敏、更方便。
所述的HMGCR氨基端八次跨膜结构域和可检测信号元件可直接连接，或 通过多肽连接元件连接，从而形成融合蛋白。
连接元件的长度没有特别限制，通常为l-10个氨基酸。连接元件不影响或
不显著影响HMGCR氨基端八次跨膜结构域和可检测信号元件氨基酸序列形成
正确的折叠和空间构象。
一些连接元件的例子例如多克隆位点所编码的氨基
酸序列。
所述的HMGCR氨基端八次跨膜结构域可以位于融合蛋白的氨基端(N端)， 而可检测信号元件位于融合蛋白的羧基端(C端)。或者，也可互换两种蛋白片 段所处的位置，也即所述的HMGCR氨基端八次跨膜结构域位于融合蛋白的 羧基端，而可检测信号元件位于融合蛋白的氨基端。或者，可检测信号元件插 入于HMGCR氨基端八次跨膜结构域中间，优选的是将可检测信号元件插入到 跨膜区与跨膜区之间的区域。作为本发明的一种优选的方式，所述的HMGCR 氨基端八次跨膜结构域位于融合蛋白的氨基端(N端)；所述的可检测信号元件 位于融合蛋白的羧基端(C端)。
另一方面，本发明还提供了编码所述含有HMGCR氨基端八次跨膜结构域 和可检测信号元件的融合蛋白的核酸，也可以是其互补链。
任何编码HMGCR氨基端八次跨膜结构域的合适的DNA结构都适用于本 发明。任何编码可检测信号元件的合适的DNA结构也适用于本发明。
并且，本发明还提供了一种重组载体，该载体包含编码所述融合蛋白的核 酸分子的载体。所述的载体还可包含与所述核酸分子的序列操作性相连的表达 调控序列，以便于所述融合蛋白的表达。
任何合适的载体都可用于制备所述的重组载体，比如一些用于细菌、真菌、 酵母和哺乳动物细胞的克隆和表达的载体，如Pouwds等，克隆载体实验室
手册(Elsevier最新版)中所描述的。在本发明的优选方式中，所述的载体选自 质粒、病毒、或人工染色体。
表达载体包括连接有合适的转录和翻译调节序列的融合蛋白DNA序列， 如哺乳动物、微生物、病毒或昆虫基因。调节序列包括转录启动子、操纵子、 增强子、核糖体结合位点或控制转录和翻译起始和终止的合适序列。在融合蛋 白序列需要调节序列功能的时候，则连接合适的调节序列。这样，启动子序列 被连接在编码融合蛋白DNA序列前端。在宿主细胞内的复制的能力通常由复 制起始点控制。用于转化株识别的筛选基因也可加入表达载体。
含有编码所述融合蛋白的核酸序列的重组细胞也包括在本发明中。所述的 重组细胞可以是瞬时转染了所述重组载体的宿主细胞，可以是稳定表达所述重 组载体的宿主细胞，也可以是同源重组的转基因细胞，或是原代培养的细胞，
或是永生化的细胞。利用所述重组细胞进行以HMGCR为靶点的调节胆固醇药 物的筛选。
筛选系统和筛选方法
技术领域：
本发明的含有HMGCR氨基端结构和可检测信号元件的融合蛋白可用于构 建筛选调节HMGCR的物质的体系，所述调节HMGCR的物质可进一步用作调 节(如升高或降低，优选降低)胆固醇的药物。
所述的筛选系统是一种重组细胞体系，所述细胞中被导入了携带所述融合 蛋白的编码基因的载体。在该细胞体系中，所述的融合蛋白被表达。因此，可 通过在细胞培养物中加入候选物质，观察候选物质对融合蛋白是否有调节作 用，从而筛选潜在的可调节HMGCR的物质。由于融合蛋白中含有可检测信号 元件，从而为调节作用的观察提供了便利途径。
因此，本发明还提供一种以HMGCR为靶点的筛选调节胆固醇的潜在物质 的方法，所述方法包括步骤
(a) 在测试组中，在所述的重组细胞中添加候选物质；
(b) 检测测试组的重组细胞中的可检测信号的水平，并与对照组比较，其 中所述的对照组是不添加所述候选物质的所述的重组细胞；
其中，若所述候选物质可降低(优选的是显著降低，如降低20%;更佳地 降低40%;最佳地降低60%)所述细胞中的可检测信号的水平，则表明该候选物 质是降胆固醇的潜在物质；若所述候选物质可提高(优选的是显著提高，如提高 20%;更佳地提高40%;最佳地提高60%或更高(如提高200%))所述细胞中的 可检测信号的水平，则表明该候选物质是提高胆固醇的潜在物质。
作为本发明的优选方式，本发明人将携带所述融合蛋白的编码序列的重组 载体瞬时转染哺乳动物细胞或者构建稳定表达该重组蛋白的细胞株，通过检测
HMGCR融合蛋白的表达调控和降解调控，筛选调节胆固醇药物。为了实现上 述目的，本发明人采用了以下技术HMGCR融合蛋白表达载体的构建；HMGCR 融合蛋白表达载体瞬时转染系统的构建，HMGCR融合蛋白稳定表达系统的构 建。利用功能己知的化合物检测HMGCR融合蛋白瞬时表达系统和稳定表达系 统的有效性及灵敏性。
通过上述方法初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以 从中选择到对于调节胆固醇有用的药物。
因此，本发明还提供了利用所述的方法获得的可调节HMGCR的物质，作 为胆固醇调节的潜在药物。
本发明还提供了一种组合物，所述的组合物包含安全有效量的所述的调节 胆固醇的物质，以及药学上或食品学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。所述 的组合物可以是药物组合物、食物组合物或保健品组合物。所述的"药学上可 接受的"或"食品学上可接受的"的成分是适用于人和/或动物而无过度不良副 反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。所述的 "有效量"是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受 的量。
本发明的主要优点在于
(1) 首次提供一种可表达HMGCR氨基端结构和可检测信号融合蛋白的系 统，其中的融合蛋白既保留了 HMGCR氨基端结构的功能和活性，又能够方便 地被检出，从而为筛选调节HMGCR的物质、进而获得调节胆固醇的药物提供 了良好的途径。
(2) 本发明构建的筛选系统具有良好的敏感性和准确性。
(3) 本发明的方法提供了一种便捷有效的检测各类化合物的调节胆固醇效 应的实验手段，该方法不仅可以应用于实验室对胆固醇代谢调控的理论基础研 究，还可应用于药物开发的前沿，用于建立一种化合物规模筛选的技术平台。
(4) 本发明可同时进行高通量的化合物筛选；筛药机理明确，速度快，作 用效果直观。并且，本发明的方法通用性强，实验系统稳定，重复性好。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室指南(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建 议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟 悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于 本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1
HMGCR(TMl-8)-EGFP融合表达载体的构建
已知HMGCR氨基端为八次跨膜结构域，其功能是调控蛋白的稳定性， 当细胞内甾醇水平过高时，该结构域通过直接或间接与甾醇结合，引起细胞 内由泛素-蛋白酶体介导的HMGCR的降解。本发明将编码仓鼠HMGCR氨基 端八次跨膜结构域的基因片段克隆进绿荧光蛋白表达载体。该重组载体中HMGCR (TMl-8)-EGFP融合蛋白的表达和降解受甾醇调控。重组载体的构建 过程如下
采用常规的方法，提取仓鼠的基因组RNA。采用常规的方法，以该基因组 RNA为模板，逆转录PCR扩增获得仓鼠的基因组cDNA。
以前述获得的仓鼠基因组cDNA为模板，以下列引物对为引物，
上游引物5'ATCGGATCCATGTTGTCACGACTTTTC 3'(SEQ ID NO: 2 ， 其中下划线为BamHI酶切位点)；
下游引物5'ATCGGATCCGGACTCTGTCTCTGCTTG 3'(SEQ ID NO: 3，其中下划线为BamHI酶切位点)；
利用PCR技术扩增得到编码仓鼠HMGCR的氨基端八次跨膜结构域 (HMGCR (TM1-8)， l-346aa)的基因序列；
PCR扩增的体系如下
上下游引物 各0.5 μl;
10x KOD PCR反应缓冲液 2.0 μl;
dNTP 2.0μl
仓鼠cDNA 1.0μl
KOD Hot Start DNA聚合酶0.5 μl;
去离子水补至 25μ1。
PCR扩增程序如下首先，94 ℃预变性5分钟；之后开始循环94 ℃30 秒，60℃30秒，72℃45秒，重复31个循环；然后，72℃5分钟。
琼脂糖凝胶(1%电泳鉴定PCR产物；利用TIANGEN琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR电泳产物。
将获得的PCR产物连接入pEGFP-N3载体(购自Clontech)的BamHI酶切位点内，构建成仓鼠HMGCR跨膜结构域绿荧光蛋白融合表达质粒pHMGCR (TMl-8)-EGFP。
连接体系如下
经BamHI酶切的pEGFP-N3载体 (0.3 μg/μl) 0.5 μl
经胶回收的PCR产物 8.3 μl
T4DNA连接酶(NEB) 400,000U/ml 0.2μl
10x缓冲液 1μl
室温条件下，连接过夜。
将前述获得的连接产物转化大肠杆菌DH12S(购自INVITROGEN)。挑选被转化的大肠杆菌单克隆，提取质粒，经BamHI酶切及Invitrogen公司DNA 序列测定验证，最终得到正确的仓鼠HMGCR跨膜结构域-绿荧光蛋白融合表达质粒pHMGCR (TMl-8)-EGFP。
实施例2
HMGCR (TMl-8)-EGFP融合蛋白表达载体瞬时转染系统的构建和药物筛选
本发明构建了 HMGCR(TM 1 -8)-EGFP融合蛋白表达载体瞬时转染系统。将 HMGCR(TMl-8)-EGFP融合蛋白重组载体瞬时转染CHO细胞系，通过荧光显微镜观察，确定HMGCR(TMl-8)-EGFP融合蛋白在该瞬时转染系统中有较高的表达水平，进一步利用25-羟胆固醇处理细胞，借助荧光显微镜技术，确定 HMGCR(TM 1 -8)-EGFP融合蛋白在该系统中有良好的降解调控。
构建过程如下
(1) 转染细胞前一天，CHO细胞以5X104加入60-mm细胞培养皿，加入 4ml含5%胎牛血清的DMEM/F12完全培养基，培养过夜。
(2) 转染时，将6plFuGENE6转染试剂加入到194^1无血清无抗生素的 DMEM/F12培养基中，小心混匀，室温静置5分钟；然后将含有1 pg HMGCR (TMl-8)-EGFP融合蛋白表达质粒的2吗质粒DNA(用1 pg pcDNA3.0表达质 粒补平到2(igDNA)加入该静置后的混合物中，小心混匀，室温静置15-45分 钟；最后，按照185pl转染试剂/培养皿的量将混合物以逐滴加入的方式均匀 的加入细胞中。
(3) 细胞与质粒在培养箱中以5%C02， 37°C条件下转染8小时。
(4) 转染8小时后，吸去细胞培养液，用PBS缓冲液(2 ml)洗两遍，注 意不要移动细胞，给细胞换上新鲜培养液，细胞在培养箱中以5%C02， 37 °C条 件下培养16小时。
(5) 培养16小时后，吸去细胞培养液，用PBS缓冲液(2 ml)洗两遍，注 意不要移动细胞，给细胞换上新鲜培养液，用乙醇(对照)或1 ng/ml25-羟胆固 醇以及10mM甲戊二羟酸(Mevalonate)处理。细胞在培养箱中以5%C02， 37 °C条件下培养5小时。
培养5小时后的细胞被分为两组， 一组加入终浓度1 pg/mL的25-羟胆固 醇(25-HC)处理；另一组不加(对照)。在荧光显微镜的40倍物镜下观察观察加 入25-羟胆固醇处理后的细胞与未加该化合物处理的细胞的绿色荧光的强度变 化，确定小鼠HMGCR(TMl-8)-EGFP融合蛋白在CHO细胞株中的表达水平及 其降解是否受到25-羟胆固醇的调控。
结果见图2，对照的细胞产生明显的荧光信号，而在加入25-羟胆固醇后荧 光信号明显减弱，说明存在灵敏的降解调控，也说明HMGCR(TMl-8)-EGFP 融合蛋白表达载体在瞬时转染到CHO细胞株后，其生物学活性良好。
该瞬时转染系统可以进一步用于检测其它化合物对 HMGCR(TMl-8)-EGFP融合蛋白的表达调控和降解调控，从而最终获得对于降 胆固醇有用的药物。
实施例3
HMGCR(TMl-8)-EGFP融合蛋白稳定表达系统的构建
本发明构建了 HMGCR(TMl-8)-EGFP融合蛋白稳定表达系统。将 HMGCR(TMl-8)-EGFP融合蛋白重组载体转染CHO细胞系，细胞在含有5%胎 牛血清1 mg/ml G418的DMEM/F12的培养液中培养IO天后，得到单克隆细胞 株；通过荧光显微镜观察，确定HMGCR(TMl-8)-EGFP融合蛋白在单克隆细胞 株中有较高的表达水平，进一步利用活性化合物处理细胞，借助荧光显微镜技 术和蛋白免疫杂交技术，确定HMGCR (TMl-8)-EGFP融合蛋白在单克隆细胞 株中有良好的降解调控。
构建过程如下
(1) 转染细胞前一天，CHO细胞以5X104加入100-mm细胞培养皿，加 入9ml含5%胎牛血清的DMEM/F12完全培养基。
(2) 转染时，将6)LdFuGENE6转染试剂加入到194jal无血清无抗生素的 DMEM/F12培养基中，小心混匀，室温静置5分钟；然后将含有1 pg HMGCR (TMl-8)-EGFP融合蛋白表达质粒的2 (ig质粒DNA (用1 (ig pcDNA3.0表达质 粒补平到2)agDNA)再加入该静置后的混合物中，小心混匀，室温静置15-45 分钟；最后，按照185)al转染试剂/培养皿的量将混合物以逐滴加入的方式均 匀的加入细胞中。
(3) 细胞与质粒在培养箱中以5%C02， 37 °C条件下转染24小时。
(4) 培养24小时后，吸去细胞培养液，用PBS缓冲液(2ml)洗两遍，注 意不要移动细胞，给细胞换上含有5%胎牛血清，1 mg/ml G418的新鲜培养液， 并定时观察细胞的生长状态。
(5) 用含有5%胎牛血清，1 mg/mlG418的培养基处理细胞IO天左右后， 细胞生长形成集落，并在培养皿中稳定生长，用胰酶消化的方法将单克隆转移 到48孔板中继续用含有5%胎牛血清，1 mg/mlG418的培养液培养细胞，当 单克隆长到90%密度时，将一部分细胞保种，另一部分进一步扩大培养，以备 鉴定用。
(6) 通过荧光显微镜直接观察的方法从细胞单克隆中选出荧光强度均一且 亮度较佳的细胞株。
然后，对选出的细胞的HMGCR(TMl-8)-EGFP融合蛋白的表达调控进行鉴 定。步骤如下
借助荧光显微观察方法的单克隆细胞株鉴定
处理前一天将细胞以合适的密度铺在12孔板中，每一株细胞需要3个孔位。
培养24小时后，细胞密度达到60%左右，吸去细胞培养液，用PBS缓冲 液(2ml)洗两遍，注意不要移动细胞，给细胞换上新鲜培养液。
培养16小时后，吸去细胞培养液，用PBS缓冲液(2ml)洗两遍，注意不 要移动细胞，给细胞换上新鲜培养基，采用的新鲜培养基有3种 一种含有乙 醇(对照)；另一种含有1 pg/ml25-羟胆固醇；第三种含有3 (ig/ml羊毛甾醇， 细胞在培养箱中以5%C02， 37℃条件下培养5小时，荧光显微镜镜检，其中 用25-羟胆固醇和羊毛甾醇处理5小时后的细胞，与未加化合物处理的细胞荧 光强度进行比较，绿荧光强度均大大减弱的细胞株说明其HMGCR (TMl-8)-EGFP融合蛋白的表达调控良好。
图3为荧光显微镜观察其中一株细胞在3种培养基中的细胞荧光情况，与 对照相比，25-羟胆固醇和羊毛甾醇的加入使得绿荧光强度大大减弱。
该稳定表达系统可以进一步用于检测其它化合物对 HMGCR(TMl-8)-EGFP融合蛋白的表达调控和降解调控，从而选出对于降胆固 醇有用的药物。
借助蛋白免疫杂交方法的细胞株鉴定
处理前一天将细胞以4X1()S接入60-mm细胞培养皿，每一株细胞需要两 个平行。
培养24小时后，细胞密度达到70%左右，吸去细胞培养液，用PBS缓冲 液(2ml)洗两遍，注意不要移动细胞，给细胞换上新鲜培养液。细胞在培养箱 中以5%CO2， 37 ℃条件下培养16小时。
培养16小时后，吸去细胞培养液，用PBS缓冲液(2ml)洗两遍，注意不 要移动细胞，给细胞换上新鲜培养液，此时新鲜培养基有2种 一种含有乙醇 (对照)；另一种含有1 )ig/ml25-羟胆固醇，10 mM甲戊二羟酸。细胞在培养箱中以5%<:02， 37°C条件下培养5小时，收集细胞，采用RIPA裂解液破碎细 胞，最终获得细胞全蛋白，用抗HMGCR抗体(购自Upstate)和抗绿荧光蛋白抗 体(购自Delta Biolabs)检测25-羟胆固醇对细胞稳定表达的小鼠HMGCR绿荧光 蛋白的降解调控情况。蛋白表达水平高且有显著降解调控的细胞株即可用于作 为HMGCR细胞耙标。
图4为一株细胞在对照培养基和25-羟胆固醇培养基中的HMGCR和EGFP 表达情况，与对照组相比，25-羟胆固醇试验组中HMGCR和EGFP表达量均大
大降低。
通过上述方法和途径最终得到稳定表达高水平HMGCR(TMl-8)-EGFP融
合蛋白且其表达和降解调控系统灵敏的细胞。
实施例4
HMGCR(TMl-8)-Luciferase融合表达载体的构建
本实施例中，制备携带HMGCR(TMl-8)与荧光素酶(Luciferase)融合基因 的融合表达载体。构建方法如下
以pGL3-Basic质粒(购自Promega)为模板，PCR扩增得到编码荧光素酶 蛋白(2-550aa)的核苷酸序列，经BamHI和Xbal连接进入pcDNA3.0;以获得 pCMV-Luciferase质粒。
扩增荧光素酶氨基酸序列所用的引物序列如下
上游引物(SEQIDN0:4，其中下划线为BamHI酶切位点)
5，ATCGGATCCGAAGACGCCAAAAACATAAAGAAAGG 3，；
下游引物(SEQIDNO:5，其中下划线为Xbal酶切位点
5，GCCCCGACTCTAGAATTACACGGC 3，。
PCR扩增的体系如下
上下游引物各 2.0μl;
10x Pfu PCR反应缓冲液 5.0 μl
dNTP 4.0 μl
pGL3-Basic质粒 1.0μl
PfuDNA聚合酶 1ul；
去离子水补至 50ul。
PCR扩增程序如下首先，94 °C预变性4分钟；然后开始循环，94 °C 30 秒，60 °C 30秒，72 °C 2分钟，重复31循环；最后72 °C 10分钟。
琼脂糖凝胶(1%)电泳鉴定PCR产物，然后利用琼脂糖凝胶快速回收 (TIANGEN琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒)。
将具有上述PCR扩增产物在利用BamHI和Xbal酶切后连接入pcDNA3.0 载体的BamHI和Xbal中，构建成荧光素酶表达质粒。
连接体系如下
经BamHI和Xbal酶切的pcDNA3.0载体(0.3 (ig/|il) 0.8 (il; 经胶回收的PCR产物 8.0|ul; T4 DNA Ligase (NEB) 400,000U/ml 0.2 fil;
lOxBuffer for T4 DNA Ligase 1,0 (il;
室温条件下，连接过夜。
将上述获得的连接产物转化大肠杆菌DH12S。挑选大肠杆菌单克隆，提 取质粒，经BamHI和Xbal酶切及Invitrogen公司DNA序列测定实验，结果得 到正确的荧光素酶表达质粒pCMV-Luciferase。
用BamHI酶切实施例1获得的HMGCR(TMl-8)-EGFP融合表达载体，得 到其中编码仓鼠HMGCRN端八次跨膜结构域(l-346aa)的核苷酸序列，连接进 入经BamHI酶切的pCMV-Luciferase质粒中；得到HMGCR-Luciferase融合表
达质粒。
实施例5
HMGCR(TMl-8)-EGFP融合蛋白表达载体瞬时转染系统的构建和药物筛
选
本实施例中，构建HMGC(TMl-8)-Luciferase融合蛋白瞬时表达系统，进 一步利用25-羟胆固醇处理细胞，借助蛋白免疫杂交技术，以确定HMGCR-Luciferase融合蛋白在该系统中有好的降解调控。
操作过程如下
1) 转染细胞前一天，CHO细胞(购自ATCC)以4X105进60-mm细胞培 养皿，加入4ml含5%胎牛血清的DMEM/F12完全培养基，培养过夜。
2) 转染时，将6inlFuGENE6转染试剂加入到194fil无血清无抗生素的 DMEM/F12培养基中，小心混匀，室温静置5分钟；然后将1 pg HMGCR(TMl-8)-Luciferase融合表达质粒和100 ng人Insig-l表达质粒 pCMV-Insig-l(构建如下以常规方法获得的人基因组cDNA为模板，以 5，ATCGGATCCAATGCCCAGATTGCACGACCA 3， (SEQ ID NO: 6);
5'ATCGGATCCtcaatcactatggggcttttcaggaa 3， (SEQ ID NO: 7)为引物PCR扩增 获得编码人Insig-l全长的基因序列，以BamHI酶切后连接入pcDNA3.0载体 的BamHI酶切位点内，构建成人Insig-l表达质粒pCMV-Insig-1)加入该静置 后的混合物中，小心混匀，室温静置15-45分钟；最后，按照185)a1转染试剂 /培养皿的量将混合物以逐滴加入的方式均匀的加入细胞中。
3) 细胞与质粒在培养箱中以5%C02， 37 °C条件下转染8小时。
4) 培养8小时后，吸去细胞培养液，用PBS缓冲液(2ml)洗两遍，注意 不要移动细胞，给细胞换上新鲜培养液，细胞在培养箱中以5%C02， 37 °C条 件下培养16小时。
5) 培养16小时后，吸去细胞培养液，用PBS缓冲液(2 ml)洗两遍，注 意不要移动细胞，给细胞换上新鲜培养液，用乙醇(对照)或1 Mg/ml25-羟胆固 醇以及10mM甲戊二羟酸处理。细胞在培养箱中以5%C02， 37 °C条件下培 养5小时。
6) 培养5小时后，收集细胞，采用RIPA裂解液破碎细胞，最终获得细胞全 蛋白，用抗荧光素酶抗体(购自ABCAM)检测25-羟胆固醇对细胞瞬时表达的 HMGCR(TMl-8)-Luciferase蛋白的降解调控情况，结果表明该融合蛋白在瞬时 转染系统中正常表达且25-羟胆固醇对其有显著降解调控。
图5为细胞在对照培养基和25-羟胆固醇培养基中的HMGCR(TMl-8) —Luciferase蛋白水平，与对照相比，25-羟胆固醇中HMGCR(TM1-8) —Luciferase
蛋白量有明显降低。20
该瞬时转染系统可以进一步用于检测其它化合物对HMGCR(TMl-8)-Luciferase融合蛋白的表达调控和降解调控，从而选出对于降 胆固醇有用的药物。
综上，HMGCR(TMl-8)-EGFP融合蛋白表达系统与HMGCR(TMl-8)-EGFP融合蛋白表达系统均能够较好地反映候选物质对于HMGCR的降解调控作用； 并且，HMGCR(TMl-8)-EGFP融合蛋白的效果最佳、最灵敏，且更易于实验操作和观察。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献 被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申 请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110>中国科学院上海生命科学研究院
<120〉 一种以羟甲基戊二酰辅酶A还原SI为耙点的胆固醇代谢调控药物筛选系统及方法 <130> 073424 <160〉 7
<170〉 Patentln version 3.3
<210〉1
<211>346
<212〉 PRT
<213〉仓鼠
<400> 1
<formula>see original document page 22</formula>
<sequence>see original document page 23</sequence><210〉 2 <211〉 27 <212〉, <213〉 人T序列
<220>
<221〉 misc一feature <223〉 引物
<400〉 2
<sequence>see original document page 23</sequence>
<210〉 3
<211〉 27
<212> DNA <213>人工序列
<400〉 3
<sequence>see original document page 23</sequence>
<210〉 4
〈211〉 35
<212〉 DNA
<213〉 人工序列
〈220〉
<221〉 misc—feature <223> 引物
<400〉 4
<sequence>see original document page 23</sequence><210〉 5
<211〉 24
<212〉 DNA
<213> 人T序列
<220〉
<sequence>see original document page 23</sequence>
<221〉 misc一feature
<223〉 引物
〈400〉 5
gccccgactc tagaattaca cggc 24
<210〉 6
<211> 30
<212〉 DNA <213〉人工序列
<220〉
<221〉 misc—feature
<223〉 引物
<400〉 6
atcggatcca atgcccagat tgcacgacca 30
<210〉 7
<211〉 35
<212〉 DNA
<213〉 人工序列
<220〉
<221〉 misc—feature
<223〉 引物
<400〉 7
atcggatcct caatcactat ggggcttttc aggaa3权利要求
1.一种融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白包括(a)羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的八次跨膜结构域；(b)可检测信号元件；和(c)任选的位于(a)和(b)之间的连接元件。
2. 如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的羟甲基戊二酰辅酶 A还原酶的八次跨膜结构域具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列同源性超过70%。
3. 如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的可检测信号元件选 自荧光蛋白、荧光素酶、半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、抗体可识别的短肽。
4. 一种核酸分子，其特征在于，(i) 所述的核酸分子编码权利要求1所述融合蛋白；或(ii) 所述的核酸分子与(i)所述的核酸分子相互补。
5. —种载体，其特征在于，它含有权利要求4所述的核酸分子。
6. —种基因工程化的细胞，其特征在于，所述的细胞含有权利要求5所述 的载体；或所述的细胞基因组中整合有权利要求4所述的核酸分子。
7. 权利要求l所述的融合蛋白的用途，其特征在于，用于筛选调节胆固醇 的物质。
8. —种筛选以羟甲基戊二酰辅酶A还原酶为靶点的调节胆固醇的潜在物质 的方法，其特征在于，所述方法包括步骤(a)将候选物质与权利要求6所述的细胞接触；(b)观察候选物质对细胞中可检测信号的影响；其中，若所述候选物质可降低所述细胞中的可检测信号的水平，则表明该候 选物质是降胆固醇的潜在物质；若所述候选物质可提高所述细胞中的可检测信号的水平，则表明该候选物质 是提高胆固醇的潜在物质。
9. 如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(a)包括在测试组中，在权利要求6所述的细胞的培养物中添加候选 物质；禾口/或步骤(b)包括检测测试组的细胞中的可检测信号的水平，并与对照组比较， 其中所述的对照组是不添加所述候选物质的权利要求6所述的细胞。
10. 如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括步骤对获 得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以选出对于调节胆固醇 有效的物质。
全文摘要
本发明公开了一种以羟甲基戊二酰辅酶A还原酶为靶点的调节胆固醇药物的筛选系统，所述系统是细胞系统，是通过将羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的氨基端蛋白片段与可检测信号元件连接并导入到细胞，使细胞表达融合蛋白构成的。所述系统可用于筛选以羟甲基戊二酰辅酶A还原酶为靶点的调节胆固醇的物质。
文档编号G01N33/68GK101343326SQ200710043800
公开日2009年1月14日 申请日期2007年7月13日 优先权日2007年7月13日
发明者唐静洁, 宋保亮 申请人:中国科学院上海生命科学研究院