专利名称：一种骨骼肌横纹的切片染色方法
技术领域：
本发明涉及一种骨骼肌横纹的切片染色方法，属于生物制片技术领域。
背景技术：
骨骼肌组织切片在组织学、病理学、生物学等的教学过程中占有举足轻重的地位，在教学过程中需求量大，是一项非常复杂烦琐的技术，而且对技术的要求是非常严格的。
制片过程中染色方法是显示骨骼肌横纹的关键一步。目前用于骨骼肌的染色方法主要有光镜下、荧光显微镜下及电镜观察的三大类染色方法。用于荧光显微镜和电镜下观察的染色方法根据其自身的作用已能够清晰地显现组织细胞的形态，而且染色方法比较多，如TUNEL等。但是这两大类的染色方法制片花费的价格比较昂贵，而且要求的硬件设施比较高，像中学、一般高等院校根本就达不到这种要求。
适用于光学显微镜而且目前使用最广泛的染色方法就是HE染色。但是HE染色制片的工作流程非常烦琐(邴鲁军，高英茂，郭雨荠，张晓丽提高组织学实验教学石蜡切片质量的技术[J].实验室探索，2004，23(12)152-153.)，纵切能够显示骨骼肌横纹，但是横纹比较细小，而且质量不高。对于大批量生产还需从中筛选，就更增加了工作量。
发明内容
本发明所要解决的问题是提供一种骨骼肌横纹的切片染色方法，经本发明处理的骨骼肌切片能够显示清晰的骨骼肌横纹，适合大批量生产。
本发明提供的技术方案是一种骨骼肌横纹的切片染色方法，取骨骼肌放入固定液中，固定4-6小时后将骨骼肌切成3-5毫米的组织块，然后再放入固定液中固定8-18小时；取出骨骼肌组织块流水冲洗后置于过锰酸钾苏木精染液染色10-12天，然后用70％酒精浸泡(即分色)15-30分钟，流水冲洗20-30小时，逐级从70％酒精、80％酒精、90％酒精各液各历时2小时，再放入伊红染液染色2-3天；将骨骼肌组织块入95％酒精，100％酒精脱水各2个小时；将骨骼肌组织块浸入二甲苯透明处理14-16小时后入软蜡浸2次，每次40-60分钟；硬蜡浸2次，每次40-60分钟；石蜡包埋后得到的蜡块用切片机切成4-6微米厚的蜡带；将蜡带分剪成0.8-1厘米长的蜡片贴到载玻片上；贴片后用二甲苯脱蜡20-30分钟后加热至二甲苯完全挥发，待贴片干燥后用中性树胶封片。
上述固定液为由无水酒精、蒸馏水和硝酸组成的硝酸固定液，其中无水酒精、蒸馏水和硝酸的用量体积比为100∶16∶4。
上述过锰酸钾苏木精染色液由苏木精、高锰酸钾、硫酸铝钾和蒸馏水组成，其中苏木精、高锰酸钾、硫酸铝钾和蒸馏水的用量重量比为0.11∶0.102∶5∶100。
上述伊红染色液由95％酒精和伊红组成，其中每100ml酒精含有0.25g伊红。
经本发明处理的骨骼肌切片能够显示清晰的骨骼肌横纹，成功率高，适合大批量生产。
图1为本发明实施例1处理得到的骨骼肌切片的显微照片。
图2为本发明实施例2处理得到的骨骼肌切片的显微照片。
图3为本发明实施例3处理得到的骨骼肌切片的显微照片。
具体实施例方式
制作方法如下1.试剂的配制固定液配制将100％酒精100ml、蒸馏水16ml和硝酸4ml混合得到固定液。
苏木精染液的配制将苏木精0.11g、高锰酸钾0.102g、硫酸铝钾5g和蒸馏水100ml混合得到苏木精染液。
伊红染液的配制将95％酒精100m和伊红0.25g混合得到伊红染液。
2.取材和固定将活的动物杀死(或者刚死的动物)，迅速取大腿处的骨骼肌，立即放入固定液中，固定时数为12-24小时(在固定4小时后取出骨骼肌切成3-5毫米的组织块，然后放入固定液中固定)。
3.冲洗流水冲洗24小时。
4.染色将骨骼肌入过锰酸钾苏木精染液，块染10-12天。然后用70％酒精分色15-30分钟，流水冲洗20-30小时，逐级从70％酒精、80％酒精、90％酒精各液历时2小时，然后入伊红染色2-3天。
5.脱水骨骼肌入95％酒精，100％酒精脱水各2个小时。
6.透明骨骼肌入二甲苯透明14-16小时。
7.浸蜡和包埋骨骼肌入软蜡浸2次，每次40-60分钟；硬蜡浸2次，每次40-60分钟；常规石蜡包埋。
8.切片用切片机将蜡块切成4-6微米厚的蜡带。
9.贴片和烤片将蜡带剪成0.8-1厘米长的蜡片，用小玻棒蘸取蛋白甘油，滴于一干净的载玻片上，用手指涂抹均匀，并加几滴蒸馏水于载玻片上，用小镊子夹取蜡片轻放在载玻片的水面上再把载玻片放在展片台上(温度约为45摄氏度)。待蜡片受热完全展平后，倾去载玻片上多余的水分，用解剖针将蜡片位置拨正，然后将其置于50摄氏度左右的恒温箱中烤干。
10.脱蜡切片经二甲苯脱蜡2次，各20-30min。
11.封片将从二甲苯中取出的切片放在酒精灯上加热至二甲苯完全挥发，待切片干燥后用中性树胶封片。
然后就可在显微镜下观察。
实施例1取牛蛙骨骼肌放入固定液中，固定4小时后取出骨骼肌并切成5毫米的组织块，再放入固定液固定20小时。流水冲洗后置于过锰酸钾苏木精染液染色12天，然后用70％酒精分色30分钟，流水冲洗24小时，逐级从70％酒精、80％酒精、90％酒精各液各历时2小时，然后入伊红染液染色3天。骨骼肌组织块入95％酒精、100％酒精脱水各2个小时，入二甲苯透明16小时后入软蜡浸2次，每次60分钟左右，共2小时；硬蜡浸2次，每次60分钟左右，共2小时。常规石蜡包埋。用切片机将蜡块切成5微米厚的蜡带。将蜡带分剪成0.8-1厘米长的蜡片贴到载玻片上，贴片后经二甲苯脱蜡2次，各25min，从二甲苯中取出的贴片放在酒精灯上加热至二甲苯完全挥发，待贴片干燥后用中性树胶封片，显微镜下(参见图1)观察结果显示，经本发明处理的骨骼肌切片能够显示清晰的骨骼肌横纹。
实施例2取牛蛙骨骼肌放入固定液中，固定6小时后取出骨骼肌并将组织切成3毫米的块状，再放入固定液固定6小时。流水冲洗后置于过锰酸钾苏木精染液染色10天，然后用70％酒精分色15分钟，流水冲洗20小时，逐级从70％酒精、80％酒精、90％酒精各液各历时2小时，然后入伊红染液染色2天。骨骼肌组织块入95％酒精、100％酒精脱水各2个小时，入二甲苯透明14小时后入软蜡浸2次，每次45分钟；硬蜡浸2次，每次45分钟。常规石蜡包埋。用切片机将蜡块切成6微米厚的蜡带。将蜡带分剪成0.8-1厘米长的蜡片贴到载玻片上，贴片后经二甲苯脱蜡2次，各20min，从二甲苯中取出的贴片放在酒精灯上加热至二甲苯完全挥发，待贴片干燥后用中性树胶封片，显微镜下(参见图2)观察结果显示，经本发明处理的骨骼肌切片能够显示清晰的骨骼肌横纹。
实施例3取牛蛙骨骼肌放入固定液中，固定5小时后取出骨骼肌切成4毫米的组织块，再放入固定液固定15小时。流水冲洗后置于过锰酸钾苏木精染液染色10天，然后用70％酒精分色20分钟，流水冲洗25小时，逐级从70％酒精、80％酒精、90％酒精各液各历时2小时，然后入伊红染液染色3天。骨骼肌组织块入95％酒精、100％酒精脱水各2个小时，入二甲苯透明15小时后入软蜡浸2次，每次40分钟；硬蜡浸2次，每次60分钟。常规石蜡包埋。用切片机将蜡块切成4微米厚的蜡带。将蜡带分剪成0.8-1厘米长的蜡片贴到载玻片上，贴片后经二甲苯脱蜡2次，各30min，从二甲苯中取出的贴片放在酒精灯上加热至二甲苯完全挥发，待贴片干燥后用中性树胶封片，显微镜下(参见图3)观察结果显示，经本发明处理的骨骼肌切片能够显示清晰的骨骼肌横纹。
权利要求
1.一种骨骼肌横纹的切片染色方法，取骨骼肌放入固定液中，固定4-6小时后将骨骼肌切成3-5毫米的组织块，然后再放入固定液中固定8-18小时；取出骨骼肌组织块流水冲洗后置于过锰酸钾苏木精染液染色10-12天，然后用70％酒精浸泡分色15-30分钟，流水冲洗20-30小时，逐级从70％酒精、80％酒精、90％酒精各液各历时2小时，再放入伊红染液染色2-3天；将骨骼肌组织块入95％酒精，100％酒精脱水各2个小时；将骨骼肌组织块浸入二甲苯透明处理14-16小时后入软蜡浸2次，每次40-60分钟；硬蜡浸2次，每次40-60分钟；石蜡包埋后得到的蜡块用切片机切成4-6微米厚的蜡带；将蜡带分剪成0.8-1厘米长的蜡片贴到载玻片上；贴片后用二甲苯脱蜡20-30分钟后加热至二甲苯完全挥发，待贴片干燥后用中性树胶封片。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述固定液为由无水酒精、蒸馏水和硝酸组成的硝酸固定液，其中无水酒精、蒸馏水和硝酸的用量体积比为100∶16∶4。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述过锰酸钾苏木精染色液由苏木精、高锰酸钾、硫酸铝钾和蒸馏水组成，其中苏木精、高锰酸钾、硫酸铝钾和蒸馏水的用量重量比为0.11∶0.102∶5∶100。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述伊红染色液由95％酒精和伊红组成，其中每100ml酒精含有0.25g伊红。
全文摘要
本发明涉及一种骨骼肌横纹的切片染色方法，取骨骼肌放入固定液中，固定4－6小时后将骨骼肌切成3－5毫米的组织块，然后再放入固定液中固定8－18小时；取出骨骼肌组织块流水冲洗后置于过锰酸钾苏木精染液染色10－12天，然后用70％酒精浸泡15－30分钟，流水冲洗，逐级从70％酒精、80％酒精、90％酒精各液各历时2小时，再放入伊红染液染色；将骨骼肌组织块入95％酒精，100％酒精脱水各2个小时；将骨骼肌组织块浸入二甲苯透明处理后入软蜡浸2次；硬蜡浸2次；石蜡包埋后得到的蜡块用切片机切成4－6微米厚的蜡带；将蜡带分剪成0.8－1厘米长的蜡片贴到载玻片上；贴片后用二甲苯脱蜡后加热至二甲苯完全挥发，待贴片干燥后用中性树胶封片。本发明能够显示清晰的骨骼肌横纹，成功率高，适合大批量生产。
文档编号G01N33/48GK101042317SQ20071005199
公开日2007年9月26日 申请日期2007年4月27日 优先权日2007年4月27日
发明者刘红云, 张静, 张明星 申请人:孝感学院