专利名称：甘蔗斐济病毒检测方法
技术领域：
本发明涉及一种新的甘蔗斐济病毒检测方法。
背景技术：
甘蔗斐济病是一种病毒引起的甘蔗病害，该病害在澳大利亚、斐济、印尼、 马来群岛、泰国等国家和地区发生，造成甘蔗生产较大的经济损失。近年来， 云南省农业科学院甘蔗研究所与澳大利亚、法国、菲律宾等多个国家开展国际 合作项目，并从国外引进优良的甘蔗品种、材料。目前甘蔗斐济病在我国还未 见发生的报道，但是为了防止该病害随从国外引进的甘蔗品种、材料传入我国， 对我国的甘蔗生产造成威胁，有必要开展甘蔗斐济病毒的检测方法研究。目前，国外对甘蔗斐济病毒的检测方法主要有酶联免疫吸附测定、生理生 化测定等，但是，这些方法在检测时间、灵敏度、稳定性等方面存在一些不足, 检测特异性不强。
发明内容
本发明的目的是提出一种甘蔗斐济病毒检测方法，该方法能有效提高甘蔗 斐济病毒的快速检测，使检测更准确、灵敏，检测特异性更强。 本发明包括以下步骤1、 采用Qiagen RNeasy试剂盒提取甘蔗斐济病毒检测样本中的模板RNA;2、 利用甘蔗斐济病毒的特异性引物进行反转录聚合酶链式反应(RT-PCR);3、 用琼脂糖凝胶电泳扩增检测反应产物，出现目标电泳条带即可确定检测 样本中有甘蔗斐济病毒存在，所说的目标电泳条带是指450碱基对(bp)处。本发明的反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测方法克服了酶联免疫吸附 测定、生理生化测定等现有检测方法花费时间较长，灵敏度、稳定性较差，检 测特异性不强等不足，大大提高了检测效率和检测的准确性。
具体实施例方式本发明的方法步骤是a、用Qiagen RNeasy试剂盒提取检测样本中的模板RNA:1、 取100mg甘蔗叶组织于研钵；2、 加入液氮2-3提研磨后轻轻转移于1.5ml离心管；3、 加450plRLT缓冲液(Buffer RLT),激烈振荡；4、 12000 rpm离心2min，弃沉淀；5、 小心转移上清液于另一个新的1.5ml离心管，加入等倍体积浓度为 96%-100%的乙醇，立即混匀；6、 12000 rpm离心15s， 弃液体；7、 加700jnl RW1缓冲液(Buffer RW"， 12000 rpm离心15s，弃液体；8、 加500plRPE缓冲液(Buffer RPE)， 12000 rpm离心15s,弃液体；9、 加500nlRPE缓冲液(Buffer RPE)， 12000 rpm离心2 min;10、 加50pl无RNA酶水(RNase-free water), 12000 rpm离心lmin，弃液体；11、 加20-200pl灭菌超纯水于RNA中，于-2(TC保存备用。b、用甘蔗斐济病毒的特异性引物进行反转录聚合酶链式反应体系及参数反应体系总混合物l:引物1: FDV7F(20pM) 0.25^1 引物2: FDV7R(20nM) 0.25pl 灭菌水(H20) 10.50^1 模板(Template) l.Opl 总量Total 12.0^1 总混合物2:5x缓冲液(buffer) 5^1 10%聚乙烯吡咯烷酮(PVP) 2.5^1 lOOmM 二硫代苏糖醇DTT L25pl 100%二甲基亚砜DMSO 1.25pl50/o牛清白蛋白BSA l.Opl 20mM三磷酸脱氧核糖核苷酸(dNTPs)混合液 l.Opl C.Awm聚合酶 l.Ofil 总量(Total) 13.0^11、 总反应体积为25^ll;2、 准备总混合物1，加模板和20pl矿物油，然后加热到99。C变性RNA 2min; 3、 立即将试管放到O'C以下冰上；4、 保持试管在O'C以下冰上，加总混合物2，立即进行聚合酶链式反应(PCR) 反应。反应参数1 cycle 57°C 30min 1 cycle 95 。C 2min35 cycles 95。C lmin， 57°C lmin， 72°C lmin 1 cycle 72 。C 8minc、反应产物经电泳检测用1-2%琼脂糖凝胶电泳对反应产物进行扩增检测，并用凝胶成像分析系统 观察拍照电泳照扩增结果。
权利要求
1、 一种甘蔗斐济病毒检测方法，包括以下步骤1) 、用Qiagen RNeasy试剂盒提取检测样本中的模板RNA;2) 、用甘蔗斐济病毒的引物进行反转录聚合酶链式反应；3) 、反应产物经电泳检测，目标电泳条带出现即可确定检测样本中有甘蔗 斐济病毒存在。
2、 根据权利要求1所述的甘蔗斐济病毒检测方法，其特征是进行反转录聚 合酶链式反应的引物为甘蔗斐济病毒特异性引物。
3、 根据权利要求1所述的甘蔗斐济病毒检测方法，其特征是采用琼脂糖凝 胶电泳检测反应产物，目标电泳条带出现在450碱基对(bp)处。
全文摘要
一种甘蔗斐济病毒检测方法，该方法能有效提高甘蔗斐济病毒的快速检测，使检测更准确、灵敏，检测特异性更强，包括以下步骤1.采用Qiagen RNeasy试剂盒提取甘蔗斐济病毒检测样本中的模板RNA；2.利用甘蔗斐济病毒的特异性引物进行反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)；3.用琼脂糖凝胶电泳扩增检测反应产物，出现目标电泳条带即可确定检测样本中有甘蔗斐济病毒存在，所说的目标电泳条带是指450碱基对(bp)处；本发明的反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测方法克服了酶联免疫吸附测定、生理生化测定等现有检测方法花费时间较长，灵敏度、稳定性较差，检测特异性不强等不足，大大提高了检测效率和检测的准确性。
文档编号G01N27/447GK101144793SQ20071006632
公开日2008年3月19日 申请日期2007年10月29日 优先权日2007年10月29日
发明者卢文洁, 李文凤, 范源洪 申请人:云南省农业科学院甘蔗研究所