评估肽混合物的方法

专利名称：评估肽混合物的方法
技术领域：
本公开主题概括地涉及表征肽、肽混合物和多肽混合物的方法。更加具 体地说，本公开主题涉及表征包含谷氨酸、丙氨酸、酪氨酸和赖氨酸的复杂
肽或多肽混合物(complex peptide or polypeptide mixture)的方法,这些方法包 括但不限于鉴定、分离、定量和纯化氨基酸、肽、多肽和它们的组合，其 在至少一端取代羧基而存在二乙酰胺基(diethylamide group)。
背景技术：
"共聚物-l (Copolymer-l)"是通过聚合谷氨酸、丙氨酸、酪氨酸和赖氨 酸而制备的多肽的复杂混合物。共聚物-1又叫做醋酸格拉默(Glatiramer acetate) (CAS No. 147245-92-9)，它具有以下结构式
(Glu, Ala， Lys， Tyr)x XCH3COOH (C5H9N04.C3H7N02.C6H14N202.C9HuN03)x 'XC2H402 请参考尸/z戸."'a" 's jD&s& i e/ere"ce, Thomson PDR， Montvale， New Jersey, 第3297页(2007)。
醋酸格拉默(GA)是COPAXONE (Teva Pharmaceutical Industries Ltd" Israel)的活性成份，其包含合成多肽的醋酸盐，所述合成多肽包含四种天然 存在的氨基酸L-谷氨酸、L-丙氨酸、L-酪氨酸和L-赖氨酸，其有报道的平 均摩尔分数(average molar fraction)分别为0.141、 0.427、 0.095和0.338 (出处 同前)。醋酸格拉默已经被广泛用于治疗多发性硬化，临床上显示它能降低 患有复发-緩角年型多发性硬化(relapsing-remitting form of multiple sclerosis; RRMS)的人中的平均复发率(average relapse)。
能够用于表征醋酸格拉默的分析试验有利于限定这种复杂肽混合物和 类似肽混合物的结构。这些分析方法同样也可用于分析某一特定批次混合物 的特性或者品质，用于分析制备醋酸格拉默过程中的中间状态，或者鉴定并 分离复杂混合物中的生物活性成份或制备这样的复杂混合物过程中的特征 成份(signature component)。因此，在技术领域中需要能够用于表征醋酸格拉默及类似复杂肽混合物的分析试验。本公开主题全部或者部分地满足了诸如 此类的技术要求。
发明筒述
在一些实施方式中，本公开主题提供用来检测样品中 一种或多种氨基
酸、肽、多肽链和它们的组合的至少一个C-末端修饰的方法，所述方法包括 (a)提供可能包含具有至少一个修饰的C-末端的一种或多种氨基酸、肽、多 肽链和它们的组合的样品；(b)通过能够检测样品中氨基酸、肽、多肽链和它 们的组合的至少一个C-末端处的修饰的方法来分析样品。样品可以是多肽混 合物，包含但不限于共聚物-1或其聚合物前体(例如

图1所示的中间物I、 II、 III)、衍生化的共聚物-1或其聚合物前体、断裂的(fragmentated)共聚物-l或 其聚合物前体、分级的共聚物-1 (fractionated Copolymer-l)或其聚合物前体， 以及它们的组合。
所述对于至少 一个C-末端的修饰可以包括在所述样品里的 一种或多种 氨基酸、肽、多肽链和它们的组合的至少一个C-末端结合了二乙酰胺部分。 能够检测样品中 一种或多种多肽链的至少 一个C-末端的修饰的方法包括但 不限于液相层析、离子层析、气相层析、毛细管电泳、质谱、液相层析/ 质谱、核磁共振谱、抗体检测方法、拉曼光谱、红外光谱、荧光光镨、紫外 -可见光光谱、凝胶电泳及这些方法的组合。本文公开的方法也包括对所述 样品进行解聚或断裂(fragmenting),分级样品，和纯化样品。
在一些实施方式中，本文公开的主题提供用于评估包含多肽混合物的样 品的方法，所述方法包括(a)提供包含多肽混合物的样品，其中一种或多种 多肽可能含有结合于其C-末端的二乙酰胺部分；(b)当样品中存在一种或多 种多肽含有结合在C-末端的二乙酰胺部分时，解聚所述样品以从其C-末端 结合了二乙酰胺部分的一种或多种多肽释放二乙胺；和(c)分析解聚后的样 品，以测定从中释放的二乙胺存在或量。
检测二乙胺的方法包括但不限于气相层析(GC)、气相层析-质谱 (GC-MS)、高效液相层析(HPLC)、液相层析-质谱(LC-MC)、核磁共振(画R)、 抗体;^测方法、拉曼光谱、毛细管电泳、液相层析、气相层析和离子层析， 或者在一些实施方式中，所述方法进一步包括将释放的二乙胺用生色团衍生 化以形成衍生化的二乙胺，并通过高效液相层析来检测所述衍生化的二乙胺。
在一些实施方式中，本文公开的主题提供检测共聚物-l样品的方法，所
述方法包括(a)提供共聚物-l样品，其中所述共聚物-1样品可能包含其C-末端结合了二乙酰胺部分的一种或多种多肽；(b)测定所述共聚物-l样品中在 其C-末端结合了二乙酰胺部分的多肽的存在或量。
在一些实施方式中，所述方法进一步包括将共聚物-1样品中其C-末端 结合了 二乙酰胺部分的多肽的量与预先决定的参考数值做比较，其中所述参 考数值包括但不限于规范值(specification value)、对照值(control vakie)和直 接测量参考共聚物-1样品得到的数值，所述参考共聚物-1样品例如醋酸格拉 默或者其聚合物前体(例如图1所示的中间物I、 n和m之一)。
本文公开的主题的特定方面已经在上文有所说明，这些方面由本文公开 的主题全部或部分地涉及，随着进一步的描述，并联系接下来详细描述的所 附实施例和附图，将会更加清楚地展示本文公开的主题的其他方面。
附图简述
在以概括的方式描述了本文公开的主题后，接下来将参考附图进行说 明，这些附图不必按照比例绘制，其中
图l是非限定性图，其描绘用于产生共聚物-1,即，醋酸格拉默的典型 方法；
图2是非限定性图，其描绘代表性的步骤，即用蛋白酶(例如谷氨酸内 切酶(Glu-C))进行的对多肽的消化，和根据本文公开主题的一个实施方式所 述的肽分离过程，其中分离并分析C-末端羧基被二乙酰胺基取代的肽；
图3是非限定性图，其描绘C-末端羧基被二乙酰胺基取代的氨基酸，如 丙氨酸；
图4是纯化多肽(例如醋酸格拉默)的方法的非限定性图，所述多肽在C-末端的氨基酸的羧基被二乙酰胺基取代；
图5是非限定性图，其描绘丙氨酸-丙氨酸(Ala-Ala)二肽样品的600 MHz 一维核磁共振氢谱(600 MHz ID NMR spectrum),其中 一个丙氨酸C-末端 羧基被二乙酰胺基取代；
图6是非限定性图，其描绘醋酸格拉默(GA)样品的600 MHz—维核磁 共振氬语(600 MHz IDNMR spectrum)。插入小图展现的是以C-末端二乙酰胺部分的曱基共振(resonances)为中心的扩展图7是非限定性图，其描绘经过局部基线修正(local baseline correction) 和所选信号积分(integration of selected signals)之后醋酸格拉默样品的一维核 》兹共振氢谱(1D 'HNMR spectrum);
图8A和8B是非限定性图，其描绘通过共聚物-1样品的裂解产生的二 乙胺的代表性串联质谱(MS/MS)裂解模式(fragmentation pattern);
图8A是二乙胺的代表性串联质谱(MS/MS)裂解模式的非限定性图8B是与通过共聚物-1样品的源内裂解(in-source fragmentation)产生的 二乙胺具有同样质量(mass)离子的图。
发明详述
本文公开的主题将在下文参考附图进行更全面的描述，其中将展现本文 公开的主题中的部分而非全部的实施方式。本领域的技术人员会意识到本文 描述的本公开主题的许多修正和其他实施方式，对于他们来说本文公开的主 题在前文的描述和相关的附图中呈现的教导仍然是有益的。因此，应该理解 本文公开的主题不仅仅局限于所阐述的具体实施方式
，而应该将所述修饰和 其它实施方式也包括在附加权利要求中。虽然在此使用了一些特定的术语， 但是它们具有普遍性和描述性，而不具有限制性。
本申请包括权利要求中所使用的术语" 一种/一个(a/an)"和"所述/该(the)" 指的是一个或多个/一种或多种(oneormore)'即包括单数和复数。因此，举 例来说，涉及"(一种)样品，，(asample)时包括复数个样品的情况，除非上下 文明确指出相反的情况(如多个样品)，其他情况依次类推。
在本说明书和权利要求书的全文中，使用的词语"包含 (comprise/comprises)"和"包含的(comprising)"是开i丈性的(non-exclusive), 除非上下文有特殊说明。
所有公开文献、专利申请、专利和其他参考资料全部通过题述全文并入， 除非另有说明，均与将各篇单独的公开文献、专利申请、专利和其他参考资 料特定地和单独地通过题述并入的范围相同。需要理解的是，虽然本文涉及 许多专利申请、专利和其他参考资料，但是并不表明承认任何这些文件形式
成为本技术领域里公知常识。
I.总则(general consideration)本文公开的方法可用于表征一种或多种肽、肽混合物和/或多肽混合物， 包括但不限于共聚物，例如包含由丙氨酸、谷氨酸、酪氨酸和赖氨酸组成的
各种多肽(a heterogeneous population of polypeptides)的多肽混合物，例如,共 聚物-1,在此处又称为醋酸格拉默，或其他具有类似性质的多肽混合物。此 处所讲的"多肽，，是指包含以酰胺键相结合的氨基酸残基的聚合物，该酰胺 键通常被称为肽键。肽键是由一个氨基酸C-末端的羰基和另外一个氨基酸 N-末端的氮基团(nitrogen group)形成。当许多氨基酸通过这些肽键连接时即 形成多肽。此处使用的术语"混合物"，例如用在短语"多肽混合物"中的 "混合物"，在一些实施方式中指的是包含L-谷氨酸、L-丙氨酸、L-酪氨酸 和L-赖氨酸的氨基酸共聚物的混合物。
此处使用的"共聚物"、"氨基酸共聚物"或者"氨基酸共聚物制备物" 指的是多肽的各种(heterogeneous)混合物，这些多肽由指定数量的不同氨基 酸组成(通常由2-10种，例如3-6种不同氨基酸组成)。可以通过聚合单独的 氨基酸产生共聚物，或者可以重组产生共聚物。术语"氨基酸"不限于天然 存在的氨基酸，也可以包括氨基酸衍生物和/或氨基酸类似物(analogs)。例如， 在包含酪氨酸的氨基酸共聚物中，一个或多个氨基酸可以是高酪氨酸 (homotyrosine)。进一步说，具有一个或多个在两相邻氨基酸残基间形成的非 肽键(non-peptide bonds)或者拟肽键(peptidomimetic bonds)的氨基酸共聚物也 属于此定义范围。就所述混合物中的每种多肽的分子量而言，共聚物通常具 有不均匀性。
在本发明的一种实施方式中，氨基酸共聚物是多肽的混合物，这些多肽 包含氨基酸Y、 E、 A和K, Y、 F、 A和K, V、 Y、 A和K, V、 W、 A和 K， V、 E、 A和K或F、 E、 A和K。在本发明的另 一种实施方式中，氨基 酸共聚物包含四种不同的氨基酸，它们分别来自下面四组之一(a)赖氨酸和 精氨酸；(b)谷氨酸和天冬氨酸；(c)丙氨酸和甘氨酸；(d)酪氨酸和色氨酸。 根据本发明的这个实施方式的特定共聚物包含多肽的混合物，所述多肽包含 丙氨酸、谷氨酸、赖氨酸和酪氨酸。在一种实施方式中，共聚物包含由氨基 酸Y、 E、 A和K组成的多肽的混合物，又称做共聚物-1 (Cop l)或者醋酸格 拉默。在另一种实施方式中，氨基酸共聚物包含三种不同的氨基酸，每种氨 基酸分别来自前文所说的(a)到(d)组中的三个之一，例如Y、 A、和K, Y、 E、和K, K、 E和A，或者Y、 E、和A。在另外一种实施方式中，氨基酸共聚物包含的氨基酸包括但不限于丙
氨酸-谷氨酸-赖氨酸-酪氨酸-丙氨酸(AEKYA)、丙氨酸-谷氨酸-赖氨酸-缬氨 酸-丙氨酸(AEKVA)，.丙氨酸-谷氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-丙氨酸(AEKFA)、丙 氨酸-赖氨酸-酪氨酸-丙氨酸-谷氨酸(AKYAE)、谷氨酸-丙氨酸-赖氨酸-酪氨 酸-丙氨酸(EAKYA)、丙氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-谷氨酸(AKVAE)、和谷 氨酸-丙氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸(EAKVA)、丙氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-丙 氨酸-谷氨酸(AKFAE)和谷氨酸-丙氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-丙氨酸(EAKFA)。
肽混合物。在用于产生醋酸格拉默的一些方法中，例如图l提供的非限定性 反应方案，以及在本领域已知的相关方法中，在所述生产制备过程中会形成 二乙酰胺基。在许多方法中，通过二乙胺的加入启始L-丙氨酸、L-谷氨酸、 L-酪氨酸和L-赖氨酸的N-羧酸酐(N-carboxyanhydrides)的共聚作用。不希望 受到任一特定理论的限制，认为在这种方法中，二乙胺共价结合至C-末端的 羧酸(在此之后将其称作二乙酰胺基或部分)，并且因为在原本会存在羧基的 位置(where a carboxyl group otherwise would be present)形成了酰胺键而保持 与受到保护的多肽的多肽链末端结合。在其一端的羧基被二乙酰胺基取代的 氨基酸或多肽链在此处分别称做"修饰的氨基酸"或"务饰的大分子链"。
二乙酰胺基可以由用于产生醋酸格拉默的四种氨基酸中的任何一种生 成。将链解聚，例如，通过氢溴酸/乙酸的解聚，然后除去保护基团，并且进 行透析或者超速离心，也不能够完全将二乙酰胺部分水解或将其从多肽混合 物中除去。因此，多肽混合物中存在两种类型的C-末端残基四种天然存在 的氨基酸(即，赖氨酸、酪氨酸、谷氨酸和丙氨酸)具有游离羧基的C-末端残 基；和游离羧基被二乙酰胺基所取代的C-末端残基。
II.评估复杂多肽混合物的方法
本文公开的主题提供用于评估或表征一种或多种肽、肽混合物和多肽混 合物的方法，包括复杂多肽混合物，例如共聚物-1和类似的复杂多肽混合物。 在一些实施方式中，所述方法包括分级(fractionate)所述肽或多肽混合物(例 如，将所述混合物分开成更简单的混合物或者富集(enrich)混合物中特定种 类)；检测特定大分子的存在和/或鉴定其中的大分子；和任选地定量特定大 分子的量，包括修饰的氨基酸结构或大分子，例如其至少一端存在的羧基被 二乙酰胺部分取代的肽或多肽。在一些实施方式中，定量步骤包括定量多肽或多肽混合物中修饰的氨基酸结构的相对质量或摩尔量(molar amount),或者 定量多肽混合物中修饰的大分子链的相对摩尔量。
本文公开的主题的一个实施方式包括检测选自下组的一种或多种样品 的方法共聚物-1,或断裂的、分级的或衍生化的共聚物-1,即在其一个或 多个残基上附接有化学基团的共聚物，或其聚合物前体(例如，图1所示的 中间物I、 II和III),所述方法包括但不限于质谱(MS)、液相层析-质谱 (LC-MS)、核磁共振(NMR)谱、抗体检测方法、拉曼光语和毛细管电泳。
在一些实施方式中，本文公开的方法包括通过化学或酶促方法部分或全 部地将多肽样品解聚，其后通过以下方法分^f斤所述部分或全部解聚的样品， 这些分析方法包括但不限于MS、 LC-MS、 NMR、抗体检测方法、拉曼光 谱、毛细管电泳、液相层析、气相层析和离子层析。
本文公开的主题的一个实施方式包括通过化学或酶促方法部分或全部 解聚多肽样品，其中从至少一端存在的羧基被二乙酰胺基取代的多肽释放二 乙胺；和分析所述部分或全部解聚样品，分析的方法包括但不限于MS、 LC-MS、 NMR、抗体检测方法、拉曼光谱、毛细管电泳、液相层析、气相 层析和离子层析。在一些实施方式中，本文公开的方法分析从所述部分或全 部解聚的样品释放的二乙胺。
在一些实施方式中，本文公开的主题提供检测和/或鉴定多肽或多肽混合 物中修饰的氨基酸，和/或定量多肽或多肽混合物中修饰的氨基酸的相对摩尔 量的方法。在一些实施方式中，所述方法可以包括通过酶促或化学消化解聚 多肽分子。所述方法还可以包括测定谷氨酸、赖氨酸、丙氨酸和酪氨酸的多 肽混合物(例如醋酸格拉默)中C-末端二乙酰胺部分的摩尔量，或释放的二乙 胺基摩尔量。分析的方法可以包括液相层析、气相层析、离子层析、质谱、 液相层析-质谱、NMR、抗体法、拉曼光谱和毛细管电泳，优选多维NMR 谱。
在一个实施方式中，本文公开的主题提供分析共聚物-1或其聚合物前体
(例如，图i所示的中间物i、中间物n和中间物m)样品的方法，该方法包 括在允许结合的条件下，将抗体或其抗原结合部分与共聚物-i样品或其聚合 物前体接触，其中所述抗体或其抗原结合部分或者与二乙酰胺结构部分或者 与特定的肽特异性地结合，由此能够分析(例如，定量分析)共聚物-i样品中 的二乙酰胺结构部分，或者在其一端具有二乙酰胺部分的氨基酸残基或肽链。在另一种实施方式中，所述方法包括通过检测与二乙酰胺部分结合的抗 体或其抗原结合部分来测定二乙酰胺部分的存在。在一些实施方式中，可以 将抗体吸收于或以其它方式附着于(例如通过连接基团)表面。在一些实施方 式中，可以通过标签将抗体标记，例如荧光标记或方文射性同位素标记。
在另外一种实施方式中，所述样品，例如多聚物-l样品，可以为大小分 级的样品。所述方法可以进一步包括在无需分离包含二乙酰胺部分的种类
(species)的情况下，通过分析样品的一种或多种级分来检测二乙酰胺结构部 分的存在。在一些实施方式中，本文公开的主题包括测定二乙酰胺结构部分 的量和/或大小分布。在另一种实施方式中，所迷方法进一步包括至少部分根 据对二乙酰胺结构部分的测定(例如，在其一端的羧基被C-末端二乙酰胺基 所取代肽链的总百分率)而对样品进行归类、选择和废弃。在一些实施方式 中，这种测定可以基于一个绝对的值，而在其他实施方式中，这种测定可以 基于测试样品与参考标准的比较。
在另一种实施方式中，本文公开的主题提供测定参考标准中的组合物 (例如药物)的方法，该方法通过分析样品，例如混合的肽(如共聚物-l或更具 体的COPAXONE ),并测定所述参考标准中是否存在二乙酰胺结构部分或 二乙酰胺结构部分的混合物来进行。在一些实施方式中，本文公开的方法评 估数值或者参数，该数值或参数代表了二乙酰胺结构部分的存在与否、大小 分部和/或量。更加具体地说，本文公开的方法可以用来测定谷氨酸、赖氨酸、 丙氨酸和酪氨酸的多肽混合物(例如醋酸格拉默)中特定肽或多肽的摩尔量， 所述肽或多肽C-末端存在的羧基被二乙酰胺基取代。在一些实施方式中，所 述方法不需要分离进行评估的成份。
在一种实施方式中，本文公开的主题提供检验方法，其检验共聚物制备 物(例如共聚物-l)中在该共聚物多肽链的羧基末端处的修饰或修饰基团的存 在和/或量，例如，4企验其C-末端处的二乙酰胺部分的存在或量，或者检验 从这些多肽释放的二乙胺。所述方法包括评估样品多聚物制备物中二乙酰胺 部分或在其一端具有二乙酰胺部分的氨基酸残基、肽或多肽链的量，并将所 述制备物中的二乙酰胺部分的量与参考数值相比，所述参考数值如规范值或 对照值，或与通过直接测量参考共聚物制备物得到的数值比较。样品制备物 可以为例如共聚物-1或其聚合物前体，包括断裂的、分级的或衍生化的共聚 物-1,或它们的聚合物前体(例如，图1所示的中间物I 、中间物II和中间物III)。所述方法还可以包括基于所述评估处置(即，决定其命运)所述制备物的 步骤(例如，决定所述制备物是否适合于药物步骤的步骤，决定所述制备物 是否适合于进行进一步加工步骤的步骤(例如，在共聚物-1的制造过程中)，
或者至少部分基于所述评估而将所述样品制备物投放(rdease)用于药物用途 的步骤)。
在一种实施方式中，参考值为预先决定的值，例如，醋酸格拉默的药学 规范值，该数值在一些实施方式中可以是占多肽中大约7至大约20的摩尔 百分比(mole percent of polypeptides),例如，占多肽中7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19和20的摩尔百分比，包括中间值，例如7.5、 8.5、 9.5、 10.5的摩尔百分比等等；在一些实施方式中，占多肽中大约8至 大约18的摩尔百分比；在一些实施方式中，占多肽中大约10至大约15的 摩尔百分比；在一些实施方式中，占多肽中大约12至大约14的摩尔百分比； 和在一些实施方式中，占多肽中约13的摩尔百分比。
在另外一种实施方式中，所述数值是预先决定的值，其对应于参考制备 物例如共聚物-1前体制备物(例如图1所示的中间物I、中间物II和中间物III) 中一端的羧基被二乙酰胺部分取代的多肽的量。在一些实施方式中，参考共 聚物-1前体制备物具有约60%-约100%的二乙酰胺部分，如60、 61、 62、 63、 64、 65、 66、 67、 68、 69、 70、 71、 72、 73、 74、 75、 76、 77、 78、 79、 80、 81、 82、 83、 84、 85、 86、 87、 88、 89、 90、 91、 92、 93、 94、 95、 96、 97、 98、 98.5、 99、 99.5、 99.9和100% (占多肽中的摩尔百分比);在一些实 施方式中，具有约75%-约100。/。的二乙酰胺部分；并且在一些实施方式中， 具有大于约60%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%或95% (占多肽中的摩尔百 分比)的二乙酰胺部分。测试的多肽混合物中存在的末端含有二乙酰胺基的 肽链的总百分比可以表示为绝对百分比或相对于参考标准(例如，性质已知 的醋酸格拉默样品)的百分比。这些数值也可以用其他方式表示，例如，通 过运用本领域已知的适当转换因子而得到的残基的摩尔百分比(mole。/。)或重
量百分比(ppm)。
在一种实施方式中，样品制备物中一端具有二乙酰胺部分的多肽量可以 通过一些技术来评估，这些技术包括但不限于 一维核磁共振(1D ]H NMR);化学解聚并4佥测释放的二乙胺，其中所述4全测通过例如气相层析或 液相层析-质谱进行；化学消化或蛋白水解消化，然后用高效液相层析；或者通过释^L二乙胺并在通过HPLC 4企测之前用生色团衍生化二乙胺。
在另一种实施方式中，本文公开的主题提供共聚物-1的制备物(如醋酸
格拉默的制备物)，其具有约7%-约20%的二乙酰胺部分(占多肽中的摩尔百 分比)，例如7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 16、 16、 17、 18、 19和20% 的二乙酰胺部分(占多肽中的摩尔百分比))；在一些实施方式中，具有约8%-约18%的二乙酰胺部分(占多肽中的摩尔百分比)；在一些实施方式中，具有 10%-15%的二乙酰胺部分(占多肽中的摩尔百分比)；在一些实施方式中，具 有12%-14%的二乙酰胺部分(占多肽中的摩尔百分比)；以及在一些实施方式 中，具有约13%的二乙酰胺部分(占多肽中的摩尔百分比)。在一个实施方式 中，共聚物-1的制备物是药物制备物，例如，具有少于约13,000、 13,100、 13,200、 13，300和/或13,400道尔顿(Daltons)平均分子量(最大峰值)的醋酸格 拉默的药物制备物，请参考国际PCT专利公开No. WO 2006/029411中第55 页第25行至第56页第8行，以及第60-63页。
表征这样的多肽混合物的能力可以用来监测或确保产品批次与批次之 间的 一致性或制备工艺过程中的质量，也可以用来从结构-活性的角度检测 或评估特定多肽混合物和参考材料的相似性，例如用来评估或确保所测试样 品的生物学等价性(biological equivalence),和/或可以用作投放测试(release test)中的一部分。
II.评估或表征复杂多肽混合物的常规方法
在一些实施方式中，本文公开的用于表征复杂多肽混合物的方法包括以 下步骤中的一步或多步断裂或解聚复杂多肽混合物所包含的多肽；分离其 中的肽、多肽或它们的片段；检测和/或定量其中的肽、多肽或它们的片段； 和纯化其中的肽、多肽或它们的片段。下文将提供这些单独步骤的非限定性
代表性实施方式。 A.裂解
在一些实施方式中，通过本领域里已知的任何已知方法，可以将复杂混 合物中存在的多肽分子断裂或切割成较小的多肽片段，这些方法包括化学 的、酶促的或物理的方法。切割通常是指切断(scission)蛋白、肽或多肽内的 化学键而形成蛋白、肽或多肽"片段"。在一些实施方式中，可以使用化学 剂对复杂混合物中的蛋白分子、肽或多肽进行裂解，这些化学剂包括但不限 于强酸(如6N盐酸)、弱酸(40。C， 70%的曱酸)、羟胺、强碱(如1N氢氧化
19钠)、溴化氰、亚碘酰笨甲酸(iodosobenzoicacid)或2-硝基-5-硫代氰基苯甲酸 (2-nitro-5-thiocyanobenzoate)然后加碱(alkali base)。化学裂解也可以包括用于 埃德曼降解(Edman degradation)技术的化学剂，例如异硫氰酸苯酯 (phenylisothiocyanate)禾口其孑也本4页i或已^J的这类^式剂。
另外，裂解剂也可以是蛋白水解酶。裂解可以使用一种或多种蛋白酶实 现，所述蛋白酶包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、无花果蛋白 酶(fidn)、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、纤溶酶(plasmin)、嗜热菌蛋白酶 (thermolysin)、内肽酶、蛋白酶K、牛胆汁(OxBi〗e)、柠檬果胶(Lemon Pectin)、 辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidas)、 Gluc-C (谷氨酸内切酶)、赖氨酸内 切酶(endo iys-C)、羧肽酶、钩蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶(subtiiisin)。使用超 过一种蛋白酶能够生成重叠的片段。可以使所述蛋白水解剂游离在溶液中或 将其固定于支持物中/上。在本文公开的方法中适合使用的蛋白酶可以从任意 生物体中分离，这些生物体包括但不限于嗜酸乳杆菌(丄ac/ok "7/船 。c^fopW/附)、双歧双歧杆菌(及;/ ^^"cfe/7'"w 6辨d"w),保加利亚乳杆菌 (X^d9h"c///w>y 6w/g。r/cw51)、 嗜热4连5求菌(5^ep ococcw5 /^>-伤0/9/2//2 )和千酪乳 杆菌(Lacto6aci7/附case!')。
在另一种实施方式中，使用物理技术可以使蛋白、肽或多肽断裂，这些 技术包括但不限于沸煮、超声或者剪切(shearing)。
B,分离
在 一 些实施方式中，可以将复杂混合物中存在的多肽或片断多肽 (fragmented polyp印tides)分离开来由此将这些多肽或片断多肽分成大分子的 亚群。分离可以基于复杂混合物中一类大分子所共有的特性，例如大小、 电荷、疏水性或本文描述的大分子的任何特性。更具体地说，将复杂混合物 中的大分子或大分子级分与该混合物中的其他大分子分离可以基于，例如， 通过凝胶的迁移速率、大小、分子量、响应于外加电场(an applied electrical field)的迁移、电荷、疏水性、沸点、溶解度(例如通过溶剂萃取)、沉淀、亲 和性、磷酸化或者低丰度氨基酸残基(如酪氨酸)的存在。因此，可以根据复 杂混合物中大分子群体所共有的任何化学、物理或功能特性来进行分离，或 者通过感兴趣的切割后部分(cleaved moiety)(如二乙胺)来分离。
在一些实施方式中，可以使用单一的分离步骤。在其他实施方式中，可 以使用一个或多个分离步骤。本领域普通技术人员能够以任意组合和任意顺序使用任何分离技术来将所需要的大分子与复杂混合物中其他大分子分离。 此外，所述分离技术可以作为单独的一维方法进行，或者作为多维方法进行。 所述分离技术可以使用电泳或层析方法进行。分离步骤(例如电泳分离法)可 以在天然或者变性(如十二烷基硫酸钠(SDS)或尿素)的条件下进行。下文将马 上举出非限定性的分离技术的例子。可以根据本文公开的方法使用下列例 子。这些例子的提供将帮助理解本文公开的方法，但是无意限制要求保护的 主题的范围。
1. 凝胶电泳
可以根据大分子通过基质或凝胶的迁移率进行分离。凝胶电泳可以提供 大分子的分离和/或可视化，并且允许测定大分子的某些特性，包括它的等电 点和/或大概分子量。
对于蛋白、肽、多肽或它们的片段这类大分子，氨基酸序列、氨基酸数
量和/或不同的R-基团(R-group)能够决定(dictate)分子量和/或总(净)电荷特 征。如果蛋白、肽、多肽或它们的片段含有较多的荷正电氨基酸，因而正电 荷总数将超过负电荷总数，那么该蛋白、肽、多肽或它们的片段整体上将带 正电荷，并且在电场中将向负极迁移。具有一种/一个氨基酸变异的蛋白、肽、 多肽或它们的片段带有不同的总电荷，因此它们能通过电泳而区分。
在很宽的PH值范围内，十二烷基硫酸钠(SDS)是可以和大多数可溶性蛋 白或肽在水溶液中结合的阴离子洗涤剂。蛋白或肽结合的SDS的量与该蛋 白或肽分子的大小成比例。丙烯酰胺含量超过临界密度的聚丙烯酰胺凝胶抑 制较大分子的迁移，使其慢于小分子。由于经过十二烷基硫酸钠变性后的蛋 白或肽之间的电荷-质量比(charge-to-mass ratio)几乎相同，所以蛋白或肽的最 后分离主要取决于它们分子量的差另iJ。通过SDS-PAGE凝胶电泳进行的蛋白 或氨基酸分离可以用来测定样品(例如来自复杂混合物的样品)中蛋白或肽的 相对丰度，它们的大概分子量和它们存在于哪个级分。另外，样品中蛋白或 肽的纯度也可以通过这种技术进行评估。可以运用不同的染色或亲和性方法 来检测罕见蛋白(rare protein)并表征它们的生化性质。也可使用例如Western 印迹，双向电泳和肽谱法(peptide mapping)等专业4支术。
2. 大小
在一些实施方式中，分离方法可以基于大小、分子量或摩尔质量，使用尺寸排阻层析(SEC)、凝胶渗透层析(GPC)或凝胶过滤层析(GFC)来实现。
在尺寸排阻层析(SEC)中，包含溶剂和分散于其中的部分蛋白、肽、多 肽或它们的片段的流动相流过固定相。通过与所述蛋白、肽、多肽或它们的 片段的物理和/或化学相互作用，固定相暂时留住部分的蛋白、肽、多肽或它 们的片段，从而将这些蛋白、肽、多肽或它们的片段与流动相中的其他大分 子分离。固定相通常包含细碎(finely devided)、多孔的颗粒，如《鼓孔交联琼 月旨净唐凝月交(microporous crosslinked agarose-based gels)、改良聚曱基丙歸酸曱酉旨 凝月交(modified polymethylmethacrylate gds)或多孔硅。相^f于不能进入孑L内的 较大分子，小于颗粒中的孔的孔径的蛋白、肽或多肽分子能够进入孔内，从 而具有较远的路径和较长的通过时间(transittime)。因此，层析中将先洗脱出 较大分子而后洗脱出较小分子。
尺寸排阻层析(SEC)系统的组成可以包括用于维持恒定的、无间断 (pulseless)流速的一个或多个泵；满足感兴趣的分子量范围的柱型；和用于检 测和/或定量结果的检测系统。检测系统可以分为质量浓度敏感型(mass concentration sensitive)或摩尔;农度每文感型(molar concentration sensitive)。 例 如，随着溶液中蛋白浓度的改变，示差折光率4全测器(refractive index detector) 可以测量出折光率的变化。另外一组摩尔浓度方法涉及输入紫外光，输出信 号为荧光或蛋白的吸收。其他方法包括密度检测器和蒸发光散射检测器 (evaporative light-scattering detector)。
3. 层析方法
用于分离的方法可以基于其他层析方法，其包括气相层析(如气相-液 相层析)、气相-固相层析、离子层析、分配层析、吸附层析、薄层层析和超 临界流体层析(supercritical fluid chromatography)。
4. 毛细管电泳
用于分离的方法可以基于大分子响应于外加电场而通过介质的迁移(如 电泳)。在一个实例中，可以使用毛细管电泳分离不同大小的带电和不带电 的大分子(如蛋白及其片段)。
生物学上引起兴趣的大多数分子都带电荷，因此能通过电泳方法进行分 离。这一特征尤其适用于肽片段中的二乙酰胺基，当处于适当环境中时，二 乙酰胺基将带电。在一个可供选择的实施方式中，可以使用长约50-约100 厘米(cm)和内径约10-约200微米(um)的熔融石英管(fosed-silica tubing)。能够使用的电极为10-50千伏(kv)。为了定量样品中末端具有二乙酰胺基的肽 或多肽链的量，无论是否像上文所描述的使用某种方法(如亲和层析)来純化 C-末端，可以通过毛细管电泳分离样品。分离之后，可以使用检测器测定二 乙酰胺基的存在与否，并测定样品中存在的末端具有二乙酰胺基的肽或多肽 链的量。
毛细管电泳包含一 系列相关的分离技术，它们使用窄内径熔融石英毛细
管(narrow-bore flised-silica capillaries)来分离复杂混合物。根据电荷、大小和 疏水性的区别，使用高电场强度来分离分子。通过将毛细管浸泡于样品小瓶 并施加压力、真空或者电压，由此引入样品。根据所使用毛细管和电解质的 种类，毛细管电泳(CE)可以分为几种单独的技术，它们包括但不限于毛细 管区带电泳(CZE)、毛细管凝胶电泳(CGE)、毛细管等电聚焦(CIEF)、等速电 泳(ITP)、电动层析(EKC)、胶束电动毛细管层析(MECC或MEKC)、微乳液 电动层析(MEEKC)、非水毛细管电泳(NACE)和毛细管电层析(CEC)。
5. 电荷
用于分离的方法可以基于电荷选择，包括离子交换层析和阳离子层析 (cationic chromatography)。在离子交换层析中，带电物质经由带相反电荷的 柱介质而分离。交换柱中的离子基团与凝胶基质共价结合，并由缓冲液中存 在的低浓度平衡离子(counterion)得以补偿。当样品加入层析柱后，与结合薄 弱的平衡离子发生交换。在一些实施方式中，离子层析可以用来检测通过化 学切割而从多肽结构释放的一个或多个二乙胺部分。
6. 疏水性
用于分离的方法可以基于疏水性选择，包括疏水相互作用层析、反相层 析(RPC)或反相-高效液相层析(RP-HPLC)。化合物在高水性流动相中附着于 反相HPLC柱，再用高有机性的流动相将该化合物从RP-HPLC柱中洗脱出 来。在RP-HPLC中基于化合物的疏水性特征将它们分离。
最常见的RP-HPLC柱是由硅胶颗粒装填的。珠或颗粒的特征通常在于 颗粒和孔的大小。在一种实施方式中，颗粒大小通常是约3-约S0微米0tm)， 对于蛋白最常用的颗粒大小为5微米(iim)。颗粒孔径大小是以埃(angstrom) 来衡量的，通常范围在大约100-大约1000埃(A)。在一个实施方式中'固定 相通常由与分析物相互作用的不同长度的疏水烃基链(alkyl chain)组成。 一般 可用来分离大分子的柱包括但不限于碳-4 (C-4)、碳-8 (C-8)或碳-18 (C-18)长度的烃基链。碳-4柱一般用来捕获较大的蛋白，而碳-18柱一般用来捕获小 蛋白或小分子。 一般说来，反相溶剂的使用不论蛋白分子的亲水性或疏水性。
7. 溶剂萃取
分离方法可以基于溶剂萃取(solvent extraction)。溶剂萃耳又包括在两种溶 剂间或一种溶剂和一种固体相之间分配大分子。由于在两种相中有不同的溶 解性的大分子在两种相中将会有不同的分配，据此可以对所述大分子进行萃 取和/或富集。大分子可以根据其本身及使用的两种相的疏水性/亲水性得以 分离。溶剂萃取方法可以使用任何适用于分离大分子(如多肽)的溶剂。
8. 沉淀
分离方法可以基于沉淀过程，其也是依据大分子的溶解性。例如，可溶 于水性溶液(water-based solution)的蛋白、肽或多肽在其表面具有亲水性氨基 酸，这类氨基酸吸引水分子并与水分子相互作用。这种溶解度是溶液的离子 强度和pH的函数。蛋白、-肽和多肽中氨基酸侧基电荷彼此平衡时即为它们 的等电点。当溶液的离子强度非常高或非常低时，蛋白、肽或多肽将趋向于 在它们的等电点沉淀。因此，溶解度也是离子强度的函数。
9. 亲和性
分离方法可以基于对样品中大分子的亚组的亲和性选择。亲和性选择包 括使用多克隆抗体和/或单克隆抗体的免疫亲和性，和/或固定化金属亲和层 析。亲和性选择方法也包括使用酰化试剂的半胱氨酸亲和性；或对于组氨 酸、糖和/或磷酸部分的亲和性。
亲和层析依赖于蛋白、肽或多肽特异性地与固定的配体结合，而所述 蛋白、肽或多肽的剩余部分则通过层析柱。可以使用任何配体，包括任何化 学生成的配体或者生物分子，如糖或蛋白分子。合适的配体还包括单克隆抗 体或者多克隆抗体。
10. 磷酸化蛋白
分离方法可以基于对磷酸肽(phospho-peptides)进行的选择，包括使用能 与磷酸化氨基酸(如磷酸酪氨酸和磷酸丝氨酸)反应的抗体。其他方法包括 使用加载4家的固定化金属亲和层析(gallium loaded immobilized metal affinity chromatography) (IMAC)柱、阴离子交换层析或含氧化锆层析 (zirconia-containing chromatography)。
11. 低丰度氨基酸分离方法可以基于对含有特定低丰度氨基酸(如酪氨酸)的肽分子进行的
选择。例如，使用重氮盐(diazoniumsalts)可以选择含有酪氨酸的蛋白、肽或 多肽分子。可以将含有色氨酸的蛋白、肽或多肽分子在pH5.0用2, 4-二硝 基苯基硫基氯(2，4-dinitrophenylsulfenylchloride)衍生化，然后使用与2, 4-二 硝基苯(2,4-dinitrophenol)反应的抗体进行选择。用于分离包含组氨酸的蛋白、 肽或多肽分子的方法包括将主要氨基乙酰化，并在加载有铜的固定化金属 亲和层析柱(immobilized metal affinity chromatography (IMAC) columns loaded with copper)上进行选择。 C.检测和/或定量
检测和定量(在此处将统称为"评估步骤"(evaluation step))是对复杂混 合物或复杂混合物的级分的分析，从而获得关于它们的质量或数量的数据。 评估步骤可以包括下文所描述的任何单独的方法或它们以任意顺序的组合， 这些方法包括凝胶电泳、氨基酸组分分析、氨基酸测序(如N-末端测序)、 糖分分析(sugar analysis)、糖分测序(sugar sequencing),荧光光i普、质谱(例如 MALDI MS (基质辅助的激光解吸电离质谱)(matrix assisted laser desorption ionization mass spectrometry))、串联质谱(MS/MS)、核磁共振(NMR)、 MALDI TOF/TOF(基质辅助的激光解吸电离串联飞行时间)、电喷射离子化 (electrospray ionization, ESI)、四极杆(quadrupole)、 离子阱(ion trap)、扇开j》兹 场(magnetic sector)或离子回3走共振^ i普(ion cyclotron resonance mass analysis)、正交消化分析(orthogonal digestion analysis)、毛细管电泳(CE)和/ 或高效液相层析(HPLC)定量、红外光谱(infrared spectroscopy)、紫外-可见光 谱(UV-vis spectroscopy)、原子吸收光镨(atomic absorption spectroscopy)、拉 曼光i普(Raman spectroscopy)、X射纟戋光"i普(X-ray spectroscopy)、 ^s方'法(thermal procedures)、 电4立测定法(potentiometry)和/或电子显樣丈4竟(electron microscopy)。更加具体地说，分析方法包括但不限于质谱、液相层析质谱、 核》兹共振、抗体检测方法、拉曼光谱和毛细管电泳。
1.质谱
评估步骤可以包括质谱和/或串联质谱(MS/MS)技术。在这种技术中，将 母体分子的多肽离子断裂成较小的离子，选择这些较小的离子并将其进一步 断裂，从而获得关于肽混合物性质的信息。为了使用质谱表征某种类型的肽 混合物，可将某种类型的肽或某种类型的肽的特定片段加上正电荷和负电荷，或者离子化，然后在质谱仪中挥发。然后质谱仪能够分析所述离子化的、 挥发的肽分子或其片段，生成该肽分子或片段的质镨。
质谱仪测定肽分子和肽分子片段的重量，当分析肽分子或片段时，质i普 提供的信息可以用来推理所述肽分子或片段中的的氨基酸残基序列。质谱仪 也具有足够的敏感性来提供有关对于肽分子或片段中特定氨基酸残基的修
饰的信息。例如基质辅助的激光解吸电离(matrix assisted laser desorption ionization, MALDI)和电喷射离子化(electrospmy ionization, ESI)和纳米喷雾 (nanospray)气相层析/质谱、液相层析/质谱、串联质谱、液相层析-串联质谱、 次级离子质谱(SIMS)、傅里叶变换仪(Fourier transform instruments)、激光微 探针质谱(laser microprobe mass spectrometry)、 气相解吸仪(gas phase and desorption instruments)、 电子电离(electron ionization (EI))质i普、孑匕学电离 (chemical ionization)质i普、电场电离(field ionization)质i普、场至丈解吸(field desorption)质谱、快原子轰击(fast atom bombardment)质谱、等离子体解吸 (plasma desorption)质i普、热解吸(thermal desorption)质"i普、电动流体电离 (electrohydrodynamic ionization)质"i普和热喷雾电离(thermospray ionization)质
谱都属于质谱范畴。 2.核》兹共振谱
评估步骤可以包括核磁共振(NMR)谱。当特定原子的核处于(immersed in) 静磁场中，并暴露于二次振荡磁场时，会产生核磁共振现象。 一些原子核会 经历这种现象，而有些不会，这取决于它们是否具有被称为自旋(spin)的特 征。因此，可以将核磁共振谱用于研究许多具有自旋特征的分子的化学结构。
适用的核磁共振技术包括但不限于&、 2H、 23Na、 15N、 13C、和180。 超过200种同位素具有磁矩并且可以使用核磁共振来研究。核石兹共振可以在 溶液和固态中进行，所有类型的核磁共振实验都属于本文公开的主题范围， 包括宽带去耦(broad band decoupling)、 偏共振去耦(off-resonance decoupling)、核欧沃豪斯增强效应(nuclear Overhauser enhancement (NOE》和 二维核磁共振(2D-NMR)。核磁共振方法的代表性例子包括但不限于单脉 冲实—睑(one pulse experiments); 自S走去耦和差异i普(spin decoupling and difference spectroscopy); 多脉沖实验(multiple pulse experiments), 包括简单 回波(simples echoes)、 J-调制(J-modulation)、布居举争移(population transfer)、 选择性极化转移(selective polarization transfer)、非选择性极化转移-不灵敏核才及化转移增益法(non selective polarization transfer-INEPT)、反相不灵*文和招_ 化转移增益法(inverse INEPT)、重聚焦不灵敏核极化转移增益法(Refocused INEPT); 二维核磁共振，包括涉及除去异核和/或同核耦合的基本二维序列 分析方法；反相一全测谱-异核多量子相干(inverse-detected spectra-HMQC)、同 核位移相关实验-位移相关谱(COSY);位移相关谱的变异(variations on COSY)、 多量子相干-INADEQUATE(multiple quantum coherence-INADEQUATE)、自旋锁定序列-全相关谱(spin locked sequences-TOCSY)、溶 剂才卬制二维i普(solvent suppressed two-dimensional spectroscopy)、 三维核》兹共 振(3D-NMR);通过键研究连接(connection)的方法；通过空间研究连接 (connection)的方法，例如核欧沃豪斯效应(NOE)实验，包括核欧沃豪斯效应 谱(NOESY)和旋转核欧沃豪斯效应谱(ROESY);以及测量弛豫率(relaxation rates)的方法，包4舌反專争i"炎复(inversion recovery)、々包和十炎复(saturation recovery) 和渐进饱禾口 (progressive saturation)。
或污染物产生的信号的方法，所述方法包括但不限于预饱和或向后翻转 (flip-back)技术。
3. 红夕卜光语
评估步骤可以为红外光镨(IR Spectroscopy)，包括傅里叶变换红外光谱 (Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy)。红夕卜光i普是一种〈吏用电石兹波 谱红外部分的光谱，并且可以用来研究样品的组成，也可以用于研究生物分 子结构上的详细化学信息。当以时间分辨(time-resolved)的方式进行时，还可 以检测生物反应中的结构中间物。为了测量样品，使一束单色红外光通过所 述样品，并且记录在红外辐射中不同频率或波长处的能量吸收。红外吸收峰 的位置可以与在特定频率振动的特定化学键类型相关。在红外光谱的定义范 围内，本发明也包括各种形式的红外光谱，其包括但不限于内发射红外光 语(internal reflection infrared spectroscopy)、 光声红夕卜光镨(photoacoustic infrared spectroscopy)、 近纟工夕卜光i普(near-infrared spectroscopy)、 近纟工夕卜反射 光i普(near infrared reflectance spectroscopy)、 远纟工夕卜光i普(far-infrared spectroscopy)和红夕卜发射光谱(infrared emission spectroscopy)。
4. 凝胶电泳
评估步骤可以包括凝胶电泳。将上文描述的凝胶电泳步骤在此通过题述
、緩沖液和/并入，意在将其应用于所述评估步骤中。
5. 发射光谱
评估步骤可以包括发射光谱，其包括分子焚光、磷光和化学发光。荧 光和磷光的产生是吸收光子的结果。化学发光是基于化学反应后形成的成分 (species)经激发的发射光谱。焚光、磷光和化学发光特征强度的测量使得定 量有机和无机物成为可能。 一般说来，仪器包括源、滤波器和/或其他用于分 离或区分不同波长的设备，例如单色器、检测器、各种隔间(cell)和舱室 (compartment)。可以用于焚光光谱的一些仪器包括焚光计、光导纤维焚光 传感器(fiber-optic fluorescence sensors)、焚光分光计(spectrofluorometers)和磷 光计。
6. 紫外-可见光谱
评估步骤可以包括紫外-可见光谱，当分子吸收电磁波谱紫外和可见区
任何具有交替的双键和单键延伸方式(extended system)的物质都会吸收紫外 光，任何具有颜色的物质都会吸收可见光，这使得紫外-可见光谱可以广泛 地应用于各种样品。在仪器方面，紫外测量的光源通常是氢灯或氘灯，可见 光测量的光源通常是鴒灯。通过波长分离器(wavelength separator)如棱镜单色 4义(prism monochromator)或光4册单色4义(grating monochromator)对这些连续光 源的波长进行选择。通过扫描波长分离器而得到光谱，可以从光谱或某一波 长进行定量测量。有各种各样的紫外-可见光谱方法。这些方法包括但不限 于分子紫夕卜/可见光谱(molecularUltraviolet/Visible)、吸收光谱、紫外光谱、 紫外/可见吸收光谱。
7. 拉曼光谱
拉曼光谱可以用于定量样品中末端含有二乙酰胺基的肽或多肽链的量。 拉曼光谱的优点在于水不会产生拉曼信号。拉曼强度与所测物质浓度成正 比。基于这点，可以运用拉曼光谱来测定存在的某一特定物质的浓度。
在拉曼激发过程中，可以将由分子振动产生的拉曼峰面积(area)相对值 的变化用作样品(例如纯化的样品)中存在的各种不同结构的百分比的量度。 使用分离方法(如亲和层析)如上所述纯化C-末端之后，分离的C-末端肽可以 通过拉曼光谱进行分析。在进行拉曼光谱的过程中，对应于组成二乙酰胺基 团的各基团的拉曼峰显而易见。可以运用各种不同的拉曼技术分析二乙酰胺
28基团。典型例子包括常规拉曼光谱、共振拉曼光谱和表面增强拉曼光语
(surface-enhanced Raman spectroscopy)。 8.抗体^r测方法
可以使用对于所选结构有特异性的抗体(或对于样品中的其他结构有特 异性抗体)来测定样品中所选结构的存在和/或量，例如共聚物-1或 COPAXONE⑧样品中存在的末端具有二乙酰胺基团的肽或多肽链的量。例 如，可以容易地得到对于修饰或未修饰的C-末端、N-末端或中间肽基团有 特异性的抗体，或者可以通过本领域的已知方法来生成这样的抗体。
例如，为了测定存在的末端具有二乙酰胺基团的肽或多肽链的量，无论 进行或不进行使用分离方法(例如亲和层析)的如上所述的对C-末端肽的純 化，均可将纯化的C-末端肽与预选择的抗体在室温下温育(incubate)—段时 间，如两个小时。针对特定修饰结构产生的抗体只会与具有该特定修饰结构 的链(例如C-末端肽)相结合。抗体也可以包含标签，该标记在曝露于电,兹辐 射时发荧光。经过一段时间后(如两小时)，洗脱掉多余的抗体，将样品纯化 并任选地进行定量。
其后将纯化的样品曝露于电磁辐射，这种电磁辐射将导致结合的抗体产 生荧光。荧光的量与C-末端肽上存在的二乙酰胺基的量成比例。
D.纯化
纯化步骤，在此又称为富集步骤，可以生成所选大分子占有较大组成比 例的大分子级分。由纯化步骤所得到的大分子级分可以包括所选大分子以外 的其他大分子。任何上述分离方法都可以用于纯化步骤。上文所公开的对分 离步骤的描述在此通过题述并入，意在将它们应用于纯化步骤。
在一些实施方式中，可以通过本领域中已知的任何方法来实现对末端具 有二乙酰胺基团的肽或多肽链的纯化。图4显示了一种纯化方法。更加具体 地说，用醇处理共聚物-1，致使羧酸酯基团的转酯反应。或者，也可以用EDC/ 胺化学法(EDC/amine chemistry)处理共聚物-l。使用任何这些化学试剂的处 理致使谷氨酸和多肽C-末端的羧酸酯基团"加帽"(being capped)。其他纯化 方法是本领域已知的。例如，共聚物-1可以用与羧酸酯基团结合的蛋白处理， 如生物素(biotin)。无论是通过化学还是生物方式实现，均可通过本领域已知 的任何方法将这种修饰的多聚物解聚，例如通过化学的或酶促的消化。这种 消化会产生三种结构N-末端肽、中间肽和C-末端肽。
29为了纯化C-末端肽，可以使用例如抗体处理或亲和层析等方法。将N-末端肽、中间肽和C-末端肽置于亲和层析柱中。选择合适的条件和层析柱，
使修饰的N-末端肽和中间肽与层析柱结合。C-末端肽随着流动相从层析柱 中洗脱出来。除去流动相从而得到纯化的C-末端肽。接着可以通过本领域已 知的任何方法定量和分析所述纯化的C-末端肽。
此外，纯化步骤可以包括将蛋白或其片段与亲和标签相连接。可以将亲 和标签加至蛋白的N-末端或C-末端。亲和标签包括组氨酸标签(histidine (His) tags)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)标签、V5标签(V5 tag)、 FLAG标签 (FLAG tag)、流感病毒血凝素(influenza hemagglutinin (HA))标签、Myc标签 (Myc tags)、 VSV-G (水泡性口膜炎病毒-G)标签和硫氧还原蛋白(Trx)标签。 其他具有配体亲和性的蛋白标签包括赖氨酸特异性标签、生物素、链霉抗 生物素(streptavidin)、麦芽糖结合蛋白(maltose binding protein, MBP)、 S-标签、Lex A DNA结合域(DNA binding domain, DBD)、 GAL4DNA结合域、 单纯疱渗病毒(herpes simplex virus)和BPI 6蛋白。
III.运用本文公开的方法来评估或表征复杂多肽混合物
上文所公开的裂解、分离、检测和/或定量以及纯化方法可以用于表征复 杂多肽混合物。
A.裂解和之后的质谱或液相层析/质谱
在一个实施方式中，本文公开的方法包括使用酶促的解聚反应后进行 MS (质谱)或LC-MS (液相层析-质谱)检测，由此检测多肽混合物中的非羧基 末端部分，即二乙酰胺基。在这种实施方式中，将多肽或多肽混合物解聚， 优选通过向混合物加入一种或多种蛋白酶来解聚。适用的蛋白酶包括胰蛋白 酶(trypsin)、胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)、弹性蛋白酶(elastase)和Glu-C,以 及它们的混合物。可以基于特定蛋白酶的切割特性进行蛋白酶的选择。例如， 胰蛋白酶切割赖氨酸或精氨酸的C-末端；胰凝乳蛋白酶优先选择残基上的芳 香族侧链，该残基的羧基碳属于被切割肽键的一部分；而Glu-C切割谷氨酸 的C-末端。酶/CPX(enzyme/CPX)的重量比例优选约1:50。
在解聚步骤中可以使用合适的溶剂和緩冲液。例如，对于胰蛋白酶和
Glu-C,优选的溶液包含50mM的碳酸氬氨；对于使用胰凝乳蛋白酶的消化， 优选的緩冲溶液可以包括10 mM Tris-HCl和10 mM氯化钙(calcium chloride)。可以使用技术领域中已知的其他兼容的溶剂。解聚步骤，在此又称为消化步骤， 一直进行到将多肽基本上解聚成单独的肽为止。解聚步骤可
以在升高的温度下进行一段时间，如在大约20。C到大约40°C，以实现受控 的解聚。在一些实施方式中，使用胰蛋白酶的解聚反应发生在大约37。C，对 于胰凝乳蛋白酶和Glu-C的解聚温度约为25。C。解聚一直进行到足够的解聚 发生，在一些实施方式中，进行至少12小时，在一些实施方式中，进行约 16小时。当合适的消化发生后，可以通过本领域中已知的方法终止消化，例 如加热和调整pH。在一些实施方式中，解聚前可以通过力口热或加入变性溶 剂而4吏多肽变性。
解聚之后，消化的聚合物片段包含N-末端肽、中间肽和C-末端肽，如 图2所示。然后这些经消化的聚合物片段可以使用分离技术得到分离。在一 些实施方式中，使用反相高效液相层析(reversed phase HPLC;反向HPLC)来 分离肽，其中将羧基末端片段与非羧基端片段分离，如图2所示。
在一些实施方式中，反相HPLC中使用的流动相包括水和乙腈。可以将 少量的酸，如三氟醋酸(TFA),加入水和乙腈的流动相中。尽管不希望受到 任何理论的限制，但是酸性环境抑制了肽或蛋白的碱性基团与柱填充物表面 硅烷醇的相互作用。在一些实施方式中，流动相包含溶于HPLC级水的约 0.05%三氟醋酸和溶于HPLC级乙腈的约0.04%三氟醋酸。
在一些实施方式中，反相HPLC柱为包含十八烷基硅(octadecylsilica)填 充物的碳-18柱，其内径为4.6毫米(mm)，长为150毫米(mm)，颗粒大小为 3微米0im)，孔径大小为120埃(A)。可供选择地，可以使用强阳离子交换层 析。强阳离子交换可以将羧基末端片段与非羧基末端片段分离。
一旦分离了非羧基端片段，可以通过质谱(MS)或液相层析-质谱(LC-MS) 鉴定它们。图3展示了肽丙氨酸(peptide alanine),和丙氨酸的二乙酰胺基团。 进行分析时，通过获得的与天然肽分子质量相差56.1道尔顿(Da)的质量位 移，能够鉴定末端具有二乙酰胺基团的肽或多肽链，例如图3中所示。
B.使用NMR检测和定量末端含有二乙酰胺基团的肽或多肽链
本发明的另一种实施方式包括利用NMR ^r测和定量多肽混合物(如醋 酸格拉默)中非天然氨基酸的方法，所述非天然氨基酸包括在一端具有C-末 端二乙酰胺基团的氨基酸。当一些原子的核处于静磁场中，并暴露于二次振 荡磁场时，产生的现象即NMR。 一些核会经历这种现象，而其它的不会， 这取决于它们是否具有自旋(spin)特征。可以使用NMR谱研究化学结构。
31此外，NMR可以用于许多具有自旋特征的分子。这些分子包括但不限 于'H、 2H、 23Na、 15N、 13C和180。多于200种同位素具有磁矩(magnetic moment) 并可以使用NMR来研究。NMR可以在溶液和固态中进行，所有形式的NMR 实验都可用于本文公开的方法，包括宽带去耦(broad band decoupling)、偏 共振去耦(off-resonance decoupling)、核欧沃豪斯效应增强(nuclear Overhauser enhancement (NOE》和二维的核磁共振(2D-NMR)。 NMR方法的代表性例子 包括但不限于单脉沖实验(one pulse experiments);自旋去耦差异谱(spin decoupling and difference spectroscopy); 多脉沖实验(multiple pulse experiments), 包括简单回波(simples echoes)、 J-调制(J-modulation)、布居转 移(population transfer)、 选捧性极化转移(selective polarization transfer)、 非选 择性极化转移-不灵敏核极化转移增益法(non selective polarization transfer-INEPT)、反相不灵敏和极化转移增益法(inverse INEPT)和重聚焦不灵 敏核极化转移增益法(Refocused INEPT); 二维核/磁共振，包括涉及除去异核 和/或同核耦合的基本二维序列分析方法；反相检测谱-异核多量子相干谱 (inverse-detected spectra-HMQC),同核位移相关实验-位移相关语(COSY);位 移相关谱变异(variations on COSY)、多量子相干-INADEQUATE(multiple quantum coherence- INADEQUATE)、自旋锁定序歹'J-全相关谱(spin locked sequences-TOCSY)、；容齐"才中制二维i普(solvent suppressed two-dimensional spectroscopy)、三维核磁共振(3D-NMR);通过键研究连接的方法；通过空间 研究联系的方法，即核欧沃豪斯效应(NOE)实验，包括核欧沃豪斯效应谱 (NOESY)和旋转核欧沃豪斯效应谱(ROESY);和测量弛豫速率(relaxation rates)的方法，包括反转恢复、饱和恢复和渐进饱和。
本文公开的NMR方法任选地可以包括用于抑制溶剂、缓冲液和/或污染 物产生的信号的方法，包括但不限于预饱和或向后翻转(flip-back)技术。
在这些实施方式中，多肽混合物可以以其经过或不经过解聚的、完整的 或变性的形式进行分析。可以使用上文所述的任何方法进行解聚。
用于分析的多肽混合物可以处于多种形式，也可以是商业上可以获得的 多肽混合物样品，如醋酸格拉默，通常可以获得的是冻干形式。最初为了制 备包含多肽混合物的样品，可以使用已知方法，如緩冲液交换，除去药理学 载体试剂，如甘露醇。接着可以将样品再溶解于溶剂如D20中。可以将样品 溶解于适当的緩冲液中，例如三(三_2，3-二溴-1-丙醇磷酸酯)(Tris(tris-2，3-dibromo-1 -propanol phosphate))。
可以对样品进行不同种类的NMR方法来测定样品中肽的性质，并鉴定 和定量其中的基团。多种NMR方法，包括多维NMR方法，可以对小量样 品进行，以同时鉴定种类并定量它们的相对摩尔量。除了一维质子核一磁共振 外，使用1H和13C的二维异核单量子相关光谱(2D HSQC)也可用于测定直 才妄的碳/质子耦合(direct carbon/proton coupling)和积分(integration)，这些将在 下文详述。
在一些实施方式中，可以使用二维全相关光谱(TOCSY)测定质子/质子耦 合和积分。可以使用二维相关谱(COSY)测定质子/质子耦合和积分。可以使 用二维核欧沃豪斯效应谱(NOESY)或旋转核欧沃豪斯效应谱(rotational Overhauser effect spectroscopy) (ROESY)测质子/质子的空间(through space)相 互作用。也可以使用三维核欧沃豪斯效应谱-异核单量子相关光谱(3D NOESY-HSQC)和三维旋转核欧沃豪斯效应谱-异核单量子相关光谱(3D ROESY-HSQC)检测化学位移分配。
在一些实施方式中，可以使用核磁共振方法的组合来检测或鉴定混合物 中的大分子。例如，在以下实例中，使用了一维核磁共振氢谱(1D'HNMR) 和二维全相关谱(TOCSY)核磁共振来鉴定和定量二乙酰胺加合物(adduct)。
使用 一维核磁共振氢谱(1D 1HNMR),相对于其它已经鉴定的峰来测量 每个峰下的面积，从而测定单独成份的相对摩尔含量。因此，使用这种分析 技术，可以计算核磁共振谱所鉴定的每个成份的摩尔百分比(mo1。/。)。每个成 份的摩尔百分比(moI。/。)可以通过比较源于相同多肽类型的峰来计算，而每个 成份的绝对量可以通过使用校正的参考信号(calibrated reference signal)来测 定。参考信号可以来源于样品中的另 一分子或来自校正的射频源。
因此，通过此处所述的先酶促消化然后质谱或液相层析-质谱方法，或 本文描述的多维核磁共振方法，可以测定和定量多肽混合物中二乙酰胺加合 物的水平。
实施例
将举出下列实施例以指导本领域普通技术人员实施本文公开的主题的 代表性实施方式。按照本文公开内容和本领域中的一般水平，技术人员们能 够理解以下实施例仅仅旨在提供范例，在背离本文公开主题内容范围的前提下，可以采用多种变化(change)、修饰(modification)和改变(alteration)。下列 实施例是以说明的方式举出而非用于限制。
实施例1对于醋酸格拉默中二乙酰胺加合物的分析 本实施例将说明通过核磁共振检测和定量共聚物制备物中DEA(二乙酰 胺)加合物的方法。
从丙氨酸-丙氨酸-二乙酰胺(AIa-Ala-diethylamide)测得了 二乙酰胺加合 物的特征核磁共振信号。 一维核磁共振氢语(1D & NMR)示于图5。将样品 溶于700 |iL pH 8并含有4 mM 2，2-二甲基-2-硅戊烷-5-磺酸-d6钠盐(DDS-d6) 的lOmMTris-dll。测定了相对于DDS的曱基'H化学位移。二乙酰胺部分 的两个曱基基团在1.26 ppm和1.09ppm处产生明显不同的信号。
通过一维核磁共振氢谱(1D & NMR)分析来源于某批次醋酸格拉默 (COPAXONE⑧)的样品。将约0.700 ml配制好的醋酸格拉默冻干。将所述粉 末重新溶解于0.700 ml D20并冻干。重复三次所述溶解-冻干过程。其后将 样品再溶解于0.700 ml pH 8并含有4 mM DDS-d6的10-mM Tris-dll。图6 为醋酸格拉默的1D'HNMR,带有对残留溶剂信号的抑制。3.65-3.90ppm的 强信号来自于甘露醇，1.92ppm的强信号来自于配制醋酸格拉默中所用的醋 酸。二乙酰胺加合物的曱基^信号在1.25和1.10ppm处可见。尽管它们与 丙氨酸曱基信号尾部重叠，但其基线足够平滑，可以去掉宽特征(broad feature) 而得到局部平坦的基线以用于积分(图7)。 3.00 ppm处的特征信号来自赖氨 酸Hs和酪氨酸H(3的总和。每个赖氨酸和每个酪氨酸残基含有两个产生这 种信号的'H核。因此，3.00 ppm处信号与赖氨酸和酪氨酸含量的两倍成比 例。因为每个曱基含有三个^核，所以U0ppm处的二乙酰胺曱基信号与 二乙酰胺加合物含量的三倍成比例。
二乙酰胺量可以通过二乙酰胺甲基信号与3.00 ppm处多肽信号之间的 比值而测定。通过氨基酸分析，发现了该批次醋酸格拉默包含33.7%赖氨酸 和9.1%酪氨酸。因此二乙酰胺占到残基的(2 x [整体的1.10 ppm] x ([mol %赖 氨酸]+ [mol %酪氨酸]))/ (3 x [整体的3.00 ppm]) = (2 x 1.00 x 42.8 %) / (3 x 193.16) = 0.14摩尔百分比。或者，这个数值可以变换成为二乙酰胺加合物的 总质量或在链中的摩尔百分比。
无论含有/不含有甘露醇，从多个批次的多个醋酸格拉默样品得到了类似的数值。在分析前将这些样品依照制造商的说明而保存。
实施例2 二乙胺的LC/MS(液相层析/质语)分析
本实施例将说明通过质谱检测和定量共聚物制备物中DEA (二乙酰胺) 加合物的方法。
可以通过各种不同的反应途径产生对共聚物-1中多肽链的末端残基的 多种^f务饰。例如可以产生N-末端和C-末端残基的^f'务饰，如C-末端的DEA。 这些修饰是共聚物-1生产过程的直接结果。监测这些修饰可以提供关于所述 过程的信息。如果这些成份(species)以显著的量存在，那么可能需要把它们 作为杂质进行定量。
证明DEA存在的质谱示于图8A和图8B。通过NMR也检测到了 DEA。 现参考图8A和8B,图8A显示代表性DEA串联质谱(MS/MS)裂解模式。 DEA和肽羧基之间的酰胺键很脆弱，可以通过与气体分子如氮气分子的碰 撞而断裂。在源裂解(sourcefragmentation)过程中，在离子源中将化合物断裂 成较小片段，并且可能生成一些类型的片段离子，如DEA离子。通过源内 裂解(in-source fragmentation)共聚物-l样品产生了与DEA具有相同质量 74.09的离子。图8B显示这种离子的串联质谱(MS/MS)裂解具有跟DEA相 同的模式。
尽管为了清楚的理解而已经通过说明和举例的方式对前述主题进行了 一些详细描述，但是本领域技术人员应该理解，可以在所附权利要求的范围 内进行某些变化和修饰。
权利要求
1. 一种方法，其用于检测样品中一种或多种氨基酸、肽、多肽链和它们的组合的至少一个C-末端的修饰，所述方法包括(a)提供样品，其可能含有具有至少一个修饰的C-末端的一种或多种氨基酸、肽、多肽链和它们的组合；(b)通过能够检测样品中氨基酸、肽、多肽链和它们的组合的至少一个C-末端的修饰的方法来分析样品。
2. 权利要求1的方法，其中至少一个C-末端的修饰包括样品中一种或 多种氨基酸、肽、多肽链和它们的组合的至少一个结合了二乙酰胺部分的 C-末端。
3. 权利要求l的方法，其中一种或多种氨基酸选自下组丙氨酸、谷氨 酸、赖氨酸和酪氨酸。
4. 权利要求3的方法，其中氨基酸丙氨酸、谷氨酸、赖氨酸和酪氨酸中 的一种或多种包含结合了二乙酰胺部分的C-末端。
5. 权利要求1的方法，其中一种或多种氨基酸包含一种或多种被保护的 氨基酸。
6. 权利要求5的方法，其中一种或多种被保护的氨基酸选自下组O-节基谷氨酸和Nr三氟乙酰赖氨酸。
7. 权利要求6的方法，其中一种或多种被保护的氨基酸O-苄基谷氨酸 和Ns-三氟乙酰赖氨酸包含结合了 二乙酰胺部分的C-末端。
8. 权利要求l的方法，其中所述样品包含选自下组的多肽混合物共聚 物-1、衍生化的共聚物-1、断裂的共聚物-1、分级的共聚物-1和它们的组合。
9. 权利要求l的方法，其中所述样品包含选自下组的多肽混合物共聚 物-1的一种或多种中间物、衍生化的共聚物-1中间物、断裂的共聚物-1中间 物、分级的共聚物-1中间物和它们的组合，其中所述中间物选自下组如图 1所示的中间物-I、中间物II和中间物III。
10. 权利要求1的方法，其中能够检测样品中一种或多种多肽链的至少 一个C-末端的修饰的方法选自下组液相层析、离子层析、气相层析、毛细 管电泳、质谱、液相层析/质谱、核磁共振谱、抗体#:测方法、拉曼光谱、红 外光谱、荧光光谱、紫外-可见光谱、凝胶电泳和它们的组合。
11. 权利要求10的方法，其中气相层析方法包括选自下组的注入技术 直才妄注入和顶空注入。
12. 权利要求10的方法，其中核磁共振方法选自下组 一维(1D)核》兹共 振、二维(2D)核磁共振和三维(3D)核磁共振、！H核磁共振、"C核磁共振、 15N核;兹共振，和它们的组合。
13. 权利要求12的方法，其中核磁共振方法进一步包括定量核磁共振信 号以测定具有至少 一个修饰的C-末端的多肽链的量。
14. 权利要求13的方法，其包括通过选自下组的方法来定量核磁共纟展4言(a) 积分一个或多个归属为修饰的C-末端的核磁共振峰；(b) 去巻积处理一个或多个归属为修饰的C-末端的核^磁共振峰；(c) 将归属为修饰的C-末端的核磁共振信号的积分面积相对于归属为多 肽混合物、样品中掺杂的参考分子、外部样品、校正的射频信号和它们的组 合的核^磁共振信号之一 来进行校正。
15. 权利要求12的方法，其中所述核磁共振方法进一步包括将样品与化 学变性剂接触。
16. 权利要求15的方法，其中所述化学变性剂选自下组尿素和胍。
17. 权利要求10的方法，其中抗体检测方法选自下组Western印迹、 亲和层析和酶联免疫吸附测定法(ELISA)。
18. 权利要求l的方法，其进一步包括在步骤(b)中分析样品之前对样品 进行分级。
19. 权利要求18的方法，其包括通过选自下组的方法将样品分级液相 层析、离子层析、亲和层析、毛细管电泳和它们的组合。
20. 权利要求1的方法，其进一步包括在步骤(b)中分析样品之前纯化样口P 。
21. 权利要求20的方法，其包括通过选自下组的方法纯化样品凝胶电 泳；尺寸排阻层析；毛细管电泳；离子交换层析；反相液相层析；溶剂萃取； 沉淀；亲和层析；磷酸肽选择；低丰度氨基酸选择；将一种或多种氨基酸、 肽和多肽与亲和标签连接；对一种或多种氨基酸、肽和多肽的一个或多个羧 基进行转酯；用EDC/胺化学法处理样品；和用蛋白处理样品，所述蛋白能 与一种或多种氨基酸、肽和多肽中的一个或多个羧基结合。
22. 权利要求1的方法，其进一步包括使样品断裂。
23. 权利要求22的方法，其包括通过化学解聚来使样品断裂。
24. 权利要求23的方法，其中样品的化学解聚包括将样品与强酸或强碱^接触。
25. 权利要求22的方法，其包括通过酶促消化来使样品断裂。
26. 权利要求25的方法，其中通过酶促消化使样品断裂包括将样品与蛋 白酶接触，所述蛋白酶选自下组胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、 Glu-C、羧肽酶和它们的组合。
27. 权利要求25的方法，其包括通过将样品同时与多种蛋白酶接触来4吏 样品断裂。
28. 权利要求25的方法，其包括通过将样品依次与多种蛋白酶接触来使 样品断裂。
29. 权利要求1的方法，其包括将一种或多种含有至少一个修饰的C-末端的多肽链从样品中分离。
30. 权利要求1的方法，其中所述至少一个修饰的C-末端含有与其结合 的二乙跣胺部分。
31. 权利要求2的方法，其包括从包含结合了二乙酰胺部分的C-末端的 一种或多种多肽链释放胺。
32. 权利要求31的方法，其包括解聚所述一种或多种多肽链以从这一种 或多种多肽链释放胺。
33. 权利要求31的方法，其中所述胺为二乙胺。
34. 权利要求31的方法，其中通过选自下组的方法来检测胺气相层析 (GC)、气相层析-质谱、高效液相层析、液相层析-质谱、核磁共振、抗体检 测方法、拉曼光谱、毛细管电泳、液相层析、气相层析和离子层析。
35. 权利要求31的方法，其进一步包括用生色团将胺衍生化以形成衍生 化的胺，并通过高效液相层析检测该衍生化的胺。
36. 权利要求l的方法，其中样品中含有至少一个修饰的C-末端的多肽 链的量为大约7 mol。/。-大约20 mol%。
37. 权利要求36的方法，其中样品中含有至少一个修饰的C-末端的多 肽链的量为大约8 mol。/。-大约18 mol%。
38. 权利要求37的方法，其中样品中含有至少一个修饰的C-末端的多肽链的量为大约10mol。/。-大约15mol%。
39. 权利要求38的方法，其中样品中含有至少一个修饰的C-末端的多 肽链的量为大约12 moP/。-大约14 mol%。
40. 权利要求39的方法，其中样品中含有至少一个修饰的C-末端的多 肽链的量约为13mol%。
41. 权利要求9的方法，其中样品中含有至少一个^f'务饰的C-末端的多肽 链的量为大约60 mol。/Q-大约100 moI%。
42. 权利要求41的方法，其中样品中含有至少一个修饰的C-末端的多 肽链的量为大约75 mol。/。-大约100 mol%。
43. —种用于评估包含多肽混合物的样品的方法，该方法包括(a) 提供包含多肽混合物的样品，其中一种或多种多肽可能含有结合于其 C-末端的二乙酰胺部分；(b) 当样品中存在C-末端结合了二乙酰胺部分的一种或多种多肽时，解 聚所述样品以从C-末端结合了二乙酰胺部分的一种或多种多肽释放二乙胺；(c) 分析经解聚的样品，以测定其中释放的二乙胺的存在或量。
44. 权利要求43的方法，其中所述样品包含选自下组的多肽混合物共 聚物-1、衍生化的共聚物-1、断裂的共聚物-1、分级的共聚物-1和它们的组 合。
45. 权利要求43的方法，其中所述样品包含选自下组的多肽混合物共 聚物-1的一种或多种中间物、衍生化的共聚物-1中间物、断裂的共聚物-1 中间物、分级的共聚物-1中间物和它们的组合，其中所述中间物选自下组 如图1所示的中间物-I、中间物II和中间物III。
46. 权利要求43的方法，其包括通过化学解聚来解聚样品。
47. 权利要求46的方法，其中样品的化学解聚包括将样品与强酸或强碱 接触。
48. 权利要求43的方法，其包括通过酶促消化解聚样品。
49. 权利要求45的方法，其中通过酶促消化解聚样品包括将样品与蛋白 酶接触，所述蛋白酶选自下组胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、Glu-C、 羧肽酶和它们的组合。
50. 权利要求49的方法，其包括通过将样品同时与多种蛋白酶接触来解 聚样品。
51. 权利要求49的方法，其包括通过将样品依次与多种蛋白酶接触来解 聚样品。
52. 权利要求43的方法，其中通过选自下组的方法检测二乙胺气相层 析(GC)、气相层析-质谱、高效液相层析、液相层析-质语、核^兹共振、抗体 检测方法、拉曼光谱、毛细管电泳、液相层析、气相层析和离子层析。
53. 权利要求43的方法，其进一步包括用生色团将释放的二乙胺衍生化 以形成衍生化的二乙胺，并通过高效液相层析检测该书于生化的二乙胺。
54. 权利要求43的方法，其中样品中C-末端结合了二乙酰胺部分的多 肽的量为大约7 mol。/。-大约20 mol%。
55. 权利要求54的方法，其中样品中C-末端结合了二乙酰胺部分的多 肽的量为大约8 mol。/。-大约18 mol%。
56. 权利要求55的方法，其中样品中C-末端结合了二乙酰胺部分的多 肽的量为大约10mol。/。-大约15mol%。
57. 权利要求56的方法，其中样品中C-末端结合了二乙酰胺部分的多 肽的量为大约12mol。/。-大约14mol%。
58. 权利要求57的方法，其中样品中C-末端结合了二乙酰胺部分的多 肽的量为大约13mol%。
59. 权利要求45的方法，其中样品中C-末端结合了二乙酰胺部分的多 肽的量为大约60mol。/。-大约100 mol%。
60. 权利要求59的方法，其中样品中C-末端结合了二乙酰胺部分的多 肽的量为大约75 mol。/o-大约100 mol%。
61. —种测定共聚物-1样品的方法，该方法包4舌(a) 提供共聚物-l样品，其中所述共聚物-1样品可能包含C-末端结合了 二乙酰胺部分的 一种或多种多肽；(b) 测定所述共聚物-l样品中C-末端结合了二乙酰胺部分的多肽的存在 或量。
62. 权利要求61的方法，其中共聚物-1样品选自下组共聚物-1或其 中间物、断裂的共聚物-1或其中间物、分级的共聚物-1或其中间物和衍生化 的共聚物-l或其中间物，其中所述中间物选自下组如图1中所示的中间物-1、中间物ii和中间物m。
63. 权利要求61的方法，其进一步包括将共聚物-1样品中C-末端结合了二乙酰胺部分的多肽的量与预定的参考值比较。
64. 权利要求。的方法，其中所述参考值选自下组规范值、对照值和 直接测量共聚物-1的参考样品或其中间物的参考样品得到的数值，其中所述 中间物选自下组如图1中所示的中间物-I、中间物II和中间物III。
65. 权利要求64的方法，其中所述规范值包括醋酸格拉默的制药规范值。
66. 权利要求65的方法，其中所述醋酸格拉默的规范值为大约7mol。/o-大约20 mol%的多肽具有结合于其C-末端的二乙酰胺部分。
67. 权利要求66的方法，其中所述醋酸格拉默的规范值为大约8mol%-大约18mol。/。的多肽具有结合于其C-末端的二乙酰胺部分。
68. 权利要求67的方法，其中所述醋酸格拉默的规范值为大约10mol%-大约15moP/。的多肽具有结合于其C-末端的二乙酰胺部分。
69. 权利要求68的方法，其中所述醋酸格拉默的规范值为大约12mol%-大约14mol。/。的多肽具有结合于其C-末端的二乙酰胺部分。
70. 权利要求69的方法，其中所述醋酸格拉默的M^范值为大约13 mol% 的多肽具有结合于其C-末端的二乙酰胺部分。
71. 权利要求64的方法，其中所述参考值包括从共聚物-1中间物的参 考样品获得的值，其中所述中间物选自下组如图1中所示的中间物-I、中 间物II和中间物III。
72. 权利要求71的方法，其中所述从共聚物-1中间物的参考样品获得 的参考值为大约60 mol。/。-大约100 mol。/。的多肽具有结合于其C-末端的二乙 酰胺部分。
73. 权利要求72的方法，其中所述从共聚物-1中间物的参考样品获得 的参考值为大约75 mol。/。-大约100 mol。/。的多肽具有结合于其C-末端的二乙 酰胺部分。
74. 权利要求61的方法，其进一步包括基于共聚物-1样品中C-末端结 合了 二乙酰胺部分的多肽的存在或量来将所述共聚物-1样品分类。
75. 权利要求74的方法，其中所述将共聚物-1样品分类的步骤选自下 组确定样品是否适合药用，确定样品是否适合进行进一步处理步骤，和将 样品投放用于药用。
76. 权利要求61的方法，其中所述测定共聚物-1样品中C-末端结合了二乙酰胺部分的多肽的存在或量包括选自下组的方法液相层析、离子层析、气相层析、毛细管电泳、质谱、液相层析/质语、核磁共振谱、抗体检测方法、 拉曼光语、红外光谱、荧光光语、紫外-可见光语、凝胶电泳和它们的组合。
77. 权利要求76的方法，其中所述核磁共振方法选自下组 一维(1D) 核磁共振、二维(2D)核磁共振和三维(3D)核磁共振、！H核磁共振、13C核磁 共振、"N核磁共振和它们的组合。
78. 权利要求77的方法，其中所述核磁共振方法进一步包括定量核磁共 振信号以测定含有至少一个修饰的C-末端的多肽链的量。
79. 权利要求7S的方法，其包括通过选自下组的方法定量核磁共振信— 一 .(a) 积分归属为修饰的C-末端的一个或多个核磁共振峰；(b) 去巻积处理归属为修饰的C-末端的一个或多个核磁共振峰；(c) 将归属为修饰的C-末端的核磁共振信号以归属为包含多肽混合物的 共聚物、样品中掺杂的参考分子、外部样品、经校正的射频信号和它们的组 合的核磁共振信号之一为参考。
80. 权利要求77的方法，其中所述核磁共振方法进一步包括将样品与化 学变性剂接触。
81. 权利要求80的方法，其中所述化学变性剂选自下组尿素和胍。
82. 权利要求76的方法，其中抗体检测方法选自下组Western印迹、 亲和层析和酶联免疫吸附测定法(ELIS A)。
83. 权利要求61的方法，进一步包括在步骤(b)中测定共聚物-l样品中 C-末端结合了 二乙酰胺部分的多肽的存在或量之前将样品进行分级。
84. 权利要求83的方法，其包括通过选自下组的方法将样品分级液相 层析、离子层析、亲和层析、毛细管电泳和它们的组合。
85. 权利要求61的方法，其进一步包括在步骤(b)中分析样品之前将样 品进行纯化。
86. 权利要求85的方法，其包括通过选自下组的方法纯化样品凝胶电 泳；尺寸排阻层析；毛细管电泳；离子交换层析；反相液相层析；溶剂萃取； 沉淀；亲和层析；磷酸肽选择；低丰度氨基酸选择；将一种或多种氨基酸、 肽和多肽与亲和标签连接；对一种或多种氨基酸、肽和多肽的一个或多个羧 基进行转酯；用EDC/胺化学法处理样品；和用蛋白处理样品，所述蛋白能与一种或多种氨基酸、肽和多肽中的一个或多个羧基结合。
87. 权利要求61的方法，其进一步包括使样品断裂。
88. 权利要求87的方法，其包括通过化学解聚来^f吏样品断裂。
89. 权利要求88的方法，其中所述样品的化学解聚包括将样品与强酸或 强减j矣触。
90. 权利要求87的方法，其包括通过酶促消化使样品断裂。
91. 权利要求90的方法，其中所述通过酶促消化使样品断裂包括将样品 与选自下组的蛋白酶接触胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、Glu-C、 羧肽酶和它们的组合。
92. 权利要求90的方法，其包括通过将样品同时与多种蛋白酶接触来l吏 样品断裂。
93. 权利要求卯的方法，其包括通过将样品依次与多种蛋白酶接触来使 样品断裂。
94. 权利要求61的方法，其包括从包含结合了二乙酰胺部分的C-末端 的一种或多种多肽释放胺。
95. 权利要求94的方法，其包括解聚一种或多种多肽链以将胺从这一种 或多种多肽链中释放。
96. 权利要求94的方法，其中所述胺为二乙胺。
97. 权利要求94的方法，其中通过选自下组的方法来检测胺气相层析 (GC)、气相层析-质谱、高效液相层析、液相层析-质谱、核磁共振、抗体检 测方法、拉曼光镨、毛细管电泳、液相层析、气相层析和离子层析。
98. 权利要求94的方法，其进一步包括用生色团将胺衍生化以形成衍生 化的胺，并通过高效液相层析检测该衍生化的胺。
全文摘要
本发明公开主题内容提供了评估和表征肽、肽混合物和多肽混合物的方法。更加具体地说，本公开主题内容提供了评估或者表征复杂肽或多肽混合物的方法，所述混合物包含谷氨酸、丙氨酸、酪氨酸和赖氨酸，如共聚物-1或醋酸格拉默，所提供的方法包括但不限于鉴定、分离、定量和纯化其C-末端存在的羧基被二乙酰胺基团取代的氨基酸、肽、多肽及其组合。本发明公开方法可以用来测定其C-末端含有二乙酰胺基的多肽的摩尔百分比(mole percent)，也可以用来相对于另一种多肽混合物样品的一种或多种性质来评估一种多肽混合物样品的一种或多种性质。
文档编号G01N33/68GK101479607SQ200780024545
公开日2009年7月8日 申请日期2007年4月30日 优先权日2006年4月28日
发明者乔纳森·C·兰辛, 扎卡里·施赖弗, 朱祥平, 甘尼什·文卡塔拉曼, 科琳娜·鲍尔 申请人:莫门塔制药股份有限公司