专利名称：一种用于海水双壳类减数分裂器的免疫荧光显微观察方法
技术领域：
本发明涉及细胞化学及细胞免疫学，具体是一种用于海水双壳类减数 分裂器的免疫荧光显微观察方法。
背景技术：
海洋贝类是我国海水养殖的主导种类，在我国的海水养殖业中占有举足 轻重的地位。利用生物技术培育优良的养殖品种，是当前乃至未来发展海 水贝类养殖亟待解决的关键问题之一。受精是个体发育的前提和基础，是 苗种培育的第一步。在水产养殖生产中，受精的质量关系苗种培育的成败。
20世纪80年代以来，海水经济贝类的染色体操作和细胞工程育种技术 得到广泛研究，多倍体和非整倍体形成的受精生物学机制研究取得了许多 进展。此外在广泛开展的贝类杂交育种研究中，其受精过程的观察和受精 机制的研究是必要的组成部份。
国内外学者已经对牡蛎、珠母贝、贻贝、扇贝等主要经济双壳类的受精 过程进行了深入细致的观察与研究，研究手段从普通光学显微镜发展到荧 光显微镜、电子显微镜、激光共聚焦显微镜，研究内容涉及海水双壳类受 精相关事件。近年来，利用免疫细胞化学技术结合荧光显微观察，对海水 双壳类受精过程中相关细胞成分(如微管)的定位和动态变化的研究取得 了 一定进展。
在海水双壳类中开展的大量受精生物学研究表明绝大部分的海水双壳 类为卵生型，雌雄配子被排放到海水中完成受精过程。排放的卵子处于第 一次减数分裂前期(生发泡期)或中期。精子入卵后，受精卵恢复减数分 裂，形成减数分裂器(包括减数分裂纺锤体和染色体)，伴随减数分裂过程， 纺锤体和染色体发生一系列动态变化，形成雌雄原核并最终启动卵裂。
目前，对受精过程的染色体动态研究采用了各种染色方法，包括采用常 规碱性染料(地衣红、苏木精等)在普通光学显微镜下观察了长牡蛎、栉 孔扇贝的染色体行为，釆用荧光染料DAPI在荧光显微镜下观察榨孔扇贝和 泥蚶受精过程的染色体行为，但限于荧光强度有限，对比度较低，无法定 量研究染色体。前者虽然清晰度高，但其样品处理决定了只能适用于可见 光显微观察，无法开展荧光显微观察。上述技术方法均无法揭示纺锤体的 动态。
迄今国内外仅有一个关于利用荧光染色的方法观察长牡蛎Crasm^ea g^^减数分裂纺锤体形态的报道。该研究釆用免疫荧光间接法，第一步用 鼠抗卩微管蛋白抗体标记样品的微管，第二步用荧光素(F1TC)标记的羊 抗鼠抗体与第一抗体结合反应。免疫荧光间接法步骤较多，容易引起非特
3异性染色。由于其局限性，该方法未能得到推广应用。
综上所述，已报道的海水双壳类受精生物学研究所应用的荧光染色方法 多是对减数分裂器的一部分(纺锤体或染色体)进行观察，割裂了减数分 裂的生物学过程，无法揭示纺锤体和染色体的相互作用，妨碍了对受精机 理研究的进一步深入。在广泛借鉴动物细胞骨架免疫荧光显微研究技术的 基础上，本发明提供了一种用于海水双壳类减数分裂器的免疫荧光显微观 察方法，实现了同步观察减数分裂过程中的纺锤体和染色体动态，特异性 强，清晰度高，突破了海水双壳类受精生物学研究的技术瓶颈，显著提高 了研究效率。
发明内容
本发明的目的是提供了一种用于海水双壳类减数分裂器的免疫荧光显 微观察方法。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下
用于海水双壳类减数分裂器的免疫荧光显微观察方法，将样品经固定 等预处理、染色、制片后即可观察，将样品釆用质量百分比浓度2-6%多聚 甲醛的磷酸缓冲液(PBS)固定，再依次进行透化和封闭处理，而后对样品 纺锤体进行免疫荧光染色而后用含5-20 mg/L碘化丙锭的磷酸缓冲液对染 色体进行荧光染色；染色后将样品制片即可在荧光显微下观察。
将样品经固定液固定30-60 min,转入孵育液中透化30-60 min,采用封 闭液处理30-60 min;所述孵育液为体积百分比浓度0.5-1%的聚乙二醇辛基 苯基醚(TritonX-l00 )的PBS;所述封闭液为1-5%小牛血清白蛋白(BSA) 的PBS。样品的染色依次采用免疫荧光染色剂对纺锤体处理40-60 min和荧 光染色剂对染色体处理10min,釆用PBS处理5-20 min,所述免疫荧光染 色剂是由异硫氰酸荧光素(FITC )偶联的抗a微管蛋白抗体 (FITC國anti-a-tubulin)与PBS按体积比1:1000-5000配制。所述PBS缓冲 溶液浓度为0.2 mol/L, pH7.4。染色后样品转移到载玻片，加入防荧光淬 灭剂，封片，制成观察制片，在-2(TC避光条件下可保存2周；所述防荧 光淬灭剂为体积百分比浓度1-4% DABCO的甘油溶液。制片置于荧光 显微镜或激光扫描共聚焦显微镜下，以高压汞灯产生的紫外光为激发光， 采用FITC对应的滤光片，观察分辨纺锤体和染色体的形态、位置和数 量。所述样品包括各种海水双壳类的未受精卵及受精卵。
本发明具有如下优点
1. 操作简捷。本发明方法为直接免疫荧光法，较之已报道的两步免疫 荧光标记法，具有操作简单、省时的特点。
2. 清晰度高。本发明方法中样品的制备方法有效降低了非特异性荧光， 采用的荧光染料特异性强，利用荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜观察, 可满足定位和定量研究纺锤体和染色体的要求。
3. 研究效率高。本发明方法可以批量制备海水双壳类样品，批量观察受精卵发育过程中减数分裂器动态，显著提高海水双壳类受精生物学研究 效率。
综上，本发明方法是一种适用于海水双壳类减数分裂器，综合定性、 定位和定量，形态和功能密切结合的细胞学免疫荧光观察方法。
具体实施例方式
以下实施例并不局限在本发明中。 实施例1
利用本发明方法，进行长牡蛎受精卵减数分裂器免疫荧光显微观察，
具体操作为
1) 采用孔径为25pm的筛绢过滤，去除大部分的海水，获取牡蛎特定 发育阶段的受精卵10000个左右，盛于1.5mL离心管，以2000rpm离心4 min,去除上清的海水；加入约1 mL固定液10 min后，以2000rpm离心4 min,去上清，收集受精卵，而后加入lmL固定液中固定30min,待用。 所述固定液为2%多聚甲醛的磷酸缓冲液。
2) 取60粒左右受精卵转入孵育液中透化处理30min;所述孵育液为体 积百分比浓度0.5。/。的聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-lOO)的PBS溶液。
3) 弃掉孵育液，将受精卵转入封闭液中处理40min;所述封闭液为PBS 中加入质量比1%的小牛血清白蛋白。
4) 将受精卵转入微管荧光染色剂中，处理40min;再以PBS清洗受精 卵5min;所述微管荧光染色剂是由异硫氰酸荧光素(FITC)偶联的抗a微 管蛋白抗体(FITC-anti-a-tubulin )与PBS按体积比1:3000配制。
5 )将受精卵转入所述染色体荧光染色剂处理10 min;以PBS清洗受精 卵2次，每次5min;所述染色体荧光染色剂为PBS配制的5 mg/L碘化丙 锭(PI)。
6) 载玻片上滴一滴防荧光淬灭剂，将卵子转移到防荧光淬灭剂中，加 盖玻片，盖玻片四周以树脂封片；所述防荧光淬灭剂为体积百分比浓度 1%DABC0的甘油。
7) 将制片置于荧光显微镜下，釆用紫外光作为荧光的激发光，观察构 成减数分裂器的纺锤体和染色体；-2(TC下保存的制片，2周内可进行减数 分裂器的观察；荧光染色、洗卵、显微观察、保存制片应在黑暗环境下进 行，避免荧光淬灭。
所述PBS缓冲溶液浓度为0.2 mol/L, pH 7.4。 实施例2
与实施例1不同之处在于进行栉孔扇贝受精卵有丝分裂器免疫荧光 显微观察，具体操作为
1)釆用孔径为30pm的筛绢过滤，去除大部分的海水，获取栉孔扇贝 特定发育阶段的受精卵8000个左右，盛于1.5mL离心管，以1000 rpm离 心5min，去除上清的海水；加入约]mL固定液10 min后,以1000 rpm离心5min,去上清收集受精卵，而后加入lmL固定液中固定60min,待用。 所述固定液为4%多聚甲醛的磷酸缓冲液。
2)取30粒左右受精卵，转入孵育液中透化处理40 min;所述孵育液 为体积百分比浓度1%的聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)的PBS溶液。
3 )弃掉孵育液，将受精卵转入封闭液中处理60 min,所述封闭液为PBS 中加入质量比3%的小牛血清白蛋白。
4) 将受精卵转入微管荧光染色剂中，处理60min;再以PBS清洗受精 卵10min;所述微管荧光染色剂是由异硫氰酸荧光素(FITC )偶联的抗a 微管蛋白抗体(FITC-anti-a-tubulin)与PBS按体积比1:5000配制。
5) 将受精卵转入所述染色体荧光染色剂处理10 min;以PBS清洗受精 卵3次，每次5 min;所述染色体荧光染色剂为PBS酉已制的10mg/L缺化丙 锭(PI)。
6) 载玻片上滴一滴封片剂将卵子转移到防荧光淬灭剂中，加盖玻片， 盖玻片四周以树脂封片；所述防荧光淬灭剂为体积百分比浓度4% DABCO的甘油。
7) 将制片置于激光扫描共聚焦显微镜下，釆用紫外光作为荧光的激发 光，观察构成减数分裂器的纺锤体和染色体；-2(TC下保存的制片，2周内
可进行减数分裂器的观察；荧光染色、洗卵、显微观察、保存制片应在黑
暗环境下进行，避免荧光淬灭。
实施例3
与实施例1不同之处在于进行菲律宾蛤仔受精卵有丝分裂器免疫荧 光显微观察，具体操作为
1) 釆用孔径为30]im的筛绢过滤，去除大部分的海水，获取特定发育 阶段的菲律宾蛤仔受精卵5000个左右，盛于1.5mL离心管，以1000 rpm 离心5min,去除上清的海水；加入约1 mL固定液10 min后，以1000rpm 离心5min,去上清收集受精卵，而后加入1 mL固定液中固定50min,待 用。所述固定液为6%多聚甲醛的磷酸缓冲液。
2) 取40粒左右受精卵，孵育液透化处理60 min,所述孵育液为体积 百分比浓度0.8。/。的聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-lOO)的PBS溶液。
3) 弃掉孵育液，受精卵转入封闭液中处理60 min;所述封闭液为每 10mLPBS中加入500mg小牛血清白蛋白。
4) 将受精卵转入微管荧光染色剂中，处理50min;再以PBS清洗受精 卵8min;所述微管荧光染色剂是由异硫氰酸荧光素(FITC )偶联的抗a微 管蛋白抗体(FITC-anti-a-tubulin)与PBS按体积比1:2000配制。
5) 将受精卵转入所述染色体荧光染色剂处理10min;以PBS清洗受精 卵2次，每次5min;所述染色体荧光染色剂为PBS配制的10mg/L碘化丙 锭(PI)。
6) 载玻片上滴一滴封片剂将卵子转移到防荧光淬灭剂中，加盖玻片，盖玻片四周以树脂封片；所述防荧光淬灭剂按体积百分比为含3%
DABCO的甘油。
7)将制片置于荧光显微镜下，釆用紫外光作为荧光的激发光，观察构 成减数分裂器的纺锤体和染色体；-20°。下保存的制片，2周内可进行减数 分裂器的观察；荧光染色、洗卵、显微观察、保存制片应在黑暗环境下进 行，避免荧光淬灭。
实施例4
与实施例1不同之处在于进行硬壳蛤受精卵有丝分裂器免疫荧光显 微观察，具体搡作为
1) 采用孔径为30pm的筛绢过滤，去除大部分的海水，获取特定发育 阶段的硬壳蛤受精卵5000个左右，盛于1.5mL离心管，以1000 rpm离心 4min,去除上清的海水；加入约1 mL固定液10 min后，以1000rpm离心 4min,去上清收集受精卵，而后加入lmL固定液中固定45min,待用。所 述固定液为5%多聚甲醛的磷酸缓冲液。
2) 取30粒左右受精卵，孵育液透化处理45min,所述孵育液为体积百 分比浓度0.6%的聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-lOO)的PBS溶液。
3) 弃掉孵育液受精卵转入封闭液中处理50min;所述封闭液为每10mL PBS中加入400mg小牛血清白蛋白。
4) 将受精卵转入微管荧光染色剂中，处理45min;再以PBS清洗受精 卵6min;所述微管荧光染色剂是由异硫氰酸荧光素(FITC)偶联的抗ct微 管蛋白抗体(FITC-anti-a-tubulin)与PBS按体积比1:4000配制。
5 )将受精卵转入所述染色体荧光染色剂处理10 min;以PBS清洗受精 卵2次，每次5 min;所述染色体焚光染色剂为PBS酉已制的20mg/L碟化丙 锭(PI)。
6) 载玻片上滴一滴封片剂将卵子转移到防荧光淬灭剂中，加盖玻片，
盖玻片四周以树脂封片；所述防荧光淬灭剂按体积百分比为含4%
DABCO的甘油。
7) 将制片置于荧光显微镜下，采用紫外光作为荧光的激发光，观察构 成减数分裂器的纺锤体和染色体；-20°。下保存的制片，2周内可进行减数 分裂器的观察；荧光染色、洗卵、显微观察、保存制片应在黑暗环境下进 行，避免荧光淬灭。
实施例5
与实施例1不同之处在于，进行海湾扇贝受精卵有丝分裂器免疫荧光 显微观察，具体操作为
1)釆用孔径为30pm的筛绢过滤，去除大部分的海水，获取海湾扇贝 特定发育阶段的受精卵8000个左右，盛于1.5mL离心管，以1000 rpm离 心4 min,去除上清的海水；加入约1 mL固定液10 min后，以1000 rpm离 心4min，去上清收集受精卵，而后加入lmL固定液中固定55min,待用；所述固定液为3%多聚甲醛的磷酸缓冲液。。
2) 取40粒左右受精卵，孵育液透化处理55min;所述孵育液为体积百 分比浓度0.7%的聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-lOO)的PBS溶液。
3) 弃掉孵育液，将受精卵转入封闭液中处理55min，所述封闭液为每 10mLPBS中加入500mg小牛血清白蛋白。
4) 将受精卵转入微管荧光染色剂中，处理55min;再以PBS清洗受精 卵7min;所述微管荧光染色剂是由异硫氰酸荧光素(FITC)偶联的抗a微 管蛋白抗体(FITC-anti-a-tubulin)与PBS按体积比1:1000配制。
5 )将受精卵转入所述染色体荧光染色剂处理10 min;以PBS清洗受精 卵2次，每次5 min;所述染色体荧光染色齐lj为PBS酉己制的15mg/L碌化丙 锭(PI)。
6) 载玻片上滴一滴封片剂将卵子转移到防荧光淬灭剂中，加盖玻片， 盖玻片四周以树脂封片；所述防荧光淬灭剂按体积百分比为含4% DABCO的甘油。
7) 将制片置于激光扫描共聚焦显微镜下，釆用紫外光作为荧光的激发 光，观察构成减数分裂器的纺锤体和染色体；-20匸下保存的制片，2周内
可进行减数分裂器的观察；荧光染色、洗卵、显微观察、保存制片应在黑
暗环境下进行，避免荧光淬灭。
权利要求
1.一种用于海水双壳类减数分裂器的免疫荧光显微观察方法，将样品经固定等预处理、染色、制片后即可观察，其特征在于将样品采用质量百分比浓度2-6％多聚甲醛的磷酸缓冲液(PBS)固定，再依次进行透化和封闭处理，而后对样品纺锤体进行免疫荧光染色而后用含5-20mg/L碘化丙锭的磷酸缓冲液对染色体进行荧光染色；染色后将样品制片即可在荧光显微下观察。
2. 按权利要求1所述的用于海水双壳类减数分裂器的免疫荧光显微观 察方法，其特征在于将样品经固定液固定30-60 min,转入孵育液中透化 30-60 min,采用封闭液处理30-60 min;所述孵育液为体积百分比浓度 0.5-1%的聚乙二醇辛基苯基醚的PBS;所述封闭液为1-5%小牛血清白蛋白 的PBS。
3. 按权利要求1所述的用于海水双壳类减数分裂器的免疫荧光显微观 察方法，其特征在于样品的染色依次采用免疫荧光染色剂对纺锤体处理 40-60 min和荧光染色剂对染色体处理10 min,釆用PBS处理5-20 min，所 述免疫荧光染色剂是由异硫氰酸荧光素偶联的抗a微管蛋白抗体与PBS按 体积比1:1000-5000配制。
4. 按权利要求1、 2或3所述的用于海水双壳类减数分裂器的免疫 荧光显微观察方法，其特征在于所述PBS缓冲溶液浓度为0.2mol/L， pH 7.4。
5. 按权利要求1所述的用于海水双壳类减数分裂器的免疫荧光显微观 察方法，其特征在于染色后样品转移到载玻片，加入防荧光淬灭剂，封 片，制成观察制片，在-2(TC避光条件下可保存2周；所述防荧光淬灭剂 为体积百分比浓度1-4%DABC0的甘油溶液。
6. 按权利要求1所述的用于海水双壳类减数分裂器的免疫荧光显微观 察方法，其特征在于制片置于荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜下， 以高压汞灯产生的紫外光为激发光，釆用FITC对应的滤光片，观察分辨 纺锤体和染色体的形态、位置和数量。
7. 按权利要求1所述的用于海水双壳类减数分裂器的免疫荧光显 微观察方法，其特征在于所述样品包括各种海水双壳类的未受精卵 及受精卵。
全文摘要
本发明涉及细胞化学及细胞免疫学，具体应用于免疫荧光显微观察海水双壳类减数分裂器。本发明将样品经固定等预处理、染色、制片后即可观察，将样品采用质量百分比浓度2-6％多聚甲醛的磷酸缓冲液(PBS)固定，再依次进行透化和封闭处理，而后对样品纺锤体进行免疫荧光染色而后用含5-20mg/L碘化丙锭的磷酸缓冲液对染色体进行荧光染色；染色后将样品制片即可在荧光显微下观察。本发明适用于同步观测海水双壳类减数分裂器的纺锤体和染色体，具有操作简捷、清晰度高、研究效率高的优点，是一种综合定性、定位和定量，形态和功能密切结合的细胞学免疫荧光观察方法。
文档编号G01N21/64GK101639441SQ200810138849
公开日2010年2月3日 申请日期2008年8月1日 优先权日2008年8月1日
发明者张国范, 阙华勇 申请人:中国科学院海洋研究所