专利名称：：用于微粒的光学检测方法和光学检测装置的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种光学检测方法和光学检-测装置，用于单个地识别诸如细胞或者孩i珠的微粒。具体地说，本发明涉及一种光学检测方法和光学检测装置，其中，当特定波长的激光束照射到微粒上时，根据微粒所产生的荧光或散射光来识别^[效粒的类型。
背景技术：
：通常，当想要识别诸如细胞、微生物或者核糖体的涉及活体的d、颗并立时，例i口，3口在HiromitsuNAKAUCHI，"CellularEngineeringSeparateVolume,ExperimentProtocolSeries,MasterFlowcytometry",ShujunshaCo.Ltd.,第二片反，2006年8月31日(在下文中称为专利文献l)中所4皮露的，使用了利用流式细胞计量术或者流式细胞计数器的光学检测方法。流式细胞计量术是这样一种方法将特定波长的激光束照射到在流道中纟皮连续输送的一行^f鼓粒的一个上并检测该微粒产生的荧光或者散射光来逐个区分多个微粒。具体地说，在流式细胞中，层流是由包括检测对象的微粒的样品液体和在样品液体周围流动的鞘液(sheathliquid)构成的。此外，在样品液体和鞘液之间施加非常小的压力差将包4舌在样品液体中的多个微粒排列成行。如果，在这种状态下，将激光束照射到流式细胞上，那么樣t粒将逐个地穿过激光束。这时，利用电子光学检测光。'、"一'然后，将所检测到的光转换为电子信号和数值以执行统计分析，由此确定每个微粒的类型、大小、结构等。需要注意的是，如果检测对象的每个微粒用多种荧光染料来修饰，那么即使使用滤光片将所检测到的光分离为单独的波长带，来自非目标荧光染料的荧光染料的荧光有时也漏入不同于目标荧光染料的检测器的检测器中。因此，在现有技术的检测方法中，为了仅获得来自对象焚光的数据，通常执行减去荧光的叠加的荧光校正。此外，由于利用流式细月包计量术能够单个地识别樣t粒的类型、大小、结构等并且能够同时分析多个参数，所以即使在样品液体包括多种微粒的情况下，也可以仅快速并且确定地分配所需的微粒。同样，在过去已经提出了为了能够检测用多种荧光染料修饰的微粒所产生的多个荧光，引导具有彼此不同的波长的激光束沿着相同的入射光路从而照射到微粒上的流式细胞计量器。这种类型的流式细力包计量器在日本专利7>开第2007-046947号(在下文中称为专利文献1)中被披露。图12是示意性地示出了在专利文献1中披露的流式细胞计量器的构造。参照图12,流式细胞计量器101包括流式系统102,用于将用荧光染料修饰的细胞在流式细胞中排成一列；以及光学系统103,用于将具有4皮此不同的波长的多个激光束照射到细胞上从而检测诸如散射光和荧光的检测对象光。流式细胞计量器101还包括信号处理装置104，用于控制和处理与从光学枱r测系统103输出的散射光和荧光相关的电子信号。在现有技术的流式细胞计量器101中，从光源106a、106b和106c以;f皮此不同的相位，在预定周期内照射具有4皮此不同的波长的多个激光束。通过导光构件107将激光束导入相同的入射光路并会聚到细胞105上。因此，即使在多个激光束照射在用多种荧光染料标记的细月包上，也可以^使用一个入射光^各。因此，可以不i殳定延迟时间而检测从细胞发射的多个荧光。此外，还已才皮露了这样一种方法，其中，为了分配可用于再生医学、移植等的活细胞，目标对象细胞被分离并进行分配而不必执行荧光标记(其中，使用诸如结合了荧光染料的抗体的探针)。本方法披露于日本专利7>开第2003-304867号(在下文中称为专利文献2)中。在专利文献2所4皮露的方法中，冲企测^v细胞发射的向前散射光和向后散射光，并且细胞的检测值作为位置信息显示在二维屏幕上，从而识别细胞的大小和结构。
发明内容但是，在上述现有技术中的4全测方法和检测装置具有下列问题。具体地说，现有技术检测方法的第一个问题是，如果利用微粒产生的荧光或散射光的强度发生分配，那么上述荧光校正和基于荧光校正结果所执行的数据分析的精度将降低。例如，如果荧光或散射光的4全测亮度等级表示出超过三位数的差异，那么当在上述专利文献1中所披露的方法被用于检测的时候，较低亮度等级的信号将被噪声等级覆盖，而较高亮度等级的信号是饱和的。当为多个负极或者光电4企测器仅设置一个控制电压的时候，这个问题更加明显。因此，在现有技术中，当检测到具有高亮度等级的荧光或散射光时，用作激发光的激光束的强度和诸如PMT(光电倍增管)的光电检测器的灵敏度被设置为使信号等级不饱和的值。这提高了分析具有高亮度等级的荧光或散射光的精度。但是，由于低亮度等级的荧光或散射光的信号的输出波形的等级进一步减小，荧光输出信号的分析本身将变得困难。现有技术检测方法的第二个问题是，激光束照射有时会破坏微粒或者由于温度升高而导致微粒变质。此外，现有技术检测方法的第三个问题是，当温度很高时，修饰微粒的荧光染料将脱离微粒表面，当光强很高时，《啟粒会褪色。特别是当照射两个以上的激光束时以及当检测对象的微粒是细胞时，这些问题很容易发生。同时，在专利文献2中4皮露的方法关注于活细月包的分配并且试图防止由荧光染料结合引起的细胞变质。因此，该方法不考虑激光束的影响。因此，^/没通过类似于现有4支术方法的方法将激光束照射到细月包上。因此，在专利文献2中4皮露的方法不能避免激光束引起的微粒的a皮坏和变质。因此，需要提供一种用于微粒的光学检测方法和光学检测装置，即使在检测亮度等级之间存在巨大差异的多个荧光或者散射光的情况下，也能够得到高精度的荧光校正和数据分析以及高可靠性的检测，并且能够减少激光束引起的微粒的破坏和变质。根据本发明的实施例，提供了一种光学检测方法，包括以下步骤用激光束照射在流道中^皮连续输送的《效粒中的一个，并且冲企测由该微粒产生的荧光和/或散射光，该激光束被形成为这样的脉冲激光束，其脉冲强度被调节，从而使得一个激光束或者具有不同波长的两个或者更多个激光束用其变化的强度来多次照射一个微粒。在该光学检测方法中，对于各波长获得具有彼此不同的输出等级的多个^r测信号，结果，以多次激光束照射中的一次来获得适当等级的信号。因此，即使检测对象微粒产生的荧光和散射光的强度即使激光束的照射条件或者检测器的灵敏度不能单独调整，也能够预期高精度的检测。该光学冲企测方法可以被配置为，当孩t粒的流动速度由x(m/秒)来表示、激光束的光斑直径由y(m)来表示、激光束的调节次数由w(次)来表示以及激光束的波长数由n来表示的时候，激光束的月永冲宽度p(秒)满足以下表达式(1):rxx(w+1)xn(i)要注意的是，激光束的光斑形状可以是诸如圆形、椭圓形、正方形或者矩形的任何形状，并且当光斑形状是不同于圓形的任何形状时，在上述表达式(1)中的直径y被给定为在微粒经过方向上的光斑的3巨离。该光学检测方法可以被配置为，根据激光束强度将检测的荧光和/或散射光标准化。在这种情况下，-微粒的类型或者状态可以由标准化的值来识别。该光学4全测方法可以#1配置为，将具有4皮此不同的波长的两个或者更多个激光束用其^皮调节的脉沖强度和用4皮此移位的相位照射光。在该光学检测方法中，只有信号激发激光引起的光信号能够一皮牙企测到，因此，与同时照射多个激光束的可选情况相比，更容易进行荧光校正。在这种情况下，该光学4企测方法可以;故配置为，樣M立是用两种以上的荧光染料修饰的形式，并且通过逆矩阵分析来分析当照射一个激光束时所检测到的荧光或散射光，在逆矩阵分析中，未被激光束激发的任何一种荧光染料的参考光谱都被设定为零。在该光学检测方法中，用于荧光校正的逆矩阵分析的数值计算被简化，并且处j里时间;咸少。该光学检测方法可以被配置为，激光束是超短脉沖激光束。在该光学检测方法中，能够进一步减少对检测对象微粒的破坏并且微斗立变4寻不易^皮力口热。在这种情况下，该光学4企测方法可以还包4舌以下步艰《预先检测使检测对象微粒破坏的温度和/或光强度，根据检测的结果，调整脉沖激光束的照射强度、照射时间、照射波形、脉沖持续时间、相位、脉沖宽度和脉沖形状中的至少一个条件。这里的脉沖持续时间是脉冲宽度相对于周期的比率。根据本发明的另一个实施例，提供了一种光学检测装置，包括，光照射部，-故配置为用激光束照射在流道中^皮连续l命送的凝:粒中的一个；以及光检测部，被配置为检测激光束照射的任何微粒所产生的荧光和/或散射光，光照射部照射作为脉沖激光束的激光束并调节激光束的脉沖强度，从而使得一个激光束或者具有不同波长的两个或者更多个激光束用其变化的强度来多次照射一个^f敬粒。该光学检测装置可以被配置为，当微粒的流动速度由x(m/秒)来表示、激光束的光斑直径由y(m)来表示、激光束的调节次数由w(次)来表示以及激光束的波长数由n来表示的时候，激光束的脉冲宽度p(秒)满足上述表达式(1)。该光学^r测装置还可以包括4t据处理部，,皮配置为冲艮据激光束强度将检测的荧光和/或散射光标准化。在这种情况下，微粒的类型或者4犬态可以由标准〗匕的<直来识另u。该光学4企测装置可以^皮配置为，光照射部将具有4皮此不同的波长的两个或者更多个激光束用其被调节的脉沖强度和用彼此移位的相位照射到孩i粒上，并且光4全测部对于激光束的每个波长4企测樣丈粒所产生的荧光或散射光。在这种情况下，该光学才佥测装置可以:故配置为，当纟效粒是用两个种以上的荧光染料修饰的形式时，通过逆矩阵分析来分析当照射一个激光束时所检测到的荧光或散射光，在逆矩阵分析中，未被激光束激发的任何一种荧光染料的参考光谱都^t没定为零。激光束可以是超短脉冲激光束。在该光学4企测装置中，能够进一步减少对检测对象微粒的破坏并且微粒变得不易被加热。在这种情况下，该光学4企测装置还可以包4舌激光束控制部，#皮配置为根据预先检测出的使所检测的检测对象微粒破坏的温度和/或光强度的数据，调整脉冲激光束的照射强度、照射时间、照射波形、脉沖持续时间、相位、脉冲宽度和脉冲形状中的至少一个条件。在该光学检测方法和光学检测装置中，检测目标微粒可以是细胞或者孩"朱。利用该光学检测方法和光学检测装置，由于激光束一皮形成为脉沖激光束，所以能够减少激光束对孩丈粒的石皮坏和樣史粒的变质。此外，由于在照射激光束的同时对其脉冲强度进行调节，所以获得对于各个波长具有彼此不同的输出等级的多个检测信号。因此，即使在检测其间显示出亮度等级的巨大差异的多个荧光或散射光的情况下，也能够实现高精度和高可靠性的检测。图1是示出了根据本发明第一实施例的光学检测装置的总体构造的示意图2是示意性地示出了^f殷粒输送处理的示图3是示出了激光束照射模式的实例的图表；图4A~图4D是示出了在以图3示出的照射才莫式来照射激光束时所获得的4企测光谱的图表；图5是示出了在照射具有彼此不同的波长的两个不同激光束的情况下的照射模式的实例的图表。图6是示出了在才艮据本发明第二实施例的光学才企测方法中激光束的照射模式的实例的图表；的图表；图8是示出了不同荧光染料的激发波长的图表；图9A和图9B是示出了当冠状脉冲激光束照射到具有不同石皮坏强度的不同细胞上时的照射模式的图表；图IOA和图IOB是i兌明了当冠状月永冲激光束照射到用具有不同褪色等级强度的不同荧光染料修饰的微粒上时的照射模式的图表；图ll是示出了现有技术的激光束照射模式的图表；以及图12是总体上示出了在专利文献1中披露的现有技术的流式细胞计量器的构造的示意图。具体实施例方式首先，将描述根据本发明第一实施例的光学检测装置。图l示意性地示出了第一实施例的光学检测装置的构造。参照图1，所示的光学检测装置1包括光照射部4，用于将激光束5照射在流道2中以4亍流动的樹:粒3中的一个上；以及4企测部9，用于才企测激光束5所照射的樣i粒3所产生的荧光和/或散射光10。光学检测装置1的光照射部4包括，例如，激光振荡器6、反射镜7、聚光透镜8等，并且可以被配置为，由聚光透镜8聚焦激光振荡器6发射并通过反射镜7向流道2反射的激光束5，并将其照射在一个樣M立3上。在本实施例中光学检测装置1使用的激光振荡器6可以由诸如YAG(钇铝石榴石)激光器、半导体激光器或者飞秒激光器等固态激光器形成，但不是必须由上述激光器形成。换句话说，只要其能发射脉冲激光束并且能够调节脉冲强度，就可以响应于检测的内容等来适当地选择任何激光器。同时，光学检测装置1的检测部9包括诸如CCD(电荷耦合器件)检测器或者PMT(光电增倍管)检测器等的光检测装置11、分光元件(spectralizingelement)14、反射4竟12和聚光透4竟13。才企测部9可以被配置为，由微粒3发射的荧光和/或散射光10被聚光透4竟13聚焦并通过反射4竟12向反射光4企测装置11,并穿过分光元件14入射到光检测装置11上。这样，例如，在荧光将要被检测的情况下，在4企测部9中，入射荧光通过书于射光4册等分光以测量荧光语。本实施例的光学检测装置1可用作例如流式细胞计量器或者珠装酉己装置(beadassemblyapparatus)中。现在，将描述具有上述构造的本实施例的光学检测装置1的操作，即，利用光学检测装置1的光学检测诸如细胞或者微珠的微粒3的方法。要注意的是，在本实施例的4企测方法中^皮确定为检测目标的微粒3可用多种荧光染冲+来々务饰。图2示意性地示出了獨t粒3的输送过程。在本实施例的检测方法中，激光束5从光照射部4照射到在流道2中按行连续输送的微粒中的一个上。如图2所示，根据在流道2中按行排列微粒3的方法，例如，层流由包括检测目标微粒的样品液体21和样品液体21周围的鞘液22形成。此外，在样品液体21和鞘液22之间设置很小的压力差从而排列包括在样品液体21中的孩i粒。在这种情况下，通过将激光束照射在层流部23上，那么即4吏在样品液体21中包括多个樣i粒3，激光束5也能够逐一地照射在凝:粒3上。这样，在本实施例的4企测方法中，待从光照射部4照射的激光束5被形成为脉冲光束，并且脉冲光束的脉冲强度被调节，从而使得一个激光束或者不同波长的两个或者更多个激光束多次照射一个^f鼓粒3同时改变其强度。激光强度^皮调节的激光束5的照射必须在孩t粒3经过激光光斑24的同时完成。因此，优选设定照射n(n是大于或等于1的自然数)个不同波长的激光束的每个激光束5的脉沖宽度p(秒)以满足以下表达式(2):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>(2)其中，x是微粒3在流道2中输送的速度(m/秒)，y是激光束5的光斑直径(m)，以及w是激光束5的调节〗咅lt次ft并且大于或等于1。通过将激光束5的脉冲宽度p(秒)设置在上述表达式(2)的范围内，在强度调节形式下的脉冲激光束可确定地以每个强度来一次或多次地照射4企测目标-微粒3。这样，在本实施例的检测方法中，通过光检测装置11来检测微粒3响应于激光束5所发射的荧光和/或散射光10。同时，设置在才企测部9中的光冲企测装置11的灵每丈度净皮保持在固定状态。相反，在专利文献1中所4皮露的4企测方法中，通过在调整对PMT所施加的电压，即，用作光电检测器的PMT的灵敏度的同时，保持固定的激光束强度来校正检测值的偏差。在这种情况下，对PMT施力卩的电压必须以高速改变，并且具有技术困难的问题。相反，利用本实施例的冲企测方法，由于在改变力永沖强度的同时保持光冲企测装置11的灵每丈度固定，所以通过以高速改变用于激光束的入射电流就能够轻松地实现脉冲强度调节。特别是当半导体激光器被用作激光振荡器6的时候，激光束5的脉冲宽度、脉冲强度和脉冲波形能够在几MHz几百MHz的范围内以非常高的速度改变。在图3中说明了激光束5的照射模式的实例，其中横坐标轴表示时间而纵坐标轴表示强度。同时，当以图3中所示的才莫式照射激光束的时候所获得的检测矢量在图4A~图4D中示出，其中横坐标轴表示波长而纵坐标轴表示输出功率。具体i也i兌，图4A、图4B、图4C和图4D分别示出了当激光强度是Pwl、Pw2、Pw3和Pw4时的一企测光i普。在如图3所示，照射激光束同时脉沖强度逐步增加的情况下，例如，如果微粒用三种不同的荧光染料来修饰，那么将获得在图4A4D中所示的四个光i普。在才企测光i普中，在图4A中所示的枱r测光谱A(激光强度Pwl)示出了基本上等于噪声等级的输出等级。同时，在图4B中所示的^r测光i瞽B(激光强度Pw2)中，示出最低输出功率等级的通道的输出功率基本上等于噪声等级。在检测光谱D(激光强度Pw4)中，示出最高输出等级的通道的输出功率达到了々包和状态。另一方面，在图4C所示的才企测光i普C(激光强度Pw3)中，所有通道输出的信号等级都是足够高的。这样，可以认为，在获得的四个检测光谱中，检测光语C最适合用于数据分析并且也适合用于根据情况需要先于数据分析所执行的荧光校正。因此，在本实施例的冲企测方法中，在获得的才企测光语等之中，选才奪最适宜的一个以冲丸行数据分析，并且从数据分析所获得的柱状图等来识别微粒的类型或状态。具体地说，当微粒是细胞或者珠的时候，能够识别孩i粒的大小、形状、内部状态、表面状态、表面抗体反应等。要注意的是，检测光i普的比较方法不限制为依赖于输出值的方法，还可以例如，根据输出值的信噪比(SNR)来比较检测光语，从而选择最佳检测光i普。图5示出了横坐标轴表示时间和纵坐标轴表示强度的图表，并且示出了照射两个不同波长的不同激光束的照射才莫式的实例。在本实施例的冲企测方法中，也可能照射两个或者更多个不同波长的激光束。例如，如图5所示，也可能首先照射波长是人l的^^沖激光束同时调节其脉冲强度，然后再照射波长是的另一个脉冲激光束同时调节其脉沖强度。另一方面，当执行数据分析的时候，优选用激光束5的强度使荧光和/或散射光10的检测值标准化。具体地说，未示出的数据处理部^皮i殳置在光学4企测装置1中，并JUU亍例如基于激光束5的强度将由检测部9所检测的焚光和/或散射光10标准化的处理。以这种方式，用检测时的激光强度将荧光和/或散射光10的检测值标准化，能够对多种具有不同最佳激光强度的微粒执行荧光强度的绝对值比较。结果，通过比较荧光强度，例如，能够执行细胞抗体反应的比较、3朱表面反应中的绝对值比较和类似的比较。如上所述，在本实施例的微粒光学检测方法中，由于相同波长的激光束用其变化的强度多次照射在一个微粒上，所以获得多个具有不同输出功率的检测光镨。因此，通过从检测光谱中选择最佳等级的光i普来执行lt据分析，即使在4企测目标的孩t粒发射的荧光和/或散射光的亮度等级差异很大的情况下，检测精度也能够被提高。此外，在本实施例的检测方法中，由于脉冲激光束照射到微粒上，所以同激光束一直照射在孩M立上的现有纟支术的4企测方法相比较，能够减小对微粒的破坏并且能够抑制微粒的发热。这里，将描述作为本发明的第二实施例的由两种以上不同荧光染料修饰的微粒的光学检测方法。例如，当微粒用具有彼此不同的激发波长的两种以上的荧光染料来^f奮饰的时候，必须用两个以上具有彼此不同的波长的激光束来照射樣t粒。因此，在本发明的实施例中，将具有4皮此不同的波长X的两个或者更多个月永沖激光用其;f皮此移位的相位乂人光学4企测装置1的光照射部4照射到孩i粒上，同时调节脉沖强度。图6示出了横坐标轴是时间和纵坐标轴是强度的图表，并且示出了才艮据本实施例的光学4t测方法的激光束照射才莫式的实例。参照图6,在本实施例的检测方法中，具有彼此不同的波长的多个激光束分时地照射到微粒上，同时对每个波长调节脉沖强度。这样，检测部对于激光束的每个波长检测从每个微粒照射的焚光和/或散射光。在J见有4支术的才企测方法中，由于同时照射多个;敫光束，所以必须校正检测荧光信号。但是，在本实施例的微粒的光学检测方法中，由于具有4皮此不同的波长的两个或者更多个激光束用其4皮此替移位的相位来照射，并且对于激光束的每个波长检测微粒产生的焚光和/或散射光的强度，所以获得对应于单个激光束的光^f企测信号。结果，将有助于在下文中描述的荧光^&正处理，并且光强能够以高精度进行分离。在本实施例的光学4企测方法中，当微粒用两种以上的焚光染料来修饰，并且在荧光染料中的两种以上的荧光染料用同一个波长来激发的时候，需要对每种荧光染料执行分离所获得的检测光谱的荧光校正。要注意的是，当微粒只用一种荧光染料来修饰或者仅一种荧光染料由一个波长激发的时候，由于没有荧光泄露发生，所以不需要上述的荧光校正处理。图7A-图7C示出了横坐标轴表示波长和纵坐标轴表示输出功率的图表并示出了4姿照步骤顺序对4企测光谱进4亍的荧光才交正处理。当将要执行检测光谱的荧光校正处理时，首先从图7A所示的多个不同激光强度的检测光谱中选择用于荧光校正的最佳检测光语。例如，如果获得如图4A~图4D所示的检测光谱，则选择图4C所示的冲全测光谱C。这样，如图7B所示，根据微粒3所修饰的各荧光染料的参考光谱来执行检测光语C的波长分布分析。此外，执行数学运算处理，即，利用以下表达式(3h<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>所表示的逆矩阵的逆矩阵分析来计算各荧光的量或比例。要注意的是，在上述表达式(3)中，FU是每个荧光染料的量或者比例，an、bn、cn.....Zn是每个荧光染料的波长的比例，以及PMTn是每个波长的估计输出值。然后，如图7C所示，才艮据上述逆矩阵分析的结果将才企测光谱C分解为各荧光染料的强度。要注意的是，图7C示出了在用三种不同的荧光染料来修饰微粒的情况下，对于各染料的检测光镨的分解。然后，通过这种焚光校正使用对各染料所分解的光谱来执行数据分析，并且从数据分析获得的柱状图等来识别^f鼓粒的类型或状态。在这种情况下，优选通过逆矩阵分析获得的tt值利用激光束5的强度来进行标准化。具体地说，未示出的凄t据处理部被设置在光学检测装置l中，从而例如，其通过逆矩阵分析对于各焚光染料执行由检测部9检测到的荧光和/或散射光10的值的分解处理，并且基于激光束5的强度的对所得的值进行标准化。这种基于激光强度的标准化的实例示于下面的表1中。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>以这种方式，通过用在检测时的激光强度将通过荧光强度等级的逆矩阵所获得的值标准化，在包括具有不同的最佳激光强度的微粒的情况下，也能够执行接收的光强度的绝对值的比较。要注意的是，在上述的荧光校正处理中，当照射一个激光束所检测的荧光的逆矩阵分析将要被执行的时候，未被激光束激发的任何荧光染料的参考光谱在计算中可以被当作零。具体地说，在包括由激光束a激发的荧光染料a和d、由另一个激光束(3激发的另一个荧光染料b以及由又一个激光束y激发的又一个的荧光染料c的四个不同的荧光染料被用于微粒的修饰的情况下，具有不同波长的三个激光束ouP和Y分时地进^于照射，同时对于激光束的每个波长来检测从微粒发射的荧光和/或散射光，从而执行荧光校正处理。图8示出了横坐标轴表示波长和纵坐标轴表示激发效率的图表，并示出了荧光染料a和荧光染料d的激发波长。如果照射激光束a,那么两个不同的荧光染料，即荧光染料a和荧光染料d将被激发。因此，当照射激光束a时需要对光检测信号执行荧光校正处理，于是，可以使用荧光染料a和荧光染料d的参考光谱，同时关于荧光染料b和荧光染料c的参考光谱的矩阵项如以下表达式(4)所表示的那样被设定为零从而执行逆矩阵分析。alla12,.'aln00…000…0Ldiidi2…djj(4)其中，yiy。是照射激光束a时各波长的光检测信号，au-a^是各波长的荧光染料a的参考光谱，d~d^是各波长的荧光染料d的参考光谱，以及X广Xn是各荧光染料的量或比例。以这种方式，当将要执行荧光校正处理时，如果只使用不同激光束所激发的荧光染料的参考光谱，同时其他荧光染料的参考光谱净皮设定为零，从而冲丸行逆矩阵分析，那么计算时间能够:帔显著减少。结果，即^吏在獨t粒以多种颜色来着色的情况下，也能够在短时间内进4亍4全测和分析。部分的构造和作用与上述第一实施例的检测方法的那些相似。现在，将描述4艮据本发明第三实施例的光学才企测方法。本实施例的4企测方法与上文描述的第一和第二实施例的一企测方法相似，但_是将冠状的超短脉沖激光束(在下文中称为冠状脉冲)用于将要从光照射部照射的激光束。图9A图9B示出了当冠状脉冲激光束分别照射到具有不同破坏强度的细月包A和另一个细月包B时的照射才莫式。同时，图10A和图10B示出了当冠状脉冲激光束照射用具有不同^l逸色等级强度的荧光染料A和另一个荧光染料B所修饰的微粒时的照射模式。此外，图11示出了现有4支术的激光束照射才莫式。如图9A~图IOB所示，在本实施例的检测方法中，由于将要照射到微粒上的激光束被形成为冠状脉沖激光束，所以与通过如图11所示的连续照射激光束的检测方法相比较，用于检测荧光和散射光所照射的激光束的总光量能够减少。因此，对微粒的光破坏和微粒的温度升高能够被减少，而不会劣化微粒所产生的荧光或散射光的光发射强度。因此，可以对微粒进行分配并保持其状态而不会变质。此外，在本实施例的才企测方法中，可以响应于预先执行的检测使检测对象的微粒破坏的温度和/或光强度的检测结果，来调节诸如照射强度、照射时间、照射波形、脉冲持续时间、相位、脉冲宽度和脉冲形状等条件。分别利用恒温槽和光照射装置等，能够检测破坏检测目标的微粒的温度和光强。或者，在上述脉沖照射条件改变的时候，本发明的装置可以用于测量细胞的存活率和/或荧光珠的褪色程度。例如，关于细胞，如果温度变为约40度或者更高，那么细胞会受热损伤并且在检测之后的细胞的存活率低。此夕卜，例如，如果才企测对象的微粒是细胞，那么优选设置这样的条件，例如，照射强度是几mW-几百mW，照射时间是几ns几ms，照射波形是冠状脉沖波形并且脉冲持续时间是几个百分比~几十个百分比。以这种方式，响应于使检测目标的樣i粒破坏的温度和光强度，通过调节冠状脉冲激光束的照射强度、照射时间、照射波形、脉沖持续时间、相位、脉冲宽度、脉冲形状等条件，能够防止以前的修饰微粒的焚光染料的脱落和微粒的褪色等问题。要注意的是，上述的这些照射条件不必都被调整，但是可以调整至少一个这样的照射条件来获得上述效果。此外，本实施例的4企测方法能够通过照射例如来自图1所示的光检测装置1的光照射部4的一个冠状脉冲激光束或者不同波长的两个或更多个冠习犬月永冲纟敫光束(如图9A和图9B或图IOA和图10B所示)来执行。此外，在这种情况下，优选光学检测装置1包括未示出的数据库，用于存储使各种微粒3破坏的温度和/或光强度的检测结果；以及未示出的激光束控制部，用于根据存储在数据库中的检测结果调整冠状脉冲激光束的照射强度、照射时间、照射波形、脉冲持续时间、相位、^K冲宽度和^o中形状中的至少一个条件。利用光学^企测装置1，能够防止修饰微粒的荧光染料的脱落和微粒的褪色。要注意的是，数据库和激光控制部不必设置在光学检测装置1中。如上所述，利用本实施例的光学检测方法，由于将要照射到检测目标的纟效粒上的激光束^皮形成为冠状脉沖激光束，所以由此能够降低微粒的光接收量和温度增量，从而减少对微粒的破坏和微粒的变质。当检测诸如细胞等易变质的微粒的时候，本实施例的检测方法特别有效。要注意的是，本实施例的光学检测方法的上述部分之外的其他部分的构造和作用与上文所述的第一和第二实施例的检测方法的构造和作用相4以。尽管已经使用了具体条件来描述本发明的优选实施例，但是这样的描述仅用于实例的目的，并且应该理解在不背离所附权利要求的精神和范围的前纟是下，可以进4于更改和变形。权利要求1.一种光学检测方法，包括以下步骤将激光束照射到在流道中被连续输送的微粒中的一个上；并且检测由所述微粒所产生的荧光和/或散射光；所述激光束被形成为这样的脉冲激光束，该脉冲激光束的脉冲强度被调节，从而使得一个激光束或者具有不同波长的两个以上的激光束用变化的强度来多次照射一个微粒。2.根据权利要求1所述的光学检测方法，其中，在所述微粒的流动速度由x(m/秒)来表示、所述激光束的光斑直径由y(m)来表示、所述激光束的调节次数由w(次)来表示、并且所述激光束的波长数由n来表示的情况下，所述激光束的脉冲宽度p(秒)满足以下表达式(A):xx(w+l)xn(A)。3.根据权利要求1所述的光学检测方法，其中，根据所述激光束的强度将所述检测到的荧光和/或散射光标准化。4.根据权利要求3所述的光学检测方法，其中，所述微粒的类型或状态由所述标准化的值来识别。5.根据权利要求1所述的光学检测方法，其中，将具有彼此不同的波长的两个以上的激光束用所述经调节的力永冲强度和用独:此移位的相位来照射所述微粒，并且对于所述激光束的每个波长检测所述孩t粒产生的所述荧光和/或散射光。6.根据权利要求5所述的光学检测方法，其中，所述微粒是由两种以上不同荧光染料所修饰的形式，并且通过逆矩阵分析来分析当照射一个激光束时所;险测到的荧光或散射光，在所述逆矩阵分析中，未被所述激光束激发的任何一种荧光染料的参考光谱都被设置为零。7.根据权利要求1所述的光学检测方法，其中，所述激光束是超短脉冲激光束。8.根据权利要求7所述的光学检测方法，还包括以下步骤预先检测出使检测对象的微粒破坏的温度和/或光强度，根据所述检测的结果，调整所述脉沖激光束的照射强度、照射时间、照射波形、脉沖持续时间、相位、脉冲宽度和脉沖形状中的至少一个条4牛。9.根据权利要求1所述的光学检测方法，其中，所述孩丈粒是细胞或者微珠。10.—种光学4企测装置，包括光照射部，；f皮配置为将激光束照射到在流道中^皮连续输送的獨t粒中的一个上；以及光检测部，被配置为检测所述激光束照射的任何所述微粒所产生的荧光和/或散射光；所述光照射部照射作为脉冲激光束的激光束同时调节所述激光束的脉冲强度，从而使得一个激光束或者具有不同波长的两个以上的激光束用变化的强度来多次照射一个孩￡粒。11.根据权利要求10所述的光学检测装置，其中，在所述微粒的:流动速度由x(m/秒、)来表示、所述-敫光束的光5赶直径由y(m)来表示、所述激光束的调节次数由w(次)来表示、并且所述激光束的波长数由n来表示的情况下，所述激光束的脉沖宽度p(秒)满足以下表达式(A):P<yxx(w+1)xn(A)。12.根据权利要求IO所述的光学检测装置，还包括数据处理部，被配置为根据所述激光束的强度将所述检测到的荧光和/或散射光标准化。13.根据权利要求12所述的光学检测装置，其中，所述微粒的类型或状态由所述标准化的^直来识别。14.根据权利要求10所述的光学检测装置，其中，所述光照射部将具有4皮此不同的波长的两个以上的激光束用所述经调节的脉冲强度和用4皮此移4立的相位来照射所述4鼓粒，并且所述光才企荧光或者散射光。15.根据权利要求14所述的光学检测装置，其中，在所述微粒是由两种以上不同荧光染料所修饰的形式的情况下，通过逆矩阵分析来分析当照射一个激光束时所检测到的荧光或者散射光，在所述逆矩阵分析中，未#1所述激光束激发的任何一种荧光染料的参考光谱都^皮设置为零。16.根据权利要求IO所述的光学检测装置，其中，所述激光束是超短脉冲激光束。17.根据权利要求16所述的光学检测装置，还包括激光束控制部，被配置为才艮据预先4企测出的〗吏所;险测的检测对象的微粒破坏的温度和/或光强度的数据，调整所述脉沖激光束的照射强度、照射时间、照射波形、脉冲持续时间、相位、脉冲宽度和脉冲形状中的至少一个条件。18.根据权利要求10所述的光学检测装置，其中，所述微粒是细月包或者孩O朱。19.一种光学4企测装置，包括光照射装置，用于将激光束照射到在流道中^皮连续输送的樣^立中的一个上；以及光检测装置，用于检测所述激光束照射的任何所述微粒所产生的荧光和/或散射光；所述光照射装置照射作为脉冲激光束的激光束同时调节所述激光束的脉沖强度，从而使得一个激光束或者具有不同波长的两个以上的激光束用变化的强度来多次照射一个孩t粒。全文摘要本发明公开了一种用于微粒的光学检测方法和光学检测装置，所述装置包括光照射部，被配置为将激光束照射到在流道中被连续输送的微粒中的一个上；以及光检测部，被配置为检测激光束照射的任何微粒所产生的荧光和/或散射光；所述方法包括以下步骤将激光束照射到在流道中被连续输送的微粒中的一个上；并且检测微粒产生的荧光和/或散射光；其中，激光束被形成为这样的脉冲激光束，所述脉冲激光束的脉冲强度被调节，从而使得一个激光束或者具有不同波长的两个以上的激光束用变化的强度来多次照射一个微粒。文档编号G01N33/48GK101419171SQ20081017194公开日2009年4月29日申请日期2008年10月24日优先权日2007年10月26日发明者今西慎悟,篠田昌孝申请人:索尼株式会社