专利名称：：化妆品抗氧化能力的综合评价方法
技术领域：
：本发明涉及对护肤品、护理品等化妆品的性能评价，尤其涉及化妆品抗氧化(抗衰老)能力的综合评价方法。
背景技术：
：通常，活性氧(ROS)和活性氮(NOS)包括氧离子、自由基、过氧化物等有机物和无机物，这些粒子由于含有未成对的电子，极不稳定，具有很强的活性。环境中主要存在的ROS/NOS包括过氧化自由基、羟基自由基、超氧化物、单线态氧及过氧亚硝基。由于人的皮肤经常暴露在环境中，容易受到各种自由基的侵害，对皮肤造成有害的影响。ROS/NOS的清除剂(抗氧化物)能够提供配对电子，稳定那些处于活跃状态的自由基。通过消除ROS/NOS，抗氧化物能有效防御环境中的活性氧/活性氮，对人体皮肤起到保护作用。因此，生产商开始在化妆品(如护肤品、防晒油、防晒霜等)当中添加抗氧化物质，以抵抗环境中广泛存在的活性氧/活性氮等。鉴于此，化妆品制造商及广大消费者都希望通过某种技术方法了解所生产或使用的化妆品的抗氧化能力。同时，由于化妆品具有特有的化学配方并且直接涂抹在皮肤上，他们都希望了解化妆品在直接涂抹于皮肤状态时所具备的抗氧化能力。传统的评价化妆品抗氧化能力的方法，如US专利7，132，296，是将其溶解在一定的化学试剂中，或加入增溶剂、提取液等。这些方法破坏了化妆品原有的化学配方，不能评价其保持原有状态并直接涂抹到皮肤时的抗氧化能力。而且，传统的评价方法主要针对某一种ROS/NOS而使用单一的检测剂，只能评价化妆品针对某一种自由基的抗氧化能力。衰老理论指出，皮肤衰老主要是皮肤细胞中各种活性自由基长期积累造成的，因此，需要有一系列的方法来评价化妆品对各种活性氧/活性氮的抗氧化能力，各方法抗氧化能力的总和称为抗衰老系数APF。据申请人所知，目前尚无APF的综合评价方法。
发明内容本发明的目的是克服现有技术存在的不足，提供一种化妆品抗氧化能力的综合评价方法。为实现本发明的目的，化妆品抗氧化能力的综合评价方法，依次采用以下步骤进行配置乳液状基质，将化妆品样品溶解在不同的基质中并混匀，加入针对不同自由基的检测剂以及对应的活性氧/活性氮产生剂，在样品存在时、标准品存在时和空白状态下，分别检测溶液当中检测剂的荧光强度随时间的变化值，计算各种检测剂被氧化的初始反应速率，得出化妆品针对各种自由基的抗氧化能力，上述几个数值相加，得出化妆品的抗氧化系数APF值。进一步地，上述的化妆品抗氧化能力的综合评价方法，其中，所述APF值由ORAC、HORAC、NORAC、SORAC、SOAC中的一个或多个值相加得到。更进一步地，上述的化妆品抗氧化能力的综合评价方法，其中，所述标准品溶液包含检测剂、已知抗氧化能力的标准品和基质，所述空白溶液包含检测剂和基质；所述基质包含油、水及表面活性剂。更进一步地，上述的化妆品抗氧化能力的综合评价方法，其中，所述表面活性剂为十二烷基硫酸钠、甲基溴化铵或十二烷基铵。更进一步地，上述的化妆品抗氧化能力的综合评价方法，其中，所述检测剂为针对过氧化自由基和羟基自由基的DHR-6G，针对过氧亚硝基的DHR-123，针对超氧阴离子及单线态氧的HE。再进一步地，上述的化妆品抗氧化能力的综合评价方法，其中，所述活性氧/活性氮产生剂包括产生过氧化自由基的AAPH，产生羟基自由基的CoF2/Pa/H202，产生过氧化亚硝基的SIN-3，产生超氧阴离子的Xanthine/Xanthineoxidase,产生单线态氧的LithiumMolybate/sodiumhydroxide/hydrogenperoxide。采用本发明技术方案，能够在保持化妆品原有配方和状态的前提下，评价化妆品针对各种自由基的抗氧化能力，通过抗氧化(抗衰老)系数APF表示其总抗氧化能力的高低。其准确性和综合性，是现有技术所无法比拟的，可广泛应用于各种护肤品和护理品，如防晒油、防晒霜、清洁霜、面膜、洗发液、护发素，等化妆品的抗氧化能力的综合评价，其具体应用形式包括但不限于试剂盒、试纸、试剂棒等。图1是初始阶段荧光强度随时间变化的斜率，即初始反应速率(图中，横坐标时间，分；纵坐标荧光强度；InitialRate:初始速率)；图2是标准品的Vl/V2随其浓度变化的线性图3是针对过氧自由基，分别在样品存在时、标准品存在时及空白状态下，检测剂荧光强度随时间的变化曲线；图4是针对羟基自由基，分别在样品存在时、标准品存在时及空白状态下，检测剂荧光强度随时间的变化曲线；图5是针对过氧亚硝基，分别在样品存在时、标准品存在时及空白状态下，检测剂荧光强度随时间的变化曲线；图6是针对超氧阴离子，分别在样品存在时、标准品存在时及空白状态下，检测剂荧光强度随时间的变化曲线；图7是针对单线态氧，分别在样品存在时、标准品存在时及空白状态下，检测剂荧光强度随时间的变化曲线。具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明技术方案作进一步说明。这些例子仅是一些应用范例，不能理解为对本发明权利要求保护范围的一种限制。前面背景部分说过，传统的检测化妆品抗氧化能力的方法主要是在待测样品中加入各种化学物质，增溶剂和提取溶液等。然而，这些方法改变或破坏了化妆品原有的化学配方。因此，传统的检测方法不能用于检测化妆品样品。并且，传统的方法只使用针对一种活性氧或活性氮敏感的检测剂，不能综合评价化妆品的抗氧化能力。相比之下，本发明建立一种综合评价化妆品抗氧化能力的方法，同时又保持了化妆品原有配方，并且包括了生产商及消费者关心的环境中主要的活性氧/活性氮。该方法使用针对各种自由基的一系列检测剂，然后选用对应的自由基产生剂。该技术方法包括配置各种基质，分别溶解样品，加入对应的检测剂，活性氧/活性氮产生剂，检测在样品存在时，标准品存在时及空白状态下各自荧光强度随时间变化的情况。计算各检测剂被氧化的初始反应速率，得出样品在各检测剂下针对各种自由基的抗氧化值。最后，汇总得出抗衰老系数(APF)。此APF值由下列一个或多个值相加得到ORAC(抗过氧化自由基的值)，HORAC(抗羟基自由基的值)，NORAC(抗过氧亚硝基的值)，SORAC(抗超氧阴离子的值)，SOAC(抗单线态氧的值)。检测剂不含蛋白质，可提供氢原子，包括Dihydrorhodamine-6G(DHR画6G)，Dihydrorhodamine-123(DHR-123)，hydroethidine(HE)。依据活性氧/活性氮的不同种类选择相应的检测剂检测剂DHR-6G针对过氧化自由基和羟基自由基；DHR-123针对过氧亚硝基；HE针对超氧阴离子及单线态氧。活性氧/活性氮产生剂用来产生活性氧/活性氮。2,2-Azobis(2-amidino-propane)dihydrochloride(AAPH)产生过氧^f七自由基，cobaltfiiloride/picolinicacid/hydrogenperoxide(CoF2/Pa/H202)产生羟基自由基，3-morpholinosyndnoniminehydrochloride(SIN-3)产生过氧化亚石肖基，Xanthine/Xanthineoxidase产生超氧阴离子，LithiumMolybate/sodi腿hydroxide/hydrogenperoxide产生单线态氧。样品溶解在每种基质中，用混合器或乳化器混匀。每一种基质都由油、水及表面活性剂组成。标准品(包括VE)具有已知的抗氧化能力。标准品溶液包含检测剂、己知抗氧化能力的标准品和基质；空白溶液包含检测剂和基质。本发明提供评价化妆品针对环境中几种主要的ROS/NOS的抗氧化能力的一系列方法。这里用抗氧化系数(APF)表示。表1是本发明评价方法所使用的几种检测剂和自由基产生剂。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>此方法评价化妆品的抗氧化能力，其过程包括以下步骤配置基质，样品通过混合器或乳化器均匀溶解在基质中。基质由油(如亚油酸甲酯)、水及表面活性剂(如Tween20)组成。该乳液状基质不会改变或破坏化妆品原有的配方。也可以使用其它不改变或不破坏化妆品原有配方的基质，如油、水及十二烷基硫酸钠；油、水及甲基溴化铵；油、水及十二垸基铵等。加入检测剂。理想的检测剂不含蛋白质，最好能够提供氢原子。针对环境中不同的ROS/NOS选择不同的检测剂，如上表1所示，也可以使用其它非蛋白检测剂。加入活性氧/活性氮产生剂，用来产生针对以上不同检测剂的自由基。在样品存在时、标准品存在时和空白状态下，分别检测检测剂的荧光强度随时间的变化值。标准品溶液包括检测剂、标准品和基质，标准品具有己知的抗氧化能力(如VE)。空白溶液由检测剂和基质组成。计算检测剂被氧化的初始反应速率。例如，图1中初始速率V-120指的是初始阶段荧光强度变化的斜率。假设自由基产生剂不断地产生ROS/NOS，ROS/NOS的生成速率恒定并假设为0，生成的ROS/NOS与检测剂反应或被样品或标准品清除。检测剂和活性氧/活性氮反应生成检测剂的氧化产物。活性氧/活性氮与抗氧化剂反应生成抗氧化剂的氧化产物。假设ROS/NOS的浓度稳定，那么在没有抗氧化物存在的情况下ROS/NOS的消耗速率方程如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>抗氧化剂存在下的ROS/NOS消耗速率方程如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>因为ROS/NOS的消耗速率只由其产生剂决定，得到如下公式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>另一方面，在不含抗氧化剂(VI)和含抗氧化剂(V2)时，荧光强度的增加公式分别如方程(4)与(5):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>从上述方程可得出R=V。"—e]2[廳/薦]2+U颠W,[廳/薦]2…(6)因此，荧光强度在不含抗氧化剂(VI)和含有抗氧化剂(V2)时的增长率V1和V2的关系如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>..........................................(7)Vl/V2对抗氧化剂浓度在(0,1)得到线性曲线和截距，以及斜率kanti。xidant/kpr。be[pr0be]2。图2给出一标准品的Vl/V2随其浓度变化的图形121。斜率k反应了样品的抗氧化能力。斜率越大，抗氧化能力越强。样品的抗氧化能力计算方程如下Antioxidantcapacity=kSample/kstandard...........................(8)图3举例说明针对过氧自由基的ORAC方法中样品的抗氧化能力。检测剂和自由基产生剂见表1。样品存在时，检测剂荧光强度随时间的变化曲线如122，标准品存在时，检测剂荧光强度随时间的变化曲线如124。该例中，标准品为370pMVE。空白状态下，检测剂荧光强度随时间的变化曲线如126。样品存在时，标准品存在时，空白状态下，检测剂被氧化的初始反应速率分别如曲线128，130，132。用上述(1)到(8)方程计算化妆品样品的抗氧化能力。图4举例说明针对羟基自由基的HORAC方法中样品的抗氧化能力。检测剂和自由基产生剂见表1。样品存在时，检测剂荧光强度随时间的变化曲线如134，标准品存在时，检测剂荧光强度随时间的变化曲线如136。该例中，标准品为18.60mMVE。空白状态下，检测剂荧光强度随时间的变化曲线如138。样品存在时，标准品存在时，空白状态下，检测剂被氧化的初始反应速率分别如曲线140、142、144。用上述(1)到(8)方程计算化妆品样品的抗氧化能力。图5举例说明针对过氧亚硝基自由基的NORAC方法中样品的抗氧化能力。检测剂和自由基产生剂见表1。样品存在时，检测剂荧光强度随时间的变化曲线如146,标准品存在时，检测剂荧光强度随时间的变化曲线如148。该例中，标准品为464|iMVE。空白状态下，检测剂荧光强度随时间的变化曲线如150。样品存在时，标准品存在时，空白状态下，检测剂被氧化的初始反应速率分别如曲线152、154、156。用上述(1)到(8)方程计算化妆品样品的抗氧化能力。图6举例说明针对超氧阴离子的SORAC方法中样品的抗氧化能力。检测剂和自由基产生剂见表1。样品存在时，检测剂荧光强度随时间的变化曲线如158，标准品存在时，检测剂荧光强度随时间的变化曲线如160。该例中，标准品为2pMVE。空白状态下，检测剂荧光强度随时间的变化曲线如162。样品存在时，标准品存在时，空白状态下，检测剂被氧化的初始反应速率分别如曲线164、166、168。用上述(1)到(8)方程计算化妆品样品的抗氧化能力。图7举例说明针对单线态氧的SOAC方法中样品的抗氧化能力。检测剂和自由基产生剂见表1。样品存在时，检测剂荧光强度随时间的变化曲线如170，标准品存在时，检测剂荧光强度随时间的变化曲线如172。该例中，标准品为18.60nMVE。空白状态下，检测剂荧光强度随时间的变化曲线如174。样品存在时，标准品存在时，空白状态下，检测剂被氧化的初始反应速率分别如曲线176、178、180。用上述(1)到(8)方程计算化妆品样品的抗氧化能力。本发明评价化妆品抗氧化能力的方法不需添加其它化学物质，如增溶剂，提取液等。因此，该方法没有改变或破坏化妆品的原有配方，并且提供了产品使用于皮肤原始状态下抗氧化能力的评价方法。另外，该方法能够评价对环境中几种主要的自由基的抗氧化能力。针对环境中几种主要的自由基，本发明能够提供较为全面的抗氧化能力综合评价方法，得出化妆品的抗氧化系数(APF)。具体包括配置一系列基质，将样品溶解在不同的基质中混匀，加入针对不同自由基的检测剂以及针对不同检测剂的自由基产生剂(见表O，分别检测样品存在时、标准品存在时以及空白状态下，各检测剂荧光强度随时间的变化，计算每种检测剂的初始反应速率(见方程l-8)，得出化妆品针对每种自由基的抗氧化能力，几种值相加得到APF值。根据本发明一具体实例，某化妆品样品的APF值由下列几种方法的抗氧化值相加得到ORAC，HORAC，NORAC，SORAC，SOAC。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>当然，APF值不局限于上述几种方法值的和，也包含其它类似的抗氧化值。综上所述，可以得出以下结论本发明能够针对环境中存在的几种自由基综合评价化妆品的抗氧化能力，并得出总抗氧化系数(APF值)。该方法评价结果准确、客观，可广泛应用于各类护肤护理用品，其具体应用形式包括但不限于试剂盒、试纸、试剂棒等。权利要求1.化妆品抗氧化能力的综合评价方法，其特征在于依次包括以下步骤配置乳液状基质，将化妆品样品溶解在不同的基质中并混匀，加入针对不同自由基的检测剂以及对应的活性氧/活性氮产生剂，在样品存在时、标准品存在时和空白状态下，分别检测溶液当中检测剂的荧光强度随时间的变化值，计算各种检测剂被氧化的初始反应速率，得出化妆品针对各种自由基的抗氧化能力，上述几个数值相加，得出化妆品的抗氧化系数APF值。2.根据权利要求1所述的化妆品抗氧化能力的综合评价方法，其特征在于所述APF值由ORAC、HORAC、NORAC、SORAC、SOAC中的一个或多个值相加得到。3.根据权利要求1或2所述的化妆品抗氧化能力的综合评价方法，其特征在于所述标准品溶液包含检测剂、己知抗氧化能力的标准品和基质，所述空白溶液包含检测剂和基质；所述基质包含油、水及表面活性剂。4.根据权利要求1或2所述的化妆品抗氧化能力的综合评价方法，其特征在于所述表面活性剂为十二垸基硫酸钠、甲基溴化铵或十二垸基铵。5.根据权利要求1或2所述的化妆品抗氧化能力的综合评价方法，其特征在于所述检测剂为针对过氧化自由基和羟基自由基的DHR-6G，针对过氧亚硝基的DHR-123，针对超氧阴离子及单线态氧的HE。6.根据权利要求1或2所述的化妆品抗氧化能力的综合评价方法，其特征在于所述活性氧/活性氮产生剂包括产生过氧化自由基的AAPH，产生羟基自由基的CoF2/Pa/H202，产生过氧化亚硝基的SIN-3，产生超氧阴离子的Xanthine/Xanthineoxidase,产生单线态氧的LithiumMolybate/sodiumhydroxide/hydrogenperoxide。全文摘要本发明涉及化妆品抗氧化能力的综合评价方法，通过配置一系列乳液状基质，将化妆品样品溶解在不同的基质中并混匀，加入针对不同自由基的检测剂以及对应的活性氧/活性氮产生剂，分别检测在样品存在时、标准品存在时和空白状态下检测剂的荧光强度随时间的变化值，从而计算各种检测剂被氧化的初始反应速率，从而得出化妆品针对各种自由基的抗氧化能力，进而得到化妆品的抗氧化系数APF值。该方法能够在保持化妆品原有配方和状态的前提下，评价化妆品针对各种自由基的抗氧化能力，所得APF值较好地表示了化妆品的综合抗氧化能力，适用于以试剂盒、试纸、试剂棒等多种形式去评价各类护肤品和护理品。文档编号G01N21/76GK101672787SQ20091002596公开日2010年3月17日申请日期2009年3月16日优先权日2009年3月16日发明者季红平,艳寇,张利良,欧博信,近藤美和子申请人:苏州博思维科生物科技研发中心有限公司