专利名称：抗氧化剂、皮肤外用剂、化妆品和食品的制作方法
技术领域：
本发明涉及以西印度樱桃种子的提取物作为有效成分的抗氧化剂，使用该抗氧化剂的皮肤外用剂、化妆品和食品。
背景技术：
食品、化妆品、药品等物品中含有油脂类时，其储藏、保存、加工过程中的最大问题是空气中的氧导致的油脂成分等的氧化或过氧化。尤其是已知油脂中含有的亚油酸、亚麻酸等不饱和脂肪酸容易因为氧而过氧化，生成过氧化脂质或自由基，进而生成致癌物质。发生这样的氧化或过氧化，则不仅会产生着色、变色、变性、异味或营养价的有效性降低，还会产生有毒物质等，导致产品的品质变差。
因此，为了抑制上述不饱和脂肪酸的氧化和过氧化，防止品质变差，以往采用了各种抗氧化剂。抗氧化剂作用于氧化时产生的过氧化自由基，使氧化连锁反应终止，或者与自由基作用，使氧化反应终止。一直以来，抗氧化剂例如通常采用丁基羟基茴香醚(BHA)或丁基羟基甲苯(BHT)等合成抗氧化剂。但是近年来，随着合成抗氧化剂使用的增加，其安全性成为人们关注的问题，消费者的抗拒反应逐渐强烈，因此其用量正在减少。另外，这些合成抗氧化剂是油溶性的，难以应用在水溶液中。
另一方面，作为来自安全性高的天然产物的抗氧化剂例如已知有天然维生素E(α-生育酚)、维生素C等。但是，这些来自天然产物的抗氧化剂具有极端脂溶性或水溶性的性质，因此，其应用受到限制。另外，也具有其活性不能长时间稳定持续等缺点。
因此，人们需求抗氧化活性强、在水中的溶解性好、且抗氧化活性长时间稳定的来自天然产物的抗氧化剂。
还已知起到保持皮肤水分、使皮肤具有柔软性、弹性的物质是胶原或透明质酸等。胶原在皮肤中占真皮的90％，分布于整个真皮组织中，使皮肤保持适度的弹性和强度。透明质酸广泛分布于皮肤、关节液、玻璃体、韧带等有机体中，在皮肤中，担负着细胞粘附、细胞保护、皮肤组织的形成、组织的水分保护、柔软性的保持等功能。已知生物体内分解胶原的酶是胶原酶，分解透明质酸的酶是透明质酸酶，通过它们，胶原、透明质酸被分解，其量减少，皮肤就会失去润泽、张力，发生皮肤的老化现象—皱纹或松弛。
因此，有人提出了在皮肤外用剂或各种化妆品中混合抑制上述酶活性的物质等，期待具有防止皮肤的老化或防止皱纹的作用等，开发出各种胶原酶活性抑制剂或透明质酸酶活性抑制剂。
其中，西印度樱桃的果实作为含有丰富维生素C的植物，近年来广为人所知，目前，世界各国都将其用于饮料、保健食品。并且，含有丰富维生素C的西印度樱桃果实，由于其提取物中所含的维生素C而有望具有抗氧化作用等，在化妆品中也有所应用(日本专利第2814094号说明书(日本特开平2-200610号公报)、日本特开2000-212026号公报、日本特开2000-212027号公报、日本特开2000-212032号公报)。
但是，西印度樱桃的果实中，能够用作化妆品或食品的只是含有较多维生素的果肉，几乎未发现其种子的有效利用途径，目前大部分都被扔弃不用。最近，有人提出一种组合物，该组合物是通过水蒸气蒸馏法处理含有西印度樱桃种子的植物种子，得到的水蒸气蒸馏水有望具有改善皮肤感觉的效果，可混合到化妆品中(日本特开2001-226218号公报)。这有望成为更有效利用的途径。
对于上述西印度樱桃种子的含有成分及其作用等尚不为人所知。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗氧化剂，该抗氧化剂可以有效利用以往基本上被扔弃不用的西印度樱桃种子，安全性优异，可用于化妆品或食品，显示优异的抗氧化作用。
本发明的另一目的在于提供一种皮肤外用剂和化妆品，所述皮肤外用剂和化妆品有望具有稳定的抗氧化作用、胶原酶活性抑制作用或透明质酸酶活性抑制作用，安全性优异，有望具有防止皮肤老化、防止皱纹的作用。
本发明的其它目的在于提供有望具有稳定的抗氧化作用、安全性优异的食品。
本发明人为了解决上述目的，首先对以往果汁压榨后扔弃的西印度樱桃种子的有用性进行了深入研究。结果发现由西印度樱桃种子得到的提取物具有很强的抗氧化能力、胶原酶活性抑制能力和透明质酸酶活性抑制能力，从而完成了本发明。
本发明提供含有西印度樱桃种子提取物作为有效成分的抗氧化剂，还提供胶原酶活性抑制剂或透明质酸酶活性抑制剂。
本发明还提供含有上述抗氧化剂的皮肤外用剂或化妆品，又提供含有上述抗氧化剂、上述胶原酶活性抑制剂、上述透明质酸酶活性抑制剂的至少一种的皮肤外用剂或化妆品。
本发明又提供含有上述抗氧化剂的食品。
附图简述
图1表示通过柱层析对实施例1中制备的西印度樱桃种子提取物进行分级，用薄层色谱测定得到的各级分的抗氧化活性的结果的照片。
图2是表示吸光度随时间变化的图谱，用于测定实施例2-5中制备的西印度樱桃种子提取物的氧化率。
图3是表示实施例2-5中制备的西印度樱桃种子提取物在第14天的氧化率的图谱。
图4是表示实施例6中制备的西印度樱桃种子提取物在第20天的氧化率的图谱。
图5是表示吸光度随时间变化的图谱，用于测定实施例8中制备的西印度樱桃种子提取物的氧化率。
图6是表示实施例8中制备的西印度樱桃种子提取物在第7天的氧化率的图谱。
图7是表示吸光度随时间变化的图谱，用于测定由实施例9中的配方例5和比较配方例1制备的化妆水的氧化率。
图8是表示实施例10中配方例5的化妆水为期6个月的DPPH自由基清除试验结果的图谱。
图9是表示实施例10中配方例6的化妆水为期6个月的DPPH自由基清除试验结果的图谱。
实施发明的最佳方式以下对本发明进行详细说明。
本发明的抗氧化剂含有西印度樱桃种子提取物作为有效成分，该提取物也可作为胶原酶活性抑制剂和透明质酸酶活性抑制剂的有效成分。
西印度樱桃种子是原产于大西洋加勒比海西印度群岛的西印度樱桃(Acerola，学名Malpighia emarginata DC)的种子。
已知西印度樱桃果肉中维生素C丰富，被用于食品、化妆品等中，但对于其种子，则几乎未见其有效利用的途径。
西印度樱桃种子提取物只要是例如用提取溶剂提取的即可，对此并没有特别限定，只要具有亚油酸自氧化抑制能力或DPPH自由基清除作用等抗氧化功能，则对其提取方法或条件没有特别限定。另外，对西印度樱桃种子的产地和品种也没有任何限制，例如产地有冲绳、巴西。
西印度樱桃种子提取物是指例如将新鲜的西印度樱桃种子、其干燥物或冷冻物进行粉碎加工，加入水和/或有机溶剂提取得到的提取物；将所得提取物进行浓缩的浓缩物；以及进一步通过液液提取或柱层析等将上述提取物或浓缩物分级提纯的分级提纯物；上述干燥固化物的总称；也指其形态可以是液状、糊状、固体的任意形式。
为获得上述提取物而使用的有机溶剂可以是任意的亲水性有机溶剂、疏水性有机溶剂。亲水性有机溶剂例如有甲醇、乙醇、甘油、丙二醇、1，3-丁二醇等醇；丙酮、四氢呋喃、乙腈、1，4-二噁烷、吡啶、二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、乙酸等公知的有机溶剂。疏水性有机溶剂例如有己烷、环己烷、四氯化碳、氯仿、二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、二乙醚、乙酸乙酯、苯、甲苯等公知的有机溶剂。这些有机溶剂在使用时可以使用1种，或将2种以上组合使用。其中，优选水和/或亲水性有机溶剂、特别是甲醇、乙醇、1，3-丁二醇，水或它们的混合物或组合。
对于提取条件并没有特别的限定，例如温度5-95℃、优选10-90℃、进一步优选15-85℃，在常温下也可提取。温度越高，则提取效率有增高趋势。提取时间为数小时-数天，提取所使用的溶剂量相对于原料，按重量比通常为1-20倍量，优选2-10倍量。
对于提取操作没有特别限定，可以按照常规方法进行。为了提高提取效率，可以进行振荡提取，使用具备搅拌机等的提取机进行提取。例如，将西印度樱桃种子浸渍于提取溶剂中，或不浸渍、与提取溶剂一起搅拌、振荡，进行提取处理，通过过滤、离心分离或滗析等将处理液分离为提取液和提取残余物，由此进行提取处理，提取残余物可进一步进行同样的提取处理。所得提取液可直接使用，也可以根据需要进一步进行浓缩处理和/或分级、提纯处理。
对于上述浓缩处理并没有特别限定，例如有除去溶剂，利用与水和/或有机溶剂的溶解性的可溶解组分的回收处理，不溶解组分的回收处理，通过水-疏水性有机溶剂的液液分配处理，重结晶处理，再沉淀处理，回收因冷却而产生的析出物的处理等，或者将选自上述处理的2种以上的处理组合的方法等。
对于上述分级、提纯处理并没有特别限定，例如通过正相和/或反相色谱进行的处理等。
优选作为本发明抗氧化剂的有效成分的西印度樱桃种子提取物含有栎苷。另外，作为胶原酶活性抑制剂和透明质酸酶活性抑制剂的有效成分的西印度樱桃种子提取物也可以含有栎苷。
本发明的抗氧化剂、以及胶原酶活性抑制剂和透明质酸酶活性抑制剂中，有效成分西印度樱桃种子提取物的用量可根据使用形式等进行适当选择。
本发明的皮肤外用剂和化妆品含有上述本发明的抗氧化剂。本发明还可提供含有选自上述抗氧化剂、胶原酶活性抑制剂、透明质酸酶活性抑制剂的至少一种物质的皮肤外用剂和化妆品。
对于上述化妆品的种类没有特别限定，例如有化妆水、乳液、霜膏、面膜、洗净剂等皮肤护理化妆品；口红、粉底等彩妆化妆品；发用化妆品等，其剂型没有特别限定，可以是任意的。另外，皮肤外用剂有软膏、各种皮肤用药等。
本发明的皮肤外用剂和化妆品中，本发明的抗氧化剂、以及胶原酶活性抑制剂或者透明质酸酶活性抑制剂的混合比例可根据其种类和混合的其它成分的种类或量、形态等适当选择，通常，相对于皮肤外用剂或化妆品总量，换算为西印度樱桃种子提取物的干燥物，为0.001-20％重量，优选0.01-10％重量。
在不损害本发明所希望的效果的范围内，本发明的皮肤外用剂或化妆品中可以混合通常作为皮肤外用剂原料或化妆品原料使用的各种其它成分。其它成分例如有水、油剂、表面活性剂、润滑剂、醇类、水溶性高分子剂、凝胶化剂、保湿剂、缓冲剂、防腐剂、抗炎剂、增稠剂、香料、维生素类、本发明的抗氧化剂以外的抗氧化剂等。使用时，可以从其中适当选择1种或2种以上进行混合。
本发明的食品只要含有上述本发明的抗氧化剂即可，对食品的种类并没有特别限定，例如可以是糖、饮料、果酱、口香糖等。对其剂型并没有特别限制，可以是任意的。
本发明的食品中，本发明的抗氧化剂的混合比例可根据食品种类和该食品中混合的其它成分的种类或量、形态等适当选择，通常，相对于食品总量，换算为西印度樱桃种子提取物的干燥物，为0.001-20％重量，优选0.01-10％重量。
在不损害本发明所希望的效果的范围内，本发明的食品中可以混合通常作为食品原料使用的各种其它成分。其它成分例如有水、醇类、甜味剂、酸味剂、着色剂、防腐剂、香料、赋型剂等。使用时，可以从其中适当选择1种或2种以上进行混合。
本发明的抗氧化剂，以及透明质酸酶活性抑制剂和胶原酶活性抑制剂是以西印度樱桃种子提取物为有效成分，安全性优异，且具有很强的抗氧化作用、透明质酸酶活性抑制作用或者胶原酶活性抑制作用。本发明的皮肤外用剂、化妆品和食品含有本发明的抗氧化剂、以及透明质酸酶活性抑制剂或者胶原酶活性抑制剂，因此可得到抗老化作用、防皱纹作用、源自活性氧的食品品质保持或防止氧化的作用。除此之外还可以有效利用作为工业废弃物的西印度樱桃种子。
实施例以下通过实施例进一步详细说明本发明，但本发明并不限于这些。
实施例1将洗净的西印度樱桃种子干燥后破碎，得到6140g粉碎物，向其中加入7倍重量的甲醇，在室温下搅拌过夜。将总量离心后过滤，将滤液浓缩干燥固化，得到225.89g提取物(A)。
向该提取物(A)中加入2000ml水，再加入1200ml己烷并振荡后，回收分离出的水层。对该水层再重复两次使用己烷的同样的振荡。除去己烷层，向得到的水层中加入1200ml乙酸乙酯进行振荡，将该操作重复10次，收集分离的乙酸乙酯层，浓缩干燥固化，得到11.48g浓缩物(A)。接着，使用充填了硅胶(Wakosil C-300和光纯药社制造)的柱子，通过硅胶柱层析将浓缩物(A)分级。用氯仿、氯仿∶甲醇(97∶3、9∶1、8∶2、6∶4、4∶6、2∶8)、甲醇依次洗脱。将氯仿洗脱的部分分成15个组分(组分1-15)，将之后的氯仿∶甲醇洗脱部分分别作为组分16(97∶3)、17(9∶1)、18(8∶2)、19(6∶4)、20(4∶6)。
通过使用薄层色谱(TLC)的评价方法确认各组分的抗氧化活性。即，将各组分试样点样于硅胶薄层板，用展开溶剂进行展开。此时使用含有荧光指示剂的板(K5F Silica Gel 150Whatman制造)，展开后对干燥的板照射紫外线，检测具有UV吸收的试样斑点。然后对板喷稳定的自由基—二苯基对苦基肼(DPPH)的6×10-4M甲醇溶液。DPPH溶液呈紫色，但如果自由基被清除，则其颜色消失。因此，具有自由基清除活性的物质的斑点部分中，因DPPH自由基被清除而使斑点部分露白。
将组分1-20点样于硅胶板，用氯仿∶甲醇＝9∶1的溶剂将其展开至板顶端，然后喷雾DPPH溶液。结果如图1所示。由图1可知西印度樱桃种子提取物中含有具抗氧化活性的多种物质。
其中，通过反相高效液相色谱(HPLC)进一步纯化组分19。先通过下述洗脱条件进行粗提纯，再通过以下的条件进行提纯。HPLC的条件如下所示。
柱Hydrosphere C-18[20×250mm](YMC)、流速5ml/分钟、温度35℃检测UV 254nm、洗脱液在30％甲醇(0-2分钟)、30-100％甲醇(2-32分钟、线性)、100％甲醇(32-40分钟)、30％甲醇(40-50分钟)的条件下粗提纯，然后用乙腈/水(30/70)进行最终提纯，得到72mg分级提纯物。
对所得分级提纯物进行各种谱测定。所得数据如下。
质谱[M-H]-447紫外线吸收光谱(EtOH)256.5nm、352.00nm、H-NMR化学位移500MHz溶剂CD3OD、0.94ppm(dJ＝6.1Hz)、6.91ppm(dJ＝8.2Hz)、7.31ppm(d，dJ＝8.2，2.1Hz)、7.34ppm(dJ＝2.1Hz)、6.20ppm(dJ＝2.1Hz)、6.37ppm(dJ＝2.1Hz)、3.33ppm(mJ＝9.5，9.3Hz)、3.41ppm(mJ＝9.5Hz)、3.74ppm(d，dJ＝9.3，3.3Hz)、4.21ppm(d，dJ＝3.3Hz)、5.35ppm(dJ＝1.7Hz)、C-NMR化学位移125.8MHz溶剂CD3OD、17.7ppm、72.0ppm、72.1ppm、72.2ppm、73.3ppm、94.8ppm、99.9ppm、103.6ppm、106.0ppm、116.4ppm、117.0ppm、122.9ppm、123.1ppm、136.3ppm、146.5ppm、149.9ppm、158.6ppm、159.4ppm、163.3ppm、166.0ppm、179.7ppm。
质谱中，在m/z 447观察到被认为是去质子化分子的离子，分子量可认为是448。H-NMR中，0.94ppm为CH3，6.91ppm、7.31ppm、7.34ppm属于1，2，4-取代苯，6.20ppm、6.37ppm属于1，2，3，5-取代苯的1H。3.33-5.35ppm中观测到5种峰。13C-NMR谱中观测到21个峰，其中70-74ppm的4个峰可能是＞CH-O-，179.7ppm中观测到可归属为共轭羰基的峰。这些数据显示所述物质可能是栎精糖苷，因此进一步进行了高分辨能力质谱的测定，并与作为栎精糖苷的分子量448的栎苷标准品的NMR谱进行了比较。进行高分辨能力质谱测定的结果，得到447.0917的精密重量，以C、H、O作为元素种类进行组成计算。结果计算出满足13C-NMR谱中观测到的碳原子数21的组成式C21H19O11，确定了分子式为C21H19O11。进一步将NMR谱与栎苷(栎精-3-鼠李糖苷)标准品的谱进行比较，结果一致，因此鉴定出由西印度樱桃种子提取物分离提纯的物质是栎苷。
已知栎苷是类黄酮的一种，在自然界中广泛分布，特别是在鱼腥草中丰富含有。由以上的结果判断西印度樱桃种子中含有栎苷，该栎苷是与提取物中的抗氧化活性有关的物质之一。
实施例2将100g洗净的西印度樱桃种子破碎，加入3倍体积的水，在室温下振荡一晚。将总量用玻璃滤器、0.65μm滤器和0.22μm滤器过滤，然后将滤液浓缩干燥固化，得到1g提取物。
接着，通过使用亚油酸的抗氧化活性测定(硫氰酸铁法)，对得到的提取物的抗氧化活性进行测定。
即，在2ml 2.5％(w/v)亚油酸(99.5％乙醇溶液)和4ml 0.05M磷酸缓冲液(pH 7.0)的反应液中混合含有0.4mg西印度樱桃种子提取物、2ml 99.5％乙醇和2ml蒸馏水的混合液，装入褐色螺口瓶，制备10ml试验液。另外使用α-生育酚或BHA代替西印度樱桃种子提取物，使反应液中含有与西印度樱桃种子提取物等量的上述物质，进行同样的操作，制备各试验液，以它们作为正对照。对照组采用不添加西印度樱桃种子提取物、只将2ml 99.5％乙醇和2ml蒸馏水添加到反应液中的试验液。将所得各试验液置于暗处，在40℃保存，以此作为样品，将在4℃保存的作为空白试样，隔一段时间取出被检物，按照以下的方法进行测定。试验进行14天。
首先，在0.1ml被检物、9.7ml 75％乙醇和0.1ml 30％硫氰酸铵水溶液的混合液中加入0.1ml 2×10-2M的氯化亚铁(3.5％盐酸溶液)，3分钟后准确测定500nm的吸光度。对于空白试样也同样测定，Δ吸光度＝(主体样品的吸光度)-(空白样品的吸光度)。试样开始氧化，则吸光度上升，达到最高点后，随着要被氧化的试样的减少，吸光度减小。因此，吸光度的峰早开始，则可以说抗氧化活性弱。另外，用氧化率对各试验液的抗氧化活性进行比较。氧化率是以对照的氧化(Δ吸光度)为100％，通过以下的式子求出。氧化率越高则意味着抗氧化活性越低。
氧化率(％)＝([试样的Δ吸光度]/[对照的Δ吸光度])×100吸光度随时间变化的结果如图2所示，试验开始后第14天各试样溶液的氧化率如图3所示。图3中，(C-1)表示对照，(C-2)表示α-生育酚，(C-3)表示BHA，(E-2)表示实施例2中制备的西印度樱桃种子提取物，(E-3)表示实施例3中制备的西印度樱桃种子提取物，(E-4)表示实施例4中制备的西印度樱桃种子提取物，(E-5)表示实施例5中制备的西印度樱桃种子提取物。
实施例3将100g洗净的西印度樱桃种子破碎，加入3倍体积、乙醇含量为25％体积的含水乙醇水溶液，在室温下振荡一晚。将总量用与实施例2同样的滤器过滤，然后将滤液浓缩干燥固化，得到1.69g提取物。
用得到的提取物，与实施例2同样地测定抗氧化活性。吸光度随时间变化的结果如图2所示，试验开始后第14天各试样溶液的氧化率如图3所示。
实施例4将100g洗净的西印度樱桃种子破碎，加入3倍体积、乙醇含量为50％体积的含水乙醇水溶液，在室温下振荡一晚。将总量用与实施例2同样的滤器过滤，然后将滤液浓缩干燥固化，得到2.27g提取物。
用得到的提取物，与实施例2同样地测定抗氧化活性。吸光度随时间变化的结果如图2所示，试验开始后第14天各试样溶液的氧化率如图3所示。
实施例5将100g洗净的西印度樱桃种子破碎，加入3倍体积、乙醇含量为75％体积的含水乙醇水溶液，在室温下振荡一晚。将总量用与实施例2同样的滤器过滤，然后将滤液浓缩干燥固化，得到2.50g提取物。
用得到的提取物，与实施例2同样地测定抗氧化活性。吸光度随时间变化的结果如图2所示，试验开始后第14天各试样溶液的氧化率如图3所示。
图2和3表明西印度樱桃种子提取物明显具有抑制亚油酸氧化的效果，其强度与代表性的抗氧化剂α-生育酚、BHA比较，为同等或同等以上。并且，实施例2-5的结果表明通过改变作为提取溶剂使用的含水乙醇中乙醇的比例，可以控制抗氧化活性的强度。
实施例6将760g洗净的西印度樱桃种子破碎，加入5倍重量的甲醇，在室温下搅拌过夜。将总量离心后过滤，将滤液浓缩干燥固化，得到12.36g提取物。向该提取物中加入300ml水，再加入100ml己烷并振荡，然后回收分离出的水层。对该水层再重复3次使用己烷的同样的振荡。除去己烷层，向得到的水层中加入100ml乙酸乙酯进行振荡，将该操作重复6次，收集乙酸乙酯层，浓缩干燥固化，得到0.41g固体成分。
接着，用与实施例2同样的硫氰酸铁法测定所得西印度樱桃种子提取物的抗氧化活性。此时试验期间为20天。试验开始后第20天各试样溶液的氧化率如图4所示。图4中，(C-1)表示对照，(C-2)表示α-生育酚，(C-3)表示BHA，(E-6)表示实施例6中制备的西印度樱桃种子提取物。
图4表明西印度樱桃种子提取物的乙酸乙酯组分与提取物本身同样，明显具有抑制亚油酸氧化的效果，其强度比α-生育酚强。
实施例7将70g洗净的西印度樱桃种子破碎，加入4倍重量的、1，3-丁二醇含量为30％重量的1，3-丁二醇水溶液，在室温下搅拌过夜。将总量离心后，将上清液用0.22μm滤器过滤，得到124.12g西印度樱桃种子提取物的溶液。
通过以下的DPPH自由基清除方法测定所得西印度樱桃种子提取物的抗氧化活性。结果如表1所示。
在1600μl 250mM乙酸缓冲液(pH＝5.5)中混合1200μl乙醇、400μl受检样本(制备成任意的浓度)，在30℃预温育5分钟。在该液体中添加混合800μl 500μM DPPH/乙醇溶液，在30℃放置30分钟后测定517nm的吸光度。对α-生育酚也进行同样的操作，以此作为正对照。对照是使用其它溶剂代替试样溶液，进行同样的操作。通过下式，由所测定的吸光度计算自由基清除率。
清除率(％)＝(1-[试样的吸光度]/[对照的吸光度])×100分阶段变更试样溶液的试样浓度，进行上述清除率的测定，求出DPPH自由基的清除率为50％时试样溶液的浓度，以此作为DPPH自由基50％清除浓度。因此，该数值低，则意味着自由基清除能力高。
表1
表1表明实施例7的提取物具有与α-生育酚同等的自由基清除能力。
实施例8将1500g洗净的西印度樱桃种子破碎，加入2倍重量的、1，3-丁二醇含量为30％重量的1，3-丁二醇水溶液，在室温下搅拌过夜。将总量离心后，将上清液用0.22μm滤器过滤，得到2327g西印度樱桃种子提取物溶液。
用与实施例2同样的硫氰酸铁法测定所得西印度樱桃种子提取物的抗氧化活性。由于西印度樱桃种子提取物是溶液，因此要用水和乙醇将其稀释成所需浓度后再添加，西印度樱桃种子提取液的对照采用与添加的西印度樱桃种子提取液同样的溶剂组成，但不含西印度樱桃种子提取物的样品。试验期间为7天。
吸光度随时间的变化结果如图5所示，试验开始后第7天各试样溶液的氧化率如图6所示。图6中，(C-1)表示对照，(C-2)表示α-生育酚，(C-3)表示BHA，(E-8)表示实施例8中制备的西印度樱桃种子提取物。
图5和6表明西印度樱桃种子提取物明显具有抑制亚油酸氧化的效果，其强度与α-生育酚、BHA相比为同等或同等以上。
一直以来，已知维生素C具有抗氧化作用，因此测定了上述制备的西印度樱桃种子提取液中的维生素C的量，研究上述西印度樱桃种子提取液的抗氧化作用是否只来源于所含的维生素C。
首先测定100g上述制备的西印度樱桃种子提取液中含有的维生素C量，结果为57mg/100g(氧化型维生素C56mg/100g+还原型维生素C1mg/100g)。将100g上述制备的西印度樱桃种子提取液蒸发干燥固化，可得到975mg固体成分。接着，用与实施例2同样的硫氰酸铁法测定抗氧化活性。此时，由于本实施例的西印度樱桃种子提取物是溶液，因此与上述同样，要进行稀释，使反应液中含有的固体成分为0.4mg后再添加。对照也与上述同样，采用与添加的西印度樱桃种子提取液同样的溶剂组成，但不含西印度樱桃种子提取物的样品。测定进行7天。使用该0.4mg固体成分中含有的0.023mg维生素C(0.4mg×(57mg/975mg))同样地进行抗氧化活性测定，以此作为对照。
试验开始后第7天，西印度樱桃种子提取物的氧化率为1.9％，而单独的维生素C的氧化率为115.8％。
以上结果表明，西印度樱桃种子提取物中所含维生素C对该提取物的抗氧化作用几乎没有贡献。
本发明的西印度樱桃种子提取物中，对于在实施例1中确认的显示抗氧化作用的物质之一栎苷，与实施例1同样地测定上述制备的西印度樱桃种子提取物中是否含有该栎苷。结果表明含有栎苷。
以往，例如日本特开平7-300581号公报中提出了栎苷具有抗氧化作用。这里，通过以下的方法研究上述西印度樱桃种子提取液的抗氧化作用是否只源自所含的栎苷。
首先，栎苷是多酚的一种，因此通过Folin-Denis法测定上述制备的西印度樱桃种子提取液中的多酚量，结果100g提取液中固体成分为975mg，其中多酚所占的比例为25％。因此，上述制备的西印度樱桃种子提取液的固体成分中所含的栎苷量最大为25％。基于该结果，如上述维生素C的比较试验那样，用与实施例2同样的硫氰酸铁法测定抗氧化活性。此时测定进行7天。作为对照，使用假设0.4mg该固体成分中含有32％栎苷(最大量为25％，即为比该值高的量)时的0.128mg栎苷，同样地进行抗氧化活性测定。
结果，试验开始后第7天，西印度樱桃种子提取物的氧化率为1.9％，而单独的栎苷的氧化率为6.9％。
以上结果表明西印度樱桃种子提取物中含有的栎苷是该提取物的抗氧化作用的有效成分之一，但该提取物的抗氧化作用不只是栎苷的作用，并且西印度樱桃种子提取物比单独的栎苷的抗氧化作用更为优异。
参考例1通过以下的方法测定实施例2-5中制备的各西印度樱桃种子提取物的胶原酶活性抑制作用。
底物溶液将0.39mgPz-肽(BACHEM公司生产)溶解于1ml 0.1MTris盐酸缓冲液(pH 7.1、含20mM氯化钙)使用(相当于0.5mM)。
酶溶液将5mg胶原酶(IV型、SIGMA公司生产)溶解于1ml蒸馏水，分别取100μl，在-20℃下保管，使用时用蒸馏水稀释为50倍，用于反应。
分别用提取溶剂溶解提取物进行制备，使实施例2的提取物浓度为15mg/ml，使实施例3、4、5的提取物浓度为0.5mg/ml，以此作为试样溶液。将50μl这些试样溶液、50μl胶原酶溶液和400μl底物溶液混合，在37℃温育30分钟。接着，用1ml 25mM柠檬酸溶液使反应终止，用5ml乙酸乙酯提取。离心分离(3000rpm、10分钟)后，以乙酸乙酯作为对照，测定波长320nm下乙酸乙酯层的吸光度。使用各提取溶剂代替试样溶液，以此作为对照，另外分别加入蒸馏水代替酶溶液，以此作为空白试样，进行同样的操作。
通过下式，由这些值计算胶原酶活性抑制率。
抑制率(％)＝[1-(A-B)/(C-D)]×100A试样溶液在320nm的吸光度、B空白试样溶液在320nm的吸光度、C对照溶液在320nm的吸光度、D空白对照溶液在320nm的吸光度。
通过上述方法求出实施例2-5的提取物的胶原酶活性抑制率。结果如表2所示。
表2
参考例2按照与参考例1同样的方法，对实施例8中制备的西印度樱桃种子提取物进行胶原酶活性抑制作用的测定。实施例8的提取物是溶液，因此用作为提取溶剂的30％重量1，3-丁二醇水溶液稀释，使西印度樱桃种子提取物作为固态物质的浓度是0.5mg/ml，以此作为试样溶液。这样求得实施例8的提取物的胶原酶活性抑制率，结果为71.5％。
参考例3测定实施例8中制备的提取物的透明质酸酶活性抑制作用。透明质酸酶活性抑制的测定通过应用了Morgan-Elson法的前田有美惠等人的方法(食卫志、31卷、233-237、1990年)进行。
测定方法[试剂的制备]酶溶液将牛睾丸透明质酸酶(和光纯药工业(株)生产)溶解于0.1M乙酸缓冲液(pH＝4.0)，调节至最终酶活性为400单位/ml。
酶活化溶液将compound 48/80(SIGMA公司生产)溶解于0.1M乙酸缓冲液(pH＝4.0)，调节至最终浓度为0.1mg/ml。
底物溶液将透明质酸钾(和光纯药工业(株)生产)溶解于0.1M乙酸缓冲液(pH＝4.0)，调节至最终浓度为0.4mg/ml。
硼酸溶液在4.95g硼酸中加入50ml水，用1N氢氧化钠溶液调节至pH＝9.1，加入水，调节为100ml。
对二甲基氨基苯甲醛(p-DAB)试剂在12.5ml 10N盐酸和87.5ml乙酸的混合液中溶解10g p-DAB(和光纯药工业(株)生产)，冷藏保存。临使用前用乙酸稀释10倍使用。
实施例8的提取物是溶液，因此用作为提取溶剂的30％重量1，3-丁二醇水溶液稀释，使西印度樱桃种子提取物作为固态物质的浓度为1mg/ml，以此作为试样溶液。向0.2ml该试样溶液中加入0.1ml酶溶液，在37℃放置20分钟。接着加入0.2ml酶活化溶液，在37℃加热20分钟，再加入0.5ml底物溶液，在37℃反应40分钟，然后加入0.2ml 0.4N的氢氧化钠水溶液，同时冰冷却，使反应终止。加入0.2ml硼酸溶液，通过热浴(hot block bath)(TOYOSEISAKUSHO、型号TPB-32)在100-120℃加热5分钟，然后冰冷却，加入6ml p-DAB试剂，在37℃加热20分钟，使其显色，以蒸馏水作为对照，测定585nm下的吸光度。使用提取溶剂代替试样溶液，以此作为对照，另外分别加入0.1M乙酸缓冲液(pH＝4.0)代替酶溶液，以此作为空白试样，进行同样的操作。
通过下式，由这些值计算透明质酸酶活性抑制率。
抑制率(％)＝[1-(A-B)/(C-D)]×100A试样溶液在585nm的吸光度、B空白试样溶液在585nm的吸光度、C对照溶液在585nm的吸光度、D空白对照溶液在585nm的吸光度。
通过上述方法求出实施例8的提取物的透明质酸酶活性抑制率，结果为94.5％。
参考例4按照1997年3月26日发布的日本厚生省第21号令“关于药品安全性的非临床试验实施基准的省令(部颁标准)”，进行西印度樱桃种子提取物的安全性试验。西印度樱桃种子提取物采用实施例8中制备的西印度樱桃种子提取物。结果如表3所示。
使用大鼠进行的单次经口给予毒性试验2组大鼠(对照组、给予组)，雌雄各5只/组，进行试验，给予组按照2g/kg体重给予。
使用豚鼠进行的皮肤单次刺激性试验在3只豚鼠的健康皮肤上进行24小时密封贴用，在给予后24小时、48小时和72小时，分别观察皮肤的状态进行判定。
使用豚鼠进行的14天皮肤累积刺激性试验在3只豚鼠的健康皮肤上，在开放体系下，每天涂布一次，连续14天，在试验期间，每天在涂布前和涂布后24小时分别观察皮肤的状态进行判定。
使用豚鼠进行的皮肤致敏性试验3组豚鼠(对照组、涂布组、DNCB组)，5只/组，按照佐剂和肤斑试验法(Adjuvant and Patch Test)进行试验，涂布后24小时和48小时，分别观察皮肤的状态进行判定。
使用豚鼠进行的皮肤光毒性试验按照森川藤凰等人的方法，在10只豚鼠的背部皮肤上进行试验，紫外线照射后24小时、48小时和72小时，分别观察皮肤的状态进行判定。
使用豚鼠进行的皮肤光致敏性试验3组豚鼠(对照组、给予组、TCSA组)，5只/组，按照Ajuvant andStrip法进行试验，紫外线照射后24小时和48小时，分别观察皮肤的状态进行判定。
使用兔进行的眼粘膜刺激性试验以2组兔(非洗眼组、洗眼组)，3只/组进行试验。滴眼后，不对非洗眼组进行处理，用微温的生理盐水对洗眼组清洗约1分钟，然后在1小时、24小时、48小时和72小时后观察角膜、虹膜和结膜的状态，由AFNOR区分进行判定。
使用细菌进行的回复突变试验按照预温育法，对未添加S9mix和添加S9mix的情况进行测定。
·使用菌株鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)TA100、TA98、TA1535、TA1537·使用菌株大肠杆菌(Escherichia coli)WP2uvrA使用哺乳类的培养细胞进行的染色体异常试验使用哺乳类的培养细胞(CHL/IU细胞)，采取短时间处理法(6小时处理未添加S9mix和添加S9mix)和连续处理组(处理24小时和48小时)对3组(阴性对照组、受检物质组、阳性对照组)进行研究。
表3
配方例1将0.20重量份甘草酸二钾、0.10重量份柠檬酸、0.30重量份柠檬酸钠、5.00重量份实施例7中制备的西印度樱桃种子提取物和5.00重量份1，3-丁二醇混合，加入纯净水，使总量为80.0重量份，在50℃下一边搅拌一边溶解，制成含有提取物的水溶液。
接着，将0.90重量份POE(60)山梨醇四油酸酯、0.10重量份失水山梨醇一油酸酯、适量的防腐剂和10.00重量份乙醇混合，在50℃下一边搅拌一边溶解。接着，将所得溶液一点点加入到最初制备的含提取物的水溶液中，在50℃混合搅拌。均匀混合后进一步搅拌，同时将液温由50℃下降到30℃，在到达30℃时停止搅拌，加入适量的香料和纯净水，使总量为100.00重量份。再次混合搅拌，均匀混合，制成化妆水。
配方例2将10.00重量份角鲨烯和适量的防腐剂混合，加入纯净水，调节至总量为70.00重量份，加热至80℃，制成溶液(1)。另外，将0.10重量份羧基乙烯基聚合物和0.20重量份黄原酸胶加入到适量的纯净水中，在常温下搅拌溶解，制成溶液(2)。再将0.10重量份三乙醇胺和5.00重量份1，3-丁二醇加入到适量的纯净水中，在常温下搅拌溶解，制成溶液(3)。又将2.00重量份透明质酸钠和5.00重量份实施例8中制备的西印度樱桃种子提取物加入到适量的纯净水中，在常温下搅拌溶解，制成溶液(4)。
接着，向适量的纯净水中一点点加入溶液(1)，在80℃混合搅拌，并一边搅拌一边加入溶液(2)，接着加入溶液(3)。均匀混合后，一边搅拌一边将溶液降温至50℃，在到达50℃时加入溶液(4)，再加入纯净水，将总量调节至100重量份。再次搅拌，直至溶液为30℃，在到达30℃时停止搅拌，制成均匀混合的乳液。
配方例3将2.00重量份POE(20)失水山梨醇一硬脂酸酯、0.50重量份POE失水山梨醇四油酸酯、0.50重量份一硬脂酸甘油酯、7.00重量份硬脂酸、3.00重量份鲸蜡醇、3.00重量份棕榈酸鲸蜡醇酯、7.00重量份霍霍巴油、3.00重量份石蜡和适量的防腐剂混合，在80℃边搅拌边溶解，制成溶液(1)。另一方面，将5.00重量份实施例8中制备的西印度樱桃种子提取物、7.00重量份1，3-丁二醇和62重量份纯净水混合，在80℃边搅拌边溶解，制成溶液(2)。
接着，向溶液(2)中一点点加入溶液(1)，乳化，边搅拌边冷却，降温至40℃时停止搅拌，制成均匀混合的霜膏。
配方例4向100g浓缩葡萄果汁、150g糖类、15g蜂蜜、1.5g在与实施例2同样的条件下制备的西印度樱桃种子提取物(A)以及适量的香料中混合纯净水，使总量为1000g。接着在95℃灭菌20分钟，在无菌状态下分别向瓶中装入100ml，制成葡萄果汁。
配方例5将0.6重量份POE(30)POP(6)癸基十四烷基醚、10.0重量份乙醇和0.1重量份羟苯甲酸甲酯在50℃混合搅拌，向该溶液中加入另行如下制备的溶液将0.1重量份柠檬酸钠、1.0重量份吡咯烷酮羧酸钠、4.4重量份1，3-丁二醇和适量纯净水在50℃混合搅拌而成。一边搅拌一边冷却至30℃。再添加2.0重量份实施例8中制备的西印度樱桃种子提取物，混合搅拌，最后加入适量的纯净水，将总量调节至100重量份，再次搅拌，均匀混合，制成化妆水。
配方例6将1，3-丁二醇的混合量变更为3.5重量份，将实施例8中制备的西印度樱桃种子提取物的混合量变更为5.0重量份，除此之外与配方例5同样地制备化妆水。
比较配方例1将1，3-丁二醇的混合量变更为5.0重量份，不混合实施例8中制备的西印度樱桃种子提取物，除此之外与配方例5同样地制备化妆水。
实施例9用与实施例2同样的硫氰酸铁法测定配方例5中制备的化妆水的亚油酸氧化抑制作用。作为比较，对不含西印度樱桃种子提取物的比较配方例1中制备的化妆水也同样进行氧化抑制作用的测定。
本实施例中，向实施例2的反应液中加入2ml配方例5或比较配方例1中制备的各化妆水、1.8ml 99.5％乙醇和0.2ml蒸馏水，用以代替实施例2中所加的0.4mg西印度樱桃种子提取物、2ml 99.5％乙醇和2ml蒸馏水，进行试验。
吸光度随时间变化的结果如图7所示。另外，以第21天时比较配方例1中制备的化妆水试样的氧化率(Δ吸光度)为100％，与实施例2同样地求出试验开始后第28天时配方例5中制备的化妆水试样的氧化率，结果为7.2％。
由图7和上述氧化率试验结果可知混合西印度樱桃种子提取物而制备的配方例5的化妆水与比较配方例1的化妆水相比，显示出优异的亚油酸氧化抑制作用，另外，经过28天后其作用仍然持续。
由此可确认混合有西印度樱桃种子提取物的化妆水具有稳定性优异的抗氧化作用。
实施例10为了验证在化妆水制备后经过1个月以上，混合有西印度樱桃种子提取物的化妆水的抗氧化作用仍持续有效，将配方例5、配方例6和比较配方例1中制备的化妆水在下述条件下保存6个月，进行与实施例7同样的抗氧化试验，评价保存后对DPPH自由基清除作用的变化。
保存方法制备配方例5和配方例6的化妆水后，在避光条件下、分别在4℃、25℃、40℃下保存6个月，刚制备、制备后2周以及制备后1、2、3、4、6个月后，实施DPPH自由基清除试验。作为比较，对于比较配方例1的化妆水也同样保存和进行试验。
本实施例中，向实施例7的反应液中加入400μl`配方例5或配方例6中制备的化妆水，用以代替实施例7中所添加的400μl西印度樱桃种子提取物，进行试验。另外，代替配方例5和配方例6中制备的化妆水，使用添加了在相同条件下保存的比较配方例1中制备的化妆水的试样，以其吸光度作为对照，与实施例7同样地求出DPPH自由基清除率(％)。
对配方例5和配方例6中制备的化妆水进行了6个月的DPPH自由基清除试验，结果分别表示在图8和图9中。
由图8和图9可知混合有西印度樱桃种子提取物的配方例5和配方例6的化妆水显示优异的DPPH自由基清除作用，即使在40℃这样严酷的条件下保存6个月，其作用也不会消失。另外，其中西印度樱桃种子提取物的混合量多的配方例6的化妆水显示高的抗氧化作用，持久性也优异。
以上表明混合有西印度樱桃种子提取物的化妆水即使长时间、特别是在高温下长期保存，也具有强的、优异的抗氧化作用，并且西印度樱桃种子提取物的混合量越高，其作用越值得期待。
权利要求
1.抗氧化剂，该抗氧化剂含有西印度樱桃种子提取物作为有效成分。
2.权利要求1的抗氧化剂，其中西印度樱桃种子提取物含有栎苷。
3.含有权利要求1的抗氧化剂的皮肤外用剂。
4.含有权利要求1的抗氧化剂的化妆品。
5.含有权利要求1的抗氧化剂的食品。
全文摘要
本发明涉及可以有效利用作为废弃物处理的西印度樱桃种子、安全性优异的用于皮肤外用剂、化妆品或食品等中显示优异的抗氧化作用的抗氧化剂，以及含有该抗氧化剂的皮肤外用剂、化妆品或食品，其中含有西印度樱桃种子作为有效成分。
文档编号A61K8/97GK1738888SQ20038010900
公开日2006年2月22日 申请日期2003年11月21日 优先权日2002年11月25日
发明者永峰贤一, 林美希, K·山崎 申请人:株式会社日冷生物科学