专利名称：治疗非缺血性心力衰竭的药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及治疗非缺血性心力衰竭的药物组合物，其包含作为活性成分的集落刺激因子。本发明也涉及治疗非缺血性心力衰竭的方法，其包含施用集落刺激因子。
背景领域心力衰竭是这样的状态，即减弱的心脏功能使其无法保证全身组织代谢所需的射血，或者此射血只在心室填充压力升高时完成[ShinRinsho Naikagaku(New Clinical Internal Medicine)，IgakuShoinLtd.，Japan]。缺血性心力衰竭是无法接收到代谢所需的血量而引起的诱导缺痒的心力衰竭，而非缺血性心力衰竭指缺血性心力衰竭之外的心力衰竭。非缺血性心力衰竭包括由心肌病如特发的、继发的或其它形式心肌病的恶化所导致的类型。
人粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)是被发现作为粒细胞谱系造血祖细胞的分化和增殖因子的造血因子，因为其促进体内中性粒细胞的造血，临床上用作治疗伴随骨髓移植或癌症化疗的中性粒细胞减少的药剂。除上述效应之外，人G-CSF作用于造血干细胞以刺激它们的分化和增殖。此外，本发明的发明人近来报道了G-CSF诱导造血干细胞从骨髓补充到外周血液中，促进它们移动到心肌梗死损伤和分化成心肌细胞，以此减缓心肌梗死后的左心室重建和心力衰竭(Minatoguchi，S.等Circulation，2004(in press))。
然而，不清楚G-CSF是否也对心肌病如扩张性心肌病导致的非缺血性心力衰竭有效。
发明内容
本发明的目标是提供治疗由心肌病恶化引起的非缺血性心力衰竭的药物组合物。
本发明的发明人发现在心肌病动物模型中，长时间的施用G-CSF，改善了进行性心肌纤维化、左心室重建(remodeling)和心力衰竭。此发现导致了本发明的完成。
即，本发明提供治疗非缺血性心力衰竭的药物组合物，其包含作为活性成分的集落刺激因子。
本发明也提供治疗非缺血性心力衰竭的方法，其包含对有此需要的患者以治疗非缺血性心力衰竭的有效量施用作为活性成分的集落刺激因子。
本发明进一步涉及集落刺激因子在用于治疗非缺血性心力衰竭的药物组合物的制备中的应用。
本发明进一步提供治疗非缺血性心力衰竭的试剂盒(kit)，其包含了治疗非缺血性心力衰竭所需的有效剂量的集落刺激因子和使用指南。
附图简述
图1显示被Masson’s三色染剂染色的心室横切标本的显微照片。(A)对照组，(B)G-CSF组。染成蓝色的区域是纤维化的区域(用箭头指出)。
图2显示骨髓细胞来源的心肌细胞在聚焦激光扫描显微镜下观察的显微照片。(A)DiI标记的骨髓细胞(红色，细箭头)，(B)核的染色(蓝色，粗箭头)，(C)被α-肌节肌动蛋白染色的心肌细胞(绿色)，(D)(A)到(C)的合并图。标尺是20μm。
实行本发明的最佳方式本发明涉及治疗非缺血性心力衰竭的药物组合物，其包含作为活性成分的集落刺激因子。非缺血性心力衰竭包含，例如，由心肌病恶化引起的类型。心肌病的例子包括特发性心肌病如扩张性、肥大的和限制性形式的心肌病，也包括继发心肌病如心肌炎和结节病。本发明可用于，例如，扩张性心肌病。
集落刺激因子的例子包括粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-单核细胞-集落刺激因子(GM-CSF)和单核细胞-集落刺激因子(M-CSF)。例如，G-CSF可在本发明中应用。
在G-CSF以本发明药物组合物中的活性成分应用的病例中，任何G-CSF都能应用，但优选高度纯化的产品。具体例子包括哺乳动物G-CSF，尤其人G-CSF或基本具有相同生物活性的其等价物。其中应用的G-CSF可以是任何来源的，包括那些自然产生或那些重组产生的。此重组产生的G-CSF可以具有与自然产生的G-CSF相同的氨基酸序列(例如，JP 2-5395B，JP 62-236488A)，或在氨基酸序列中含有一个或多个氨基酸残基的删除、替换和/或添加，而只要它保持了与天然产生的G-CSF相同的生物活性。例如，定点突变(Gotoh，T.等(1995)Gene 152，271-275；Zoller，M.J.和Smith，M.(1983)MethodsEnzymol.100，468-500；Kramer，W.等(1984)Nucleic Acids Res.12，9441-9456；Kramer，W.和Fritz H.J.(1987)MethodsEnzymol.154，350-367；Kunkel，T.A.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，488-492；Kunkel(1988)Methods Enzymol.85，2763-2766)或其它技术能被用于在G-CSF的氨基酸序列中引入合适的突变，以此制备在功能上与G-CSF等同的多肽。同样地，氨基酸突变也会在自然界中发生。已经众所周知，通过一个或多个氨基酸残基的删除和/或添加，和/或其它氨基酸对它们的置换，由一种氨基酸序列修饰得到的另一种氨基酸序列的多肽，保持了与原始多肽相同的生物活性(Mark，D.F.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)81，5662-5666；Zoller，M.L.和Smith，M.Nucleic Acids Research(1982)10，6487-6500；Wang，A.等，Science(1984)224，1431-1433；Dalbadie-McFarland，G.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1982)79，6409-6413)。
因此，其氨基酸序列包含了G-CSF氨基酸序列一个或多个氨基酸突变而功能上与G-CSF等同的多肽也能在本发明的药物组合物中应用。在这样的多肽中的突变氨基酸数目通常高达30个氨基酸，优选高达15个氨基酸，更优选高达5个氨基酸(例如，多达3个氨基酸)。
在替换突变体中，氨基酸替换最好以保持氨基酸侧链的特性方式产生。这种氨基酸替换可利用的氨基酸实例包括疏水性氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)，亲水性氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)，具有脂肪族侧链的氨基酸(G、A、V、L、I、P)，具有含羟基侧链的氨基酸(S、T、Y)，具有含硫侧链的氨基酸(C、M)，具有含羧酸或氨基侧链的氨基酸(D、N、E、Q)，具有含碱侧链的氨基酸(R、K、H)，和具有芳香族侧链的氨基酸(H、F、Y、W)(括号中的大写字母指单字母符号中的对应氨基酸)。
含有在G-CSF氨基酸序列中数个氨基酸残基的添加的多肽包括了含有G-CSF的融合多肽。融合多肽是G-CSF和其它多肽间的融合产物，而这些多肽也能在本发明中应用。为制备融合多肽，例如，可将编码G-CSF的DNA和编码不同多肽的DNA在阅读框中连接在一起，引入合适的表达载体，然后在合适的宿主中表达。其他与G-CSF融合的多肽没有限制，而无论如何只要得到的融合多肽保持与G-CSF一样的生物活性。
已有许多关于G-CSF氨基酸序列中带有突变的G-CSF衍生物的报道，而应用这些已知的G-CSF衍生物也有可能(例如，USP 5,581,476，USP 5,214,132，USP 5,362,853，USP 4,904,584)。
此外，应用化学性修饰的G-CSF也有可能。化学性修饰的G-CSF实例包括那些对糖链结构性改变，添加和/或删除而修饰的类型，也包括那些和化合物如聚乙二醇结合的类型(例如，USP 5,824,778，USP5,824,784，WO 96/11953，WO 95/21629，WO 94/20069，USP 5,218,092，JP 4-164098A)。
本发明所用的G-CSF可通过任何方式制备，例如通过培养人肿瘤细胞系或通过在大肠杆菌细胞、酵母细胞、例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、C127细胞、COS细胞、骨髓瘤细胞或BHK细胞的哺乳动物细胞或昆虫细胞中基因工程化的生产而制备。如此制备的G-CSF在使用前以多种方式被抽提、分离和纯化(例如JP 1-44200B，JP 2-5395B，JP 62-129298A，JP 62-132899A，JP 62-236488A，JP 64-85098A)。
如果需要，根据施用模式和剂量形式，治疗非缺血性心力衰竭的本发明药物组合物可适当地补充加入下列试剂悬浮剂、增溶剂、稳定剂、等渗剂、防腐剂、抗吸附剂、表面活性剂、稀释剂、赋形剂、pH调节物、光滑剂、缓冲剂、含硫的还原剂、抗氧化剂等。
悬浮剂实例包括甲基纤维素、Polysorbate 80、羟乙基纤维素、阿拉伯胶、粉末化的黄芪胶、羧甲基纤维素钠和聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯。
增溶剂实例包括聚氧乙烯氢化蓖麻油、Polysorbate 80、烟酰胺、聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯、Magrogol和蓖麻油脂肪酸乙酯。
稳定剂实例包括Dextran 40、甲基纤维素、明胶、亚硫酸纳和焦亚硫酸纳(sodium metasulfide)。
等渗剂实例包括D-甘露糖醇和山梨醇。
防腐剂实例包括对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、山梨酸、苯酚、甲酚和氯甲酚。
抗吸附剂实例包括人血清白蛋白、卵磷脂、葡聚糖、环氧乙烷环氧丙烷共聚物、羟丙基纤维素、甲基纤维素、聚氧乙烯氢化蓖麻油和聚乙二醇。
含硫的还原剂实例包括那些具有巯基基团的化合物如N-乙酰半胱氨酸、N-乙酰同型半胱氨酸、硫辛酸、硫二甘醇、硫代乙醇胺、硫甘油、硫山梨醇、巯基乙酸和它的盐、硫代硫酸钠、谷胱甘肽和C1-C7的硫链烷酸。
抗氧化剂实例包括异抗坏血酸、二丁基羟基甲苯、丁基羟基苯甲醚、α-维生素E、维生素E乙酸酯、L-抗坏血酸和它的盐、L-棕榈酸抗坏血酸酯、L-硬脂酸抗坏血酸酯、亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、焙酸三戊酯和焙酸丙酯，也包括螯合剂如乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)、焦磷酸钠和偏磷酸纳。
此外，本发明的药物组合物可包括其他普遍使用的成分，例如无机盐如氯化钠、氯化钾、氯化钙、磷酸钠、磷酸钾和碳酸氢钠，也例如有机盐如柠檬酸钠、柠檬酸钾和醋酸钠。
治疗非缺血性心力衰竭的本发明药物组合物能以注射(例如皮下、皮内、肌肉内、静脉内或腹膜内注射)的剂型，适于经皮、经粘膜或经鼻施用的任何剂型，或适于口服施用的任何剂型(例如片剂、胶囊、颗粒、溶液、悬浮液)而施予，但不限于这些形式。
在本发明的药物组合物中，施用的剂量和频率能被本领域的技术人员通过考虑将要治疗的疾病患者的症状而合理确定。G-CSF的单一剂量通常是每个成人0.1到100μg/kg，优选每个成人1到10μg/kg，通常每周以每日一次到三次施用一到七天，但不限于此。
包含作为活性成分的集落刺激因子的治疗非缺血性心力衰竭的本发明药物组合物，对非缺血性心力衰竭的治疗和/或防止有效。
本发明的试剂盒(kit)包含集落刺激因子，一种或多种药学上可接受的适当的载体等(如果需要)，也包含使用指南。
本发明现在将在下列的实施例中进一步阐述，其意图不在于限制本发明的范围。
实施例心肌病的动物模型被用于检查G-CSF的施用是否会防止心肌病诱导的心力衰竭的发展。
(1)实验程序心力衰竭的动物模型UM-X7.1心肌病仓鼠缺乏δ-sarcoglycan基因(Sakamoto A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1997，9413873-13878)，在出生后四周龄时开始失去心肌细胞(Jasmin G.等，Muscle Nerve 1982，520-25)。随后，该动物经历伴随心肌细胞丢失的的多重损伤的进行性形成，并发展为明显的纤维化，这导致心脏扩大和/或心力不足，最后引起心力衰竭的死亡。在自然过程中，30周龄的存活率是大约50％。
G-CSF施用的程序实验1对16只雄性UM-X7.1心肌病仓鼠(出生后15周龄)根据施用时间表进行处理，在时间表中，以10μg/kg/天连续5天皮下注射G-CSF，然后停药2天。该处理一直持续15周，直到30周龄时为止。作为对照组，相同年龄的15只雄性UM-X7.1仓鼠也以同样方式皮下注射蒸馏水。在30周龄时，比较两个组的存活率，和进行血液动力学、组织学、生物化学评估。
实验2根据上述施用时间表施用G-CSF或蒸馏水2周后(每组中n＝6)，对动物进行Evans蓝染液的腹膜内注射，以检查此染液到心肌细胞的吸收。
实验3进一步完成随后的实验以检测骨髓细胞补充到心肌和它们分化成心肌细胞现象的存在或缺乏。骨髓细胞从每一雄性UM-X7.1仓鼠(出生后15周龄)的股骨中收集，用DiI染料标记，然后再植入动物的髓腔中。根据上面的施药时间表施用G-CSF或蒸馏水(每组中n＝6)之后，来自每一动物的心肌两周后进行组织学检测。
血液动力学评估采用超声诊断设备SSD-2000(Aloka)通过超声心动描记术完成此评估。
组织学评估在实验1中，10％福尔马林固定和石蜡包埋的心室横切片(4μm)用Masson’s三色染剂染色以鉴别心肌纤维化的区域，随后用图像分析仪Luzex-F(NIRECO)进行定量分析。每一心脏的又一部分也被进行电镜固定和在电镜下观察。
实验2和3中的心脏被制备成冰冻样本。
生物化学评估明胶酶谱法被用于检测基质金属蛋白酶(MMP)在心肌组织中的活性。
激光聚焦扫描显微镜从得到DiI标记骨髓细胞再植的动物制得的心肌冰冻切片(6μm)被用α-肌节肌动蛋白免疫荧光染色，然后在激光聚焦扫描显微镜(Zweiss)下观察。
免疫组织化学心肌组织的石蜡切片(4μm)以抗δ-sarcoglycan的抗体用ABC试剂盒(Vector Laboratories)免疫染色。
统计学分析数字性数据以均值±标准差形式表示。用Student’s T-检验进行两组的比较，而用Kaplan-Meier方法进行存活率的比较。P＜0.05被认为是统计学上显著。
(2)结果存活率30周龄的存活率在G-CSF组中是100％，在对照组中是53％，说明G-CSF的施用对存活率提供显著的改善(p＜0.0001)。
血液动力学和左心室重建超声心动描记评估证明，因为G-CSF组的左心室射血部分(EF)和左心室的部分缩减(fraction shortening，％FS)都有显著改善，G-CSF组表现出改善的左心室收缩功能。此外，评估也证明，因为G-CSF组显示出左心室舒张末期直径(LVEDD)和左心室收缩末期直径(LVESD)相对于对照组都有显著减少(表1)，所以在G-CSF组中防止了左心室的重建。
当解剖尸体测量器官重量时，虽然两组间的体重没有差异，G-CSF组中的心脏重量/体重和肺重量/体重的比率明显小于对照组(表1)。
表1 血液动力学和左心室重建的参数比较
左心室纤维化相对于对照组(20.2±6.5％)，G-CSF组中的左心室纤维化区域的百分比显著降低(8.6±4.0％)(p＜0.0001)(图1)。
明胶酶谱法证明相对于对照组(数据未显示)，G-CSF组显示出心肌组织中MMP-2和MMP-9活性的增加。
心肌细胞的超微形态学对照组中30周大的仓鼠被发现在其心脏中存在大量含有退化线粒体和显现出自体吞噬性退化的心肌细胞，而此 在G-CSF组中的频率减小。
心肌细胞的细胞膜渗透性(脆弱性)在实验2中，对照组被发现存在 Evans蓝染料的心肌细胞，即，其细胞膜渗透性增加(0.75±0. )，而G-CSF组中的此类细胞频率减小(0.071±0.004％)。
骨髓细胞向心肌细胞的分化当在激光聚焦扫描显微镜下观察时，DiI-阳性和α-肌节肌动蛋白阳性细胞，即，骨髓细胞来源的心肌细胞在G-CSF组的心肌组织中被发现(图2)。
δ-sarcoglycan两组中任一组都未观察到δ-sarcoglycan在心肌组织中的表达(数据未显示)。
(3)讨论如上述所证明的，G-CSF的长期施用改善了心肌病动物模型中的进行性心肌纤维化，左心室重建和心力衰竭。G-CSF这种效用的机理可由至少以下4种可能来解释1)骨髓细胞补充到心肌组织和分化成心肌细胞所引起的心肌再生效应；2)对心肌细胞丢失的抑制效应；3)对心肌纤维化的抑制效应；和4)抗细胞因子效应1)当在激光聚焦扫描显微镜下观察时，骨髓细胞来源的DiI染料标记和α-肌节肌动蛋白阳性细胞(即心肌细胞)在G-CSF组的心肌组织中被发现的事实支持了通过G-CSF的心肌再生的可能性。
2)超微形态学观察和Evans蓝染支持了G-CSF对心肌细胞的抗自体吞噬性退化/死亡效应的可能性。对心肌细胞丢失的抑制效应(即对心肌细胞的保护效应)可由以下事实所充分推断，即伴随心肌细胞丢失的损伤在G-CSF组中较小，正如左心室纤维化区域的百分比降低所指明的一样。
3)根据图1，G-CSF的抗纤维化效应明显。正如G-CSF组心肌中MMP活性增加所指明的，存在另外的可能性即G-CSF也通过增加MMP活性而促进了胶原纤维的降解，因此产生抗纤维化的效应。
4)已知心力衰竭导致血液中细胞因子水平的提高，包括肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白介素6(IL-6)。总之，TNF-α显示出对心脏功能具有抑制效应(Meldrum DR.，Am.J.Physiol.1998，274R577-R595)。因此估计G-CSF将抑制这些细胞因子，由此而改善心脏功能。
这说明G-CSF对人扩张性心肌病有效。
产业适用性集落刺激因子的长期施用使针对由心肌病恶化引起的非缺血性心力衰竭的治疗成为可能。
权利要求
1.治疗非缺血性心力衰竭的药物组合物，其包含作为活性成分的集落刺激因子。
2.根据权利要求1的药物组合物，其中非缺血性心力衰竭由心肌病恶化引起。
3.根据权利要求2的药物组合物，其中心肌病是特发性心肌病。
4.根据权利要求3的药物组合物，其中特发性心肌病是扩张性心肌病。
5.根据权利要求1到4中的任一项的药物组合物，其中集落刺激因子是粒细胞集落刺激因子。
6.治疗非缺血性心力衰竭的方法，其包含对有此需要的患者以治疗非缺血性心力衰竭的有效量施用作为活性成分的集落刺激因子。
7.集落刺激因子在用于治疗非缺血性心力衰竭的药物组合物的制备中的应用。
8.治疗非缺血性心力衰竭的试剂盒，其包含了治疗非缺血性心力衰竭所需的有效剂量的集落刺激因子和使用指南。
全文摘要
本发明的目标是提供治疗由心肌症恶化引起的非缺血性心力衰竭的药物组合物。集落刺激因子的长期施用改善进行性心肌纤维化，左心室重塑和心力衰竭。
文档编号A61P9/00GK1738638SQ200380108979
公开日2006年2月22日 申请日期2003年12月11日 优先权日2002年12月13日
发明者藤原久义, 竹村元三 申请人:藤原久义