专利名称：：中成药、保健品和食品中掺杂化学降糖成分的筛查方法
技术领域：
：本发明涉及利用化学指示剂对非生物材料的检测，尤其涉及中成药、保健品和食品中掺杂化学降糖成分的筛查方法。
背景技术：
：治疗糖尿病的化学药物大致可以分为五大类，即磺酰脲类药物、双胍类药物、a-糖苷酶抑制剂、遂唑烷二酮类药物和非磺酰脲类的胰岛素促进分泌剂。前述五类药物中，磺脲类药物和双胍类药物因其价格低廉、疗效显著而在临床上广泛使用，其中，磺脲类药物是通过刺激受损胰岛细胞正常分泌胰岛素来降低血糖浓度的，该类药物水溶性较好，典型的代表有格列苯脲、格列吡。秦、格列齐特和格列*酮；双胍类药物是通过促进周围组织对葡萄糖的摄取和利用来降低血糖浓度的，该类药物水溶性较差，典型的代表为盐酸二甲双胍和盐酸苯乙双胍。但是，这些化学药物达到一定量后显示出来的毒副作用就非常明显，如过量的盐酸苯乙双胍会对人体造成严重的乳酸性酸中毒，过量的格列苯脲可造成低血糖症以及肾上腺皮质功能减退、致畸等一系列严重不良反应。一些不法厂家为了增强降糖效果，将其掺入其生产的降糖中药和保健品中，患者在不知情的情况下大量服用，其后果是极其严重的。纯中药降糖制剂具有毒副作用小、效果显著等特点，近年来受到大多糖尿病的患者的认可。但是，有很多所谓的降糖"中药"中非法掺杂了过量的西药，如盐酸二曱双胍、格列苯脲、盐酸苯乙双胍、格列吡嗪等价格低廉的化学降糖成分，患者长期服用易延误病情，甚至让病情恶化，自假糖脂宁胶嚢事件以来，引起了社会各界的高度关注。2006年，夏铮铮等人在《中药保健品中非法掺入格列本的检测》中首先提出了采用薄层色镨法、高效液相色谱法对荞芪胶嚢的提取物进行分离分析，建立了格列苯脲的定性和定量方法。同年，李冰等人又在《山东大学学报》中报道了利用高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法对盐酸二甲双胍、盐酸苯乙双胍、格列齐特和格列苯脲进行定性和定量，并指出糖乐舒胶囊中含有过量的上述化学降糖成分。2007年，张妤琳等人利用上述的检测方法对市面常见的9种中药降糖药物进行了检测，并将检测结果在《药学与临床研究》中进行了报道，结果发现，高达三分之一的中药降糖药物不符合标准。2008年以后，关于这方面的研究和报道越来越多，但主要集中在利用高端分析仪器进行的检测方法。高效液相色谱、薄层色语法以及液相色谱-质谱联等方法虽然可以将中药中的化学降糖成分进行精确的定性和定量，但是一次设计只能对一种或一类极性相同结构相近的物质进行分析。当一批待检药物所含化学降糖成分的极性相反、结构有很大的差异时，如磺酰脲类药物和双胍类药物同时存在，就要经过多次试验，对其中所含化学降糖成分进行分析、归类，再设计相应的检验方法，其检测周期长、过程繁瑣。可见，上述色谱分析法显然不适合现场批量筛查。此外，色谱检测分析仪器价格昂贵、体积较大，检测分析成本较高，要求操作人员具有较高的专业技术水平，基层药监人员难以掌握其操作，不适合用于大批量药物的筛查。公知的Frohde反应(钼酸铵-浓硫酸)是吗啡生物碱的特征反应，该反应的时间短、灵敏度高、对很多生物碱都能起到指示作用，但是，若将其用于中药的检测中则存在下述技术问题化学降糖成分具有生物碱的结构，而Frohde反应中所用的试剂为98%的浓辟^酸-1°/的钼酸铵(《中草药成分化学》，1980年，人民卫生出版社)，该试剂可与多种生物石威发生化学反应，且反应的时间短、灵敏度高(0.05pg),无论药物中生物碱含量的多少均呈现很深的颜色，因此单从显色反应的结果来看，就无法区分药物中所含化学降糖成分是药物中既有的活性成分，还是人为过量掺杂。
发明内容鉴于现有技术存在上述不足，本发明所要解决的技术问题在于提供一种中成药、保健品和食品中掺杂化学降糖成分的快速筛查方法。本发明所要解决的技术问题还在于提供实现上述筛查方法的专用试剂盒。本发明解决上述问题的技术方案如下所述中成药、保健品和食品中掺杂化学降糖成分的筛查方法，该筛查方法由以下步骤组成(1)将钼酸铵溶解配制成质量浓度为10-15%的水溶液，备用；(2)将样品破碎，加入相当于样品质量3倍的体积浓度为90-96°/。的乙醇溶液，振荡溶解，静置，过滤，保留滤液；(3)取lml步骤(2)所得的滤液，依次緩慢加入lml体积浓度为45-55%的石克酸溶液和lml步骤(l)所得的溶液，摇匀，3分钟后，观察颜色变化，若溶液由浅黄绿色或浅棕色变为墨绿色或紫蓝色则表明样品中掺入了化学降糖成分，反之，表明样品中没有掺入化学降糖成分；其中，所述的化学降糖成分为格列苯脲、格列吡。秦、格列齐特、盐酸吡格列酮、盐酸二曱双胍、格列喹酮、盐酸苯乙双胍或瑞格列奈。一种中成药、保健品和食品中掺杂化学降糖成分的筛查方法中专用的试剂盒，该试剂盒包括试剂部分，所述试剂部分由以下试剂組成试剂A:体积浓度为90-96°/。的乙醇溶液；试剂B:体积浓度为45-55%的硫酸溶液；试剂C:钼酸铵。'本发明所述试剂盒还包括至少一个滤头、至少一支试管和至少一支带刻度的注射器。本发明所述的试剂盒，其中，所述的试剂A优选体积浓度为95y。的乙醇溶液；所述的试剂B优选体积浓度为50%的硫酸溶液。本发明所述试剂盒具有体积小、携带方便等特点，适合基层药监人员的现场4企测。公知的Frohde反应中所用的试剂为1%钼酸铵和98%浓硫酸溶液，其中，98%的浓疏酸能与碳水化合物发生碳化反应，产生乌黑浑浊的背景颜色，而1°/。的钼酸铵对所检测的生物碱显示出的颜色容易被背景颜色覆盖，难于分辨。本发明对Frohde反应改迸，将Frohde反应中所用的硫酸的浓度降低至45-55%的体积浓度，既满足了显色反应的要求，又不会在反应过程中产生很深的背景颜色而影响检验人员对结果的判断；此外，浓度相对较低的硫酸的反应活性明显降低，使反应所需生物碱的含量明显提高，有效避免了待检样品中既有微量化学降糖成分的干扰；同时，本发明将Frohde反应中所用的钼酸铵水溶液由1°/。提高到10-15%质量浓度，大大增加了浓^5克酸-钼酸铵反应后的显色深度，进一步增大了浓硫酸-钼酸铵反应的颜色与背景颜色的色差，有效提高了判断结果的准确性。与高效液相色谱、薄层色语法、液相色谱-质谱联用等化学降糖成分的检测方法相比，本发明具有以下优点1.检测时间短，单次检测样品多。高效液相色谦、薄层色谱法、液相色谱-质谱联用对化学降糖成分的检测一次只能对一种或一类化学成分进行定性和定量，尽管检测一个样品只需若干分钟，但仪器预热和样品准备要花费半天以上的时间；而本发明的筛查方法可同时对格列苯脲、格列吡嗪、格列齐特、盐酸吡格列酮、盐酸二曱双胍、格列喹酮、盐酸苯乙双胍和瑞格列奈8种化学降糖成分进行筛查，大约5分钟就可以完成一个样品的检测，也不需要花费时间准备试剂。2.操作简单。高效液相色语、薄层色谱法、液相色谱-质谱联用所使用的仪器体积大、对环境要求较高，还需要专门的技术人员进行操作，而本发明的检测方法只是简单的溶解和过滤，对操作人员没有要求，有利于基层现场的流动性检测，有助于提高药监局的监督检验效率。3.成本低廉。高效液相色谱、薄层色谱法、液相色谱-质谱联用所使用的色谦柱和配件价格比较贵，仪器耗损所产生的费用也比较高，昂贵的检测费用令许多厂家望而止步，而本发明的检测方法所使用的都是廉价的试剂和仪器，平均每个样品的检测费用为1元，适合大批量药物的筛查和检测。用本发明的检测方法进行初步筛查，将初步判断为不合格的药品再进行薄层色谱法、高效液相色谱或液相色i普-质谱联用分析，可以大大的降低检测分析成本；在药品监管上也能提高靶向命中率，保证药品质量。在中成药、保健品和食品中，非法掺杂的化学降糖成分主要有格列苯脲、格列吡。秦、格列齐特、盐酸吡格列酮、盐酸二甲双胍、格列喹酮、盐酸苯乙双胍和瑞格列奈。这8种化合物都是含氮的碳水化合物，具有相似的化学结构，由于氮原子的位置不同导致对本发明检测方法的灵敏度也不同，其中以盐酸二曱双胍的灵敏度最低，但是，在这几种药物中，盐酸二曱双胍对人体的毒副作用也最小，其最大用量也最高。各种化学降糖成分的起效量不同，如格列苯脲的起效量为5mg，格列吡嗪的起效量为2.5mg，格列齐特的起效量为80mg，盐酸吡格列酮的起效量为45mg,盐酸二曱双胍的起效量为1000mg,才各列喹酮的起效量为15rag，盐酸苯乙双胍的起效量为25mg，瑞格列奈的起效量为4mg。本发明人通过实验研究证明本发明所述方法的最低检出量与上述化学降糖成分起效量的十分之一基本吻合，因此本发明所述方法适用于中成药、保健品和食品中非法掺入的化学降糖成分的筛查。本发明的上述优点和效果，通过下述实验进行证实。实验一1、实验试剂体积浓度为95%的乙醇溶液；将硫酸配制成体积浓度为30%、40%、45%、50%、55%、60°/。、80%、98%的水溶液;将钼酸铵配制成质量浓度为1%、5%、10%、15%、20%的水溶液。2、实^睑仪器试管、滤头和注射器。3、样品(1)取消渴灵片i片，破碎后掺杂相当于原药质量的1%的格列吡嗪，加入相当于消渴灵片和格列苯脲总质量3倍的乙醇溶液，振荡溶解，静置，过滤，保留滤液；(2)取八宝平糖茗阳胶嚢1粒，其内容物掺杂相当于原药质量的1.6%的格列苯脲，加入相当于八宝平糖茗阳胶嚢内容物和格列苯脲总质量3倍的乙醇溶液，振荡溶解，静置，过滤，保留滤液；(3)糖尿乐胶嚢1粒，取其内容物，加入相当于糖尿乐胶嚢内容物质量3倍的乙醇溶液，振荡溶解，静置，过滤，保留滤液；(4)糖尿乐胶嚢1粒，其内容物相当于原药质量的2%的二曱双胍和1%的苯乙双胍，加入相当于糖尿乐胶嚢内容物、二曱双胍和苯乙双胍总质量3倍的乙醇溶液，振荡溶解，静置，过滤，保留滤液；4、实验方法取lml滤液，依次緩慢加入lml硫酸溶液和lml钼酸铵溶液，摇匀，3分钟后，观察颜色变化。表l-表4为硫酸和钼酸铵浓度对结果判断的影响。表中的"+"表示颜色变化度，2个"+"以上表示肉眼可以区分，"-"表示无颜色变化。加入钼酸铵溶液后，相对于背景色无颜色变化或颜色变化不明显的，则无法判断检测结果。由表l-表4中可以看出，好^酸体积浓度为45-55°/时，钼酸铵质量浓度为10-15%时，可以检测出格列苯脲、格列吡。秦、格列齐特、盐酸吡格列酮、盐酸二曱双胍、格列奮酮、盐酸苯乙双胍或瑞格列奈化学降糖成分。表1不同硫酸和钼酸铵浓度对掺杂格列吡。秦的消渴灵片检测结果的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表2不同硫酸和钼酸铵浓度对掺杂格列苯脲的八宝平糖茗阳胶嚢检测结果的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表3不同硫酸和钼酸铵浓度对糖尿乐胶嚢的检测结果的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表4不同疏酸和钼酸铵浓度对掺杂二曱双胍和苯乙双胍的糖尿乐胶囊的检测结果的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>实验二1、实验试剂和仪器选用实施例1中的检测试剂盒，其中，试剂C配制成质量浓度为10%的水溶液；Frohde反应的试剂选用体积浓度为95%的乙醇、体积浓度为98%的浓硫酸和质量浓度为1%的钼酸铵溶液。2、样品(1)分别称取1.25mg、0.80mg、0.60mg、0.50mg、0.40mg和0.20mg的格列本脲置于注射器中，各加入lml乙醇溶液，振荡溶解，备用；(2)分别称取2.50mg、1.70mg、1.30mg、1.OOmg、0.80mg和0.70mg格列吡嗪置于注射器中，各加入lml乙醇溶液，振荡溶解，备用；(3)分别称取20.Omg、13.3mg、10.Omg、8.Omg、6.7mg和5.Omg格列齐特置于注射器中，各加入lml乙醇溶液，振荡溶解，备用；(4)分别称耳又20.Omg、13.3mg、10.Omg、8.Omg、6.7mg和5.Omg盐酸吡档_列酮置于注射器中，各加入lml乙醇溶液，振荡溶解，备用；(5)分别称耳又125.Omg、83.3mg、62.5mg、50.Omg、41.7mg和40.Omg盐酸二曱双胍置于注射器中，各加入lml乙醇溶液，振荡溶解，备用；(6)分别称耳又15.Omg、10.Omg、7.5mg、6.Omg、5.Omg和4.Omg才各列唾酮置于注射器中，各加入lml乙醇溶液，振荡溶解，备用；(7)分别称取12.5mg、8.3mg、6.25mg、5.Omg、4.Omg和3.Omg盐酸苯乙双胍置于注射器中，各加入lml乙醇溶液，振荡溶解，备用；(8)分别称取1.8mg、1.5mg、1.2mg、1.Omg、0.7mg和0.5mg瑞格列奈置于注射器中，各加入lml乙醇溶液，振荡溶解，备用；3、实验方法往滤液中依次緩慢加入lml硫酸溶液和lml钼酸铵溶液，摇匀，3分钟后，观察颜色。若溶液由浅黄绿色或浅棕色变为墨绿色或蓝紫色则表明样品含过量的了化学降糖成分，反之，表明样品中不含过量的化学降糖成分。本发明的检测方法、Frohde反应对含有不同量、不同类别的化学降糖成分的检测结果如表5所示，由表5可知，本发明的检测方法对格列苯脲的最低检测限为0.4mg，对格列吡。秦的最低检测限为0.8mg，对格列齐特的最低检测限为6.7mg，对盐酸吡格列酮的最低检测限为2.5mg，对盐酸二甲双胍的最低检测限为41.7mg，对格列喹酮的最低检测限为5mg,对盐酸苯乙双胍的最低检测限为4mg，对瑞格列奈的最低检测限为0.7mg。与上述化学降糖成分的最低起效量相比，本发明的方法能够满足上述化学降糖成分的检测要求，适用于对大批量糖尿病药物的初步筛查。实-睑中，将Frohde反应的试剂加入上述药物的水溶液中，随着药物含量的变化，溶液颜色基本无变化，都呈现棕黑色，不能作为药物是否过量掺入化学降糖成分的检测方法；而本发明的检测方法调整了对各种药物的灵敏度，在药物含量低于最低检测限时，本发明的检测方法无法检测出来，可以作为药物是否过量掺入化学降糖成分的检测方法。表5对不同化学降糖成分的最低检出限<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>注"+"表示颜色变化度，2个"+，'以上表示肉眼可以区分，"-"表示无颜色变化:具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例1;险测试剂盒组成为试剂A:体积浓度为95%的乙醇溶液；试剂B:体积浓度为50%的硫酸溶液；试剂C:钼酸铵固体；该试剂盒还包括20个滤头、20支试管和20支注射器。将试剂C溶解配制成质量浓度为10%的水溶液，备用；取消渴灵片1片，压碎后与lmg的格列苯脲混合，置于注射器中，加入相当于消渴灵片和格列苯脲总质量3倍的试剂A,振荡1分钟，静置，注射器头部加滤头，推压过滤，收集滤液。取滤液lml，依次緩慢加入lml试剂B和lml试剂C的水溶液，摇匀，3分钟后，溶液从浅棕色变为墨绿色，说明样品中掺杂了化学降糖成分，该结果与实际相符。实施例2才全测试剂盒的组成为试剂A:体积浓度为90°/。的乙醇溶液；试剂B:体积浓度为55%的硫酸溶液；试剂C:钼酸铵固体；该试剂盒还包括10个滤头、10支试管和10支注射器。将试剂C溶解配制成质量浓度为15%的水溶液，备用。取降糖宁胶囊1粒，将内容物与lmg的盐酸吡格列酮混合后，置于注射器中，加入相当于降糖宁胶嚢和盐酸吡格列酮总质量3倍的试剂A，振荡l分钟，静置，注射器头部加滤头，推压过滤，收集滤液。取滤液lml,依次緩慢加入lml的试剂B和lml试剂C的水溶液，摇匀，3分钟后，溶液从浅棕色变为墨绿色，振荡后，变为蓝色，说明样品掺杂了化学降糖成分，该结果与实际相符。实施例3检测试剂盒的组成为试剂A:体积浓度为96%的乙醇溶液；试剂B:体积浓度为45°/。的>^克酸溶液；试剂C:钼酸铵固体；该试剂盒还包括50个滤头、50支试管和50支注射器。将试剂C溶解配制成质量浓度为12%的水溶液，备用。取西洋参黄精丸1粒，压碎后与lmg的格列喹酮混合，取适量药粉置内容物置于注射器中，加入相当于西洋参黄精丸和格列喹酮总质量3倍的试剂A，振荡1分钟，静置，注射器头部加滤头，推压过滤，收集滤液。取滤液lml,依次緩慢加入lml试剂B和lml试剂C,的水溶液，摇匀，3分钟后，溶液从浅黄棕色变为墨绿色，说明样品中掺杂了化学降糖成分，该结果与实际相符。实施例4检测试剂盒的组成为试剂A:体积浓度为93%的乙醇溶液；13试剂B:体积浓度为52%的硫酸溶液；试剂C:钼酸铵固体；该试剂盒还包括l个滤头、l支试管和l支注射器。将试剂C溶解配制成质量浓度为14%的水溶液，备用。取糖尿乐胶嚢1粒，将内容物置于试管中，加入相当于糖尿乐胶囊质量3倍的试剂A，振荡l分钟，静置，注射器头部加滤头，推压过滤，收集滤液。取滤液lral,依次緩慢加入lml试剂B和lml试剂C的水溶液，摇匀，3分钟后，溶液颜色未发生变化，说明样品中未掺杂化学降糖成分，该结果与实际相符。实施例5-险测试剂盒的组成为试剂A:体积浓度为92°/。的乙醇溶液；试剂B:体积浓度为48%的硫酸溶液；试剂C:钼酸铵固体；该试剂盒还包括5个滤头、5支试管和5支注射器。将试剂C溶解配制成质量浓度为10%的水溶液，备用。取无极限桑唐饮口服液lml与lmg的瑞格列奈混合后置于试管中，加入相当于无极限桑唐饮口服液和瑞格列奈总质量3倍的试剂A，振荡1分钟，静置，注射器头部加滤头，推压过滤，收集滤液。取滤液lml，依次緩慢加入lml试剂B和lml试剂C的水溶液，摇匀，3分钟后，溶液从黄棕色变为浅墨绿色，该结果与实际相符。权利要求1、一种中成药、保健品和食品中掺杂化学降糖成分的筛查方法，该筛查方法由以下步骤组成(1)将钼酸铵溶解配制成质量浓度为10-15％的水溶液，备用；(2)将样品破碎，加入相当于样品质量3倍的体积浓度为90-96％的乙醇溶液，振荡溶解，静置，过滤，保留滤液；(3)取1ml步骤(2)所得的滤液，依次缓慢加入1ml体积浓度为45-55％的硫酸溶液和1ml步骤(1)所得的溶液，摇匀，3分钟后，观察颜色变化，若溶液由浅黄绿色或浅棕色变为墨绿色或紫蓝色则表明样品中掺杂了化学降糖成分，反之，表明样品中没有掺杂化学降糖成分；其中，所述的化学降糖成分为格列苯脲、格列吡嗪、格列齐特、盐酸吡格列酮、盐酸二甲双胍、格列喹酮、盐酸苯乙双胍或瑞格列奈。2、权利要求l所述的中成药、保健品和食品中掺杂化学降糖成分的筛查方法中专用的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括试剂部分，所述试剂部分由以下试剂组成试剂A:体积浓度为90-96%的乙醇溶液；试剂B:体积浓度为45-55%的硫酸溶液；试剂C:钼酸铵。3、根据权利要求2所述的中成药、保健品和食品中掺杂化学降糖成分的筛查方法中专用的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括至少一个滤头、至少一支试管和至少一支带刻度的注射器。4、根据权利要求2所述的中成药、保健品和食品中掺杂化学降糖成分的筛查方法中专用的试剂盒，其特征在于，所述的乙醇溶液的体积浓度为95%。5、根据权利要求2所述的中成药、保健品和食品中掺杂化学降糖成分的筛查方法中专用的试剂盒，其特征在于，所述的硫酸溶液的体积浓度为50%。全文摘要本发明涉及中成药、保健品和食品中掺杂化学降糖成分的筛查方法，该方法的主要步骤为将样品用乙醇溶液溶解，过滤后依次加入硫酸溶液和钼酸铵溶液进行显色反应，根据溶液颜色的变化来判断样品是否过量掺入化学降糖成分。本发明还公开了所述筛查方法的专用试剂盒，该试剂盒中的试剂包括体积浓度为90-96％的乙醇溶液、体积浓度为45-55％的硫酸溶液和钼酸铵固体。本发明的筛查方法适合基层药监人员用于现场快速筛查中成药、保健品和食品中是否掺杂化学降糖成分，具有操作简单、检测时间短、成本低廉等特点。文档编号G01N31/22GK101629942SQ20091004189公开日2010年1月20日申请日期2009年8月17日优先权日2009年8月17日发明者李杨杰,肖树雄,黄诺嘉申请人:广东省药品检验所