专利名称：一种表面等离子共振光谱的时间分辨率检测方法
技术领域：
本发明属于一种表面等离子共振光谱的时间分辨率检测方法。
背景技术：
表面等离子共振(SPR)是近年来迅速发展起来的用于分析生物分子相互作用的一项技术。它利用全反射时入射光可以和金属表面的等离子发生共振的原理，探测生物分子之间是否发生作用以及反应的动力学参数。表面等离子共振检测技术具有灵敏度高、所需试样少、样品无需标记及检测速度快等特点，已广泛应用于免疫学、蛋白质组学、药物筛选、蛋白质与核酸相互作用等各个领域，并获得了许多用其它方法无法得到的动力学数据。
目前的角度调制型SPR检测设备是利用机械结构的运动改变光线的入射角度，以达到角度扫描的目的。但是这种方式每完成一次角度扫描需要的时间较长，其时间分辨率较低，因而无法检测SPR角度的快速变化。(参考文献1.Kang X，Cheng G，Dong S.Electrochem.Commun.，2001，3，489-493.2.Kang，X，Jin，Y，Cheng，G，Dong S.Langmuir 2002，18，1713-1718.3.Baba，A，Advincula，R C，Knoll，W.J.Phys.Chem.B 2002，106，1581-1587.4.Baba，A，Park，M-K，Advincula，R C，Knoll，W.Langmuir2002，18，4648-4652.5.Georgiadis，R，Peterlinz，K A，Rahn，J R，Peterson，A W，Grassi，J H.Langmuir，2000，16，6759-6562.6.Xia，C，Advincula，R，C.Langmuir 2002，18，3555-3560.)
发明内容
为了解决表面等离子共振光谱的时间分辨率检测方法存在的问题，本发明提供了一种SPR光谱的时间分辨率检测方法。
本发明所使用的仪器为电化学原位时间分辨表面等离子体共振测量仪，见牛利，杨贵福，李风华，袁福宇，冯云祥，王伟；电化学原位时间分辨表面等离子体共振测量仪；中国申请号2007100552596；在其基础之上发明人对仪器的光强检测器做了改进，采用双通道检测器代替原来的光电二极管，提高了时间分辨率，提供了一种表面等离子共振光谱的时间分辨率检测方法。
如图1所示，本发明的一种表面等离子共振(SPR)光谱的时间分辨率检测方法所用的装置的构成包括激光器1、半圆柱型棱镜2、金薄膜3、双通道光强检测器4和样品池5构成；其中，半圆柱型棱镜2、金薄膜3和样品池5依次固定连接在一起，样品池5与金薄膜3接触的一面有开口，以便样品溶液与金薄膜3接触；调整激光器1的焦距，使激光器1的焦距在半圆柱型棱镜2的面上；调整双通道光强检测器4距离半圆柱型棱镜2中心的距离L，使激光器1的光斑正好照满双通道光强检测器4，并保证激光器1、半圆柱型棱镜2、双通道光强检测器4和样品池5开口的中心处于同一水平面上，这样可以获得最大的检测灵敏度；所述的双通道光强检测器4是间隔为0.1～0.5mm的两片光电池，两片光电池的中心在同一水平面上并且阳极连接到一起； 以待测物质的最大吸收角度入射的一束非平行光由激光器1入射到半圆柱型棱镜2内发生全反射后照射在双通道光强检测器4上，双通道光强检测器4将检测到的光强值分别记为A1和A2；固定入射角做定角度检测时，随着样品池5中化学反应的进行，出射光的角度θ即为表面等离子共振角度发生改变，导致A1和A2都会发生变化，用两个I/V转换器把两片光电池输出的电流转换成电压，再用两个AD把转换成的电压转换成数字量来记录A1和A2的差(A1-A2)随时间的变化信息数据，(A1-A2)的正负反映了表面等离子共振角度变化的方向，(A1-A2)的绝对值随时间变化的大小反映了表面等离子共振角度随时间变化的快慢，表面等离子共振角度的变化值与光强差比光强和的值(A1-A2)/(A1+A2)成线性关系，表面等离子共振角度θ与(A1-A2)/(A1+A2)的方程式为 θ＝-0.755(A1-A2)/(A1+A2)+65.51 通过双通道检测器4检测到(A1-A2)/(A1+A2)的值，实现了表面等离子共振角度变化的快速检测； 1)将样品池5中通入10m mol/L巯基丙酸溶液在金薄膜3上进行结合组装，组装时间为1-5小时，金薄膜3与巯基丙酸分子结合达到平衡，然后通入pH＝7.0的0.05mol/L磷酸缓冲溶液(PBS)冲洗； 2).用20m mol/L[N-乙基-N-(二甲氨基丙基)]碳二亚胺(EDC)溶液和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液对金薄膜3上结合的巯基丙酸的羧基进行活化，形成高活性的O-酰基中间体，有利于巯基丙酸的羧基与下一步抗体的氨基结合形成酰胺键，然后通入pH＝7.0的0.05mol/L磷酸缓冲溶液(PBS)冲洗； 3)通入1mg/mL抗体溶液与金薄膜上的巯基丙酸键合，将抗体结合到金薄膜3的表面，然后通入pH＝7.0的0.05mol/L磷酸缓冲溶液(PBS)冲洗； 4)通入0.2m mol/L的氨基乙酸溶液去活化，减少抗体与巯基丙酸的非特异性键合，然后通入pH＝7.0的0.05mol/L磷酸缓冲溶液(PBS)冲洗； 5)通入大于0.5μg/mL的抗体相对应小分子的溶液，进行小分子的与其抗体之间特异性识别的一种表面等离子共振光谱的时间分辨率检测； 6)结果得到(A1-A2)/(A1+A2)随时间的变化曲线，使用公式θ＝-0.755(A1-A2)/(A1+A2)+65.51，将纵坐标转变为表面等离子体共振角度θ，最终得到表面等离子体共振角度θ随时间的变化曲线，完成了一种表面等离子共振光谱的时间分辨率检测。得到了小分子与其抗体识别的动力学过程。
所述的表面等离子体共振角度θ与光强差(A1-A2)与光强和(A1+A2)的比值(A1-A2)/(A1+A2)成线性关系，(参考文献Tao，N J，Boussaad，S，Huang，W L，Arechabaleta，R A，D′Agnese，J.Rev.Sci.Instrum.，1999，70，4656-4660.) 图2是SPR角度变化检测范围计算示意图。本发明的计算公式推导如下 θ＝a(A1-A2)/(A1+A2)+b 式中，θ为双通道光强检测器4检测到的出射光的角度值即为表面等离子体共振角度，A1和A2分别为双通道光强检测器4检测到的光强值；a，b为假设的系数。
图3为固定入射光角度分别在65.4°，65.8°，66.2°时测的(A1-A2)/(A1+A2)的值，以角度值为横坐标，(A1-A2)/(A1+A2)值为纵坐标所得到的直线； 然后取直线的任意两个点，发明人取(65.42，0.115)，(66.23，-0.858)为例来计算方程中的系数a，b； 65.42＝a0.115+b (1) 66.23＝-a0.858+b(2) 由方程(1)、(2)得到a＝-0.755，b＝65.51 因此，表面等离子体共振角度θ与(A1-A2)/(A1+A2)的方程式为θ＝-0.755(A1-A2)/(A1+A2)+65.51。
本发明检测的对象范围为小分子与其抗体相互识别的动力学过程，例如吗啡抗体与吗啡分子，甲基苯丙胺抗体与甲基苯丙胺分子，苯丙胺抗体与苯丙胺分子，氯胺酮抗体与氯胺酮分子，大麻抗体与大麻分子，摇头丸抗体与摇头丸分子，麻黄碱抗体与麻黄碱分子，美沙酮抗体与美沙酮分子，可卡因抗体与可卡因分子，麦角酰二胺抗体与麦角酰二胺分子。
有益效果由于小分子与金片上固定的抗体结合是一个十分快速的过程，普通的手段是实现不了整个结合过程的动力学检测。本发明提供了一种SPR光谱的时间分辨率检测方法，能够实现表面等离子共振角度变化值的快速检测，从而使获得小分子与其抗体结合的动力学信息成为可能。本发明检测的对象范围为小分子与其抗体相互识别的动力学过程，例如吗啡抗体与吗啡分子，甲基苯丙胺抗体与甲基苯丙胺分子，苯丙胺抗体与苯丙胺分子，氯胺酮抗体与氯胺酮分子，大麻抗体与大麻分子，摇头丸抗体与摇头丸分子，麻黄碱抗体与麻黄碱分子，美沙酮抗体与美沙酮分子，可卡因抗体与可卡因分子，麦角酰二胺抗体与麦角酰二胺分子。
本发明提供的一种SPR光谱的时间分辨率检测方法，利用间隔只有0.1～0.5mm的两片光电池作为SPR仪器的双通道光强检测器来检测SPR角度随时间变化的情况。其结构简单，响应时间可以达到30纳秒，稳定性可以达到0.5‰，并且成本很低。
图1是本发明的一种表面等离子共振(SPR)光谱的时间分辨率检测方法所用的装置的构成示意图。
图2是SPR角度变化检测范围计算示意图。
图3为固定入射光角度分别在65.4°，65.8°，66.2°时测的(A1-A2)/(A1+A2)的值，以角度值为横坐标，(A1-A2)/(A1+A2)值为纵坐标所得到的直线。
图4是吗啡分子的SPR光谱的时间分辨率检测图。
图5是甲基苯丙胺的SPR光谱的时间分辨率检图。
图6是苯丙胺的SPR光谱的时间分辨率检测图。
具体实施例方式 实施例1吗啡分子的SPR光谱的时间分辨率检测方法 本发明所使用的仪器为电化学原位时间分辨表面等离子体共振测量仪，见牛利，杨贵福，李风华，袁福宇，冯云祥，王伟；电化学原位时间分辨表面等离子体共振测量仪；中国申请号2007100552596；在其基础之上发明人对仪器的光强检测器做了改进，采用双通道检测器代替原来的光电二极管，提高了时间分辨率，提供了一种表面等离子共振光谱的时间分辨率检测方法。
如图1所示，本发明的一种表面等离子共振(SPR)光谱的时间分辨率检测方法所用的装置的构成包括激光器1、半圆柱型棱镜2、金薄膜3、双通道光强检测器4和样品池5构成；其中，半圆柱型棱镜2、金薄膜3和样品池5依次固定连接在一起，样品池5与金薄膜3接触的一面有开口，以便样品溶液与金薄膜3接触；调整激光器1的焦距，使激光器1的焦距在半圆柱型棱镜2的面上；调整双通道光强检测器4距离半圆柱型棱镜2中心的距离L，使激光器1的光斑正好照满双通道光强检测器4，并保证激光器1、半圆柱型棱镜2、双通道光强检测器4和样品池5开口的中心处于同一水平面上，这样可以获得最大的检测灵敏度；所述的双通道光强检测器4是间隔为0.1～0.5mm的两片光电池，两片光电池的中心在同一水平面上并且阳极连接到一起。
以待测物质的最大吸收角度入射的一束非平行光由激光器1入射到半圆柱型棱镜2内发生全反射后照射在双通道光强检测器4上，双通道光强检测器4将检测到的光强值分别记为A1和A2；固定入射角做定角度检测时，随着样品池5中化学反应的进行，出射光的角度θ即为表面等离子共振角度发生改变，导致A1和A2都会发生变化，用两个I/V转换器把两片光电池输出的电流转换成电压，再用两个AD把转换成的电压转换成数字量来记录A1和A2的差(A1-A2)随时间的变化信息数据，(A1-A2)的正负反映了表面等离子共振角度变化的方向，(A1-A2)的绝对值随时间变化的大小反映了表面等离子共振角度随时间变化的快慢，表面等离子共振角度的变化值与光强差比光强和的值(A1-A2)/(A1+A2)成线性关系，表面等离子共振角度θ与(A1-A2)/(A1+A2)的方程式为 θ＝-0.755(A1-A2)/(A1+A2)+65.51 通过双通道检测器4检测到(A1-A2)/(A1+A2)的值，实现了表面等离子共振角度变化的快速检测；具体步骤如下 1.将样品池5中通入10m mol/L巯基丙酸溶液在金薄膜3上进行结合组装，组装时间为1-5小时，金薄膜3与巯基丙酸分子结合达到平衡。然后通入pH＝7.0的0.05mol/L磷酸缓冲溶液(PBS)冲洗； 2.用20m mol/L[N-乙基-N-(二甲氨基丙基)]碳二亚胺(EDC)溶液和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液对金薄膜3上结合的巯基丙酸的羧基进行活化，形成高活性的O-酰基中间体，有利于巯基丙酸的羧基与下一步抗体的氨基结合形成酰胺键。然后通入pH＝7.0的0.05mol/L磷酸缓冲溶液(PBS)冲洗； 3.通入1mg/mL吗啡抗体溶液与金薄膜3上的巯基丙酸键合，将吗啡抗体结合到金薄膜3的表面。然后通入pH＝7.0的0.05mol/L磷酸缓冲溶液(PBS)冲洗； 4.通入0.2m mol/L的氨基乙酸溶液去活化，减少吗啡抗体与巯基丙酸的非特异性键合。然后通入pH＝7.0的0.05mol/L磷酸缓冲溶液(PBS)冲洗； 5.通入大于0.5μg/mL的吗啡溶液，进行吗啡分子的与吗啡抗体之间特异性识别的一种表面等离子共振光谱的时间分辨率检测。
6.通过双通道检测器4检测到(A1-A2)/(A1+A2)的值，使用公式 θ＝-0.755(A1-A2)/(A1+A2)+65.51 以θ角度值为横坐标，(A1-A2)/(A1+A2)值为纵坐标，最终得到表面等离子体共振角度θ随时间的变化曲线，完成了一种表面等离子共振光谱的时间分辨率检测。，反映吗啡分子与其抗体识别的动力学过程。结果如图4所示。
实施例2甲基苯丙胺的SPR光谱的时间分辨率检测方法 所用装置和步骤1-2，均与实施例1同；接着进行如下步骤 3.通入1mg/mL甲基苯丙胺抗体溶液与金薄膜3上的巯基丙酸键合，将甲基苯丙胺抗体结合到金薄膜3的表面。然后通入pH＝7.0的0.05mol/L磷酸缓冲溶液(PBS)冲洗。
4.通入0.2m mol/L的氨基乙酸溶液去活化，减少甲基苯丙胺抗体与巯基丙酸的非特异性键合。然后通入pH＝7.0的0.05mol/L磷酸缓冲溶液(PBS)冲洗。
5通入大于0.5μg/mL的甲基苯丙胺溶液，进行甲基苯丙胺分子的与甲基苯丙胺抗体之间特异性识别的一种表面等离子共振光谱的时间分辨率检测。
6.通过双通道检测器4检测到(A1-A2)/(A1+A2)的值，使用公式 θ＝-0.755(A1-A2)/(A1+A2)+65.51 以θ角度值为横坐标，(A1-A2)/(A1+A2)值为纵坐标，最终得到表面等离子体共振角度θ随时间的变化曲线，完成了一种表面等离子共振光谱的时间分辨率检测。反映甲基苯丙胺分子与其抗体识别的动力学过程。结果如图5所示。
实施例3苯丙胺的SPR光谱的时间分辨率检测方法 所用装置和步骤1-2，均与实施例1同；接着进行如下步骤 3.通入1mg/mL苯丙胺抗体溶液与金薄膜3上的巯基丙酸键合，将甲基苯丙胺抗体结合到金薄膜3的表面。然后通入pH＝7.0的0.05mol/L磷酸缓冲溶液(PBS)冲洗； 4.通入0.2m mol/L的氨基乙酸溶液去活化，减少苯丙胺抗体与巯基丙酸的非特异性键合。然后通入pH＝7.0的0.05mol/L磷酸缓冲溶液(PBS)冲洗； 5.通入大于0.5μg/mL的苯丙胺溶液，进行苯丙胺分子的与苯丙胺抗体之间特异性识别的一种表面等离子共振光谱的时间分辨率检测。
6.通过双通道检测器4检测到(A1-A2)/(A1+A2)的值，使用公式 θ＝-0.755(A1-A2)/(A1+A2)+65.51 以θ角度值为横坐标，(A1-A2)/(A1+A2)值为纵坐标，最终得到表面等离子体共振角度θ随时间的变化曲线，完成了一种表面等离子共振光谱的时间分辨率检测。反映苯丙胺分子与其抗体识别的动力学过程。结果如图6所示。
权利要求
1.一种表面等离子共振光谱的时间分辨率检测方法，其特征在于步骤和条件如下
所用的装置包括激光器(1)、半圆柱型棱镜(2)、金薄膜(3)、双通道光强检测器(4)和样品池(5)构成；其中，半圆柱型棱镜(2)、金薄膜(3)和样品池(5)依次固定连接，样品池(5)与金薄膜(3)接触的一面有开口，以便样品溶液与金薄膜(3)接触；调整激光器(1)的焦距，使激光器(1)的焦距在半圆柱型棱镜(2)的面上；调整双通道光强检测器(4)距离半圆柱型棱镜(2)中心的距离L，使激光器(1)的光斑正好照满双通道光强检测(4)，并保证激光器(1)、半圆柱型棱镜(2)、双通道光强检测器(4)和样品池(5)开口的中心处于同一水平面上，这样可以获得最大的检测灵敏度；所述的双通道光强检测器4是间隔为0.1～0.5mm的两片光电池，两片光电池的中心在同一水平面上并且阳极连接到一起；
以待测物质的最大吸收角度入射的一束非平行光由激光器(1)入射到半圆柱型棱(2)内发生全反射后照射在双通道光强检测器(4)上，双通道光强检测器(4)将检测到的光强值分别记为A1和A2；固定入射角做定角度检测时，随着样品池(5)中化学反应的进行，出射光的角度θ即为表面等离子共振角度发生改变，导致A1和A2都会发生变化，用两个I/V转换器把两片光电池输出的电流转换成电压，再用两个AD把转换成的电压转换成数字量来记录A1和A2的差(A1-A2)随时间的变化信息数据，(A1-A2)的正负反映了表面等离子共振角度变化的方向，(A1-A2)的绝对值随时间变化的大小反映了表面等离子共振角度随时间变化的快慢，表面等离子共振角度的变化值与光强差比光强和的值(A1-A2)/(A1+A2)成线性关系，表面等离子共振角度θ与(A1-A2)/(A1+A2)的方程式为
θ＝-0.755(A1-A2)/(A1+A2)+65.51；
1)将样品池(5)中通入10m mol/L巯基丙酸溶液在金薄膜(3)上进行结合组装，组装时间为1-5小时，金薄膜3与巯基丙酸分子结合达到平衡，然后通入pH＝7.0的0.05mol/L磷酸缓冲溶液冲洗；
2).用20m mol/L[N-乙基-N-(二甲氨基丙基)]碳二亚胺溶液和N-羟基琥珀酰亚胺溶液对金薄膜(3)上结合的巯基丙酸的羧基进行活化，形成高活性的O-酰基中间体，有利于巯基丙酸的羧基与下一步抗体的氨基结合形成酰胺键，然后通入pH＝7.0的0.05mol/L磷酸缓冲溶液冲洗；
3)通入1mg/mL抗体溶液与金薄膜上的巯基丙酸键合，将抗体结合到金薄膜(3)的表面，然后通入pH＝7.0的0.05mol/L磷酸缓冲溶液冲洗；
4)通入0.2m mol/L的氨基乙酸溶液去活化，减少抗体与巯基丙酸的非特异性键合，然后通入pH＝7.0的0.05mol/L磷酸缓冲溶液冲洗；
5)通入大于0.5μg/mL的抗体相对应小分子的溶液，进行小分子的与其抗体之间特异性识别的一种表面等离子共振光谱的时间分辨率检测；
6)通过双通道检测器(4)检测到(A1-A2)/(A1+A2)的值，使用公式
θ＝-0.755(A1-A2)/(A1+A2)+65.51
以θ角度值为横坐标，(A1-A2)/(A1+A2)值为纵坐标，最终得到表面等离子体共振角度θ随时间的变化曲线，完成了一种表面等离子共振光谱的时间分辨率检测。
全文摘要
一种表面等离子共振光谱的时间分辨率检测方法，所使用的仪器为电化学原位时间分辨表面等离子体共振测量仪，利用间隔只有0.1～0.5mm的两片光电池作为SPR仪器的双通道光强检测器来检测SPR角度随时间变化的情况。其结构简单，响应时间可以达到30纳秒，稳定性可以达到0.5‰，并且成本很低。由于小分子与金片上固定的抗体结合是一个十分快速的过程，普通的手段是实现不了整个结合过程的动力学检测。本发明能够实现表面等离子共振角度变化值的快速检测，从而使获得小分子与其抗体结合的动力学信息成为可能。本发明检测的对象范围为小分子与其抗体相互识别的动力学过程。
文档编号G01N21/75GK101556248SQ20091006696
公开日2009年10月14日 申请日期2009年5月18日 优先权日2009年5月18日
发明者袁福宇, 利 牛, 伟 王, 李风华, 斐 李 申请人:中国科学院长春应用化学研究所