专利名称：检测化合物抗过敏作用的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种检测化合物抗过敏作用强弱的方法，特别涉及一种 通过观察鸡胚尿囊卵黄膜血管的变化程度来检测化合物抗过敏作用强弱的方法。
背景技术：
近年来过敏物质所致皮肤疾病正在逐年增多，成为皮肤科常见疾病之一。对于化合物抗 过敏性的评价也越来越引起人们的注意，传统对化合物的抗过敏性的评价主要以动物试验为 主，但在全球化的动物保护运动的影响下，发达国家普遍开展了以替代(r印lacement)、减 少(reduction)和优化(refinement)为核心的"3R"运动，体外替代实验将逐步取代动物 实验。欧盟2003年3月正式通过化妆品指令2003/15/EC，其主要议题就是对化妆品成品及 其成分的非动物测试的规定和限制。很多国家都在对动物替代评价体系进行研究。
目前对化妆品眼刺激性的动物替代方法研究中，鸡胚绒毛膜尿囊膜动物替代试验法 (hen， s egg test chorioallantoic membrane , HET-鸡胚绒毛尿囊膜)是研究中的热点。鸡 胚尿囊膜绒毛膜是鸡胚的呼吸膜,血管丰富,紧贴于蛋壳膜下，鸡胚尿囊膜绒毛膜试验通过观
察尿囊膜暴露于化学物质后血管的变化-充血、出血和凝血并计算剌激分值,根据结果对
受试物评分操作简单，费用较低，重现性好，与体内试验结果的相关性高，值得推广。但该方 法中，传统的是将鸡壳开窗，直接将测试物质加到暴露的尿囊膜绒毛膜上，视野窄，鸡胚血 管网个体差异大，不好统一标准，并且仅仅能够评价急性刺激性(5min内的)，而且该方法 也没有用于对化合物抗过敏性的评价方面应用的记录。
发明内容
本发明的发明目的是，提供一种体外进行化合物抗过敏作用检测的方法，而且可以降低 试验的成本，提高试验的准确性， 一致性。
本发明提供一种检测化合物抗过敏作用的方法，依次包括以下步骤
1、 将受精鸡卵用75%酒精消毒后置于有加湿水盘的孵箱中孵化75到100小时；
2、 打开蛋壳，将鸡胚移入75到90ram直径的无菌玻璃平皿中，平皿中预先加入预热37
3。C的开壳缓冲液l到4ml，开壳缓冲液的成分为CaCL2.2H20 : 0. 265g/l;无水MgS04 :0.09767 g/l: KC1: 0. 4g/l; NaHCO" 2.2g/l; NaCl: 6.8g/l;无水Na2HP04 : 0. 122g/l;青霉素 0. 066g/l;链霉素0. 154g/l;
3、 选择卵黄膜未破、鸡胚尿囊卵黄膜血网管位于卵黄中央上方的鸡胚，盖好平皿盖，放 入37. 5'C恒温孵育箱中继续孵育到第8到15天；
4、 选择鸡胚尿囊卵黄膜血管发育好的的鸡胚，随机进行分组，分别加入不同浓度待测化 合物和空白对照物，加入待测化合物和空白对照物的方式为鸡胚尿囊卵黄膜血管网表面滴加 或血管内注射，之后将鸡胚放入37. 5'C恒温孵育箱中继续孵育，在继续孵育到1小时或12 小时或24小时或48小时的时候，在鸡胚尿囊卵黄膜血管网表面滴加等量的浓度为1%十二 烷基硫酸钠或0. 1mmol/L NaOH等己知对鸡胚尿囊卵黄膜血管有剌激性的物质，上述操作均是 在无菌的环境下完成，依照刺激因子法对血管的变化进行评分,并计算不同浓度抗过敏化合物 的抑制率。
本发明提供的检测化合物抗过敏作用的方法，其中所述打开蛋壳的方法为，用牙科钻在 蛋壳中央垂直长轴磨切出一道1.5到5cm长切口，以切口为界向两侧掰开蛋壳。
本发明提供的检测化合物抗过敏作用的方法，其中所述待测化合物为水溶性成分，将其 溶于生理盐水中，各剂量组滴加0. 1到lml或血管注射0. 1到0. 5ml。
本发明提供的检测化合物抗过敏作用的方法，其中所述待测化合物为水溶性差的成分， 先用二甲基亚砜将该化合物溶解，并用生理盐水将二甲基亚砜浓度稀释至小于O. W，各剂量 组加入的化合物的量为，滴加时0. lml到lml或血管注射时0. 1 ml到0. 5ml。
本发明使用鸡胚为试验材料，避免使用活体动物作为实验对象体，而且在操作过程中将 鸡胚移入平皿，这样扩大了操作视野，非常直观，有利于结果记录及评价，有利于给药部位 确定及保证给药部位一致性，降低个体差异，通过加入缓冲液，提高了鸡胚继续孵化的存活 率，长时间使用，有利于试验材料的节省。故此，该方法简便，价格便宜、观察指标明了。
图1为肉眼所见鸡胚8天的鸡胚尿囊卵黄膜血管网照片；
图2为肉眼所见鸡胚12天的鸡胚尿囊卵黄膜血管网照片；
图3为肉眼所见鸡胚15天的鸡胚尿囊卵黄膜血管网照片；
图4为普通解剖放大镜下鸡胚尿囊卵黄膜血管，血管出血的照片；
图5为普通解剖放大镜下鸡胚尿囊卵黄膜血管，血管凝血的照片；
图6为普通解剖放大镜下鸡胚尿囊卵黄膜血管，血管溶解的照片。
具体实施例方式
通过实施例进一步说明本发明，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围中。
实施例1
材料与方法
材料
1、 鸡卵无特定病原体(SPF)级受精鸡卵，3日龄，购于北京梅里亚通实验动物技术有限 公司；
2、 各种试剂购于北京化学试剂公司及sigma试剂公司；
方法
1、 将鸡卵用75%酒精消毒后置于有加湿水盘的孵箱中孵化84小时；
2、 用牙科钻在蛋壳中央垂直长轴磨切出一道5cm长切口，以切口为界向两侧掰开蛋壳， 将鸡胚移入90mm直径的无菌玻璃平皿中，平皿中预先加入预热37。C的开壳缓冲液2ml，开壳 缓冲液的成分为CaCL2. 2H20 : 0. 265g/l;无水MgS04 : 0. 09767 g/1; KC1: 0.4g/l; NaHCO,: 2. 2g/l; NaCl: 6. 8 g/1;无水NazHP04 : 0. 122g/l;青霉素0. 066g/l;链霉素0.154g/l;
3、 选择卵黄膜未破、鸡胚尿囊卵黄膜血管网位于卵黄中央上方的鸡胚，盖好平皿盖，放 入37. 5'C恒温孵育箱中继续孵育到第8天，该鸡胚如图l所示；
4、 选择鸡胚尿囊卵黄膜血管网发育好的鸡胚20只，随机分为4组，加入待测黄酮类抗 过敏化合物，加入方式为将该黄酮类抗过敏化合物用生理盐水溶解为浓度分别为0, 1， 10， 20刚o1/1,每剂量组各5只，在鸡胚尿囊卵黄膜血管网表面滴加该黄酮类抗敏化合物l毫升， 之后继续放入孵箱孵育，上述操作均是在无菌的环境下完成，此后继续孵化24h时，每只鸡 胚的尿囊卵黄膜血管网上分别滴加0. lmmol/L NAOH lml ,采用刺激因子法(irritation score, IS)对其刺激性进行判定，计算每组的刺激性抑制率及p值。
结果观察加入0. lmmol/L Na0H 1 ml后300秒内观察鸡胚尿囊卵黄膜血管的反应，监 控并记录每一种预期变化出现的时间，精确到秒。观察终点包括出血血液从血管和/或从 毛细血管流出，如图4;血管溶解:终末毛细血管消失，血管树枝样变，如图5;凝血指血 管内和血管外蛋白的变性，如图6。
结果评价
刺激因子法(irritation score, IS).下列公式显示了如何计算IS值
'301-出血时间
301-血管溶解时间
、、 300
x7
+ |
301-凝血时间
人
x9
5出血时间=加入刺激物到鸡胚尿囊卵黄膜上观察到开始发生出血的时间(秒)
血管溶解时间=加入刺激物到鸡胚尿囊卵黄膜上观察到开始发生出血的时间(秒)
凝血时间=加入剌激物到鸡胚尿囊卵黄膜上观察到血管开始出现溶解的时间(秒) 抑制率(W卜IS'/(IS厂IS。) X薩o IS,:加入抗敏化合物后测得NA0H的IS值 ISn:未加入抗敏化合物对照组测得的NA0H的IS值
结果黄酮类抗敏化合物A对O. lmmol/LNAOH的刺激性有抑制作用。浓度为0， 1， 10， 20刚o1/1时，抑制率分别为0， 24%, 50% (p<0. 01)' 72% (p〈0. 001)。 实施例2 材料与方法 材料
1、鸡卵无特定病原体(SPF)级受精鸡卵，3日龄,购于北京梅里亚通实验动物技术有限 公司；2、各种试剂购于北京化学试剂公司及sigma试剂公司；
方法
1、 将鸡卵用75%酒精消毒后置于有加湿水盘的孵箱中孵化90小时；
2、 用牙科钻在蛋壳中央垂直长轴磨切出一道1.5cm长切口，以切口为界向两侧掰开蛋壳， 将鸡胚移入90,直径的无菌玻璃平皿中，平皿中预先加入预热37i:的开壳缓冲液2ml，开壳 缓冲液的成分为CaCU. 2H20 : 0.265g/l;无水MgS04 : 0. 09767 g/l: KC1: 0.4g/l; NaHC03: 2.2g/l; NaCl: 6.8g/l;无水船2冊04 : 0. 122g/l;青霉素0.066g/l;链霉素0. 154g/l;
3、 选择卵黄膜未破、鸡胚尿囊卵黄膜血管网位于卵黄中央上方的鸡胚，盖好平皿盖，放 入37. 5'C恒温孵育箱中继续孵育到第12天，如图2;
4、 选择鸡胚尿囊卵黄膜血管网发育好的鸡胚15只，随机分为3组，加入待测天然提取 的抗敏化合物，加入方式为，首先将该化合物用生理盐水溶解成浓度为O， 1， 10Mmol/l的溶 液，每剂量组各5只，每只鸡胚尿囊卵黄膜血管网上表面滴加1毫升，之后继续放入孵箱孵 育，上述操作均是在无菌的环境下完成，此后继续孵化24h后，在每只鸡胚的鸡胚尿囊卵黄 膜血管网分别加入1%十二烷基硫酸钠lml ,加入方式为表面滴加，采用刺激因子法
(irritation score, IS)对其刺激性进行判定，计算每组的刺激性抑制率及P值。
结果观察加入1%十二烷基硫酸钠后300秒内观察鸡胚尿囊卵黄膜血管的反应，监 控并记录每一种预期变化出现的时间，精确到秒。观察终点包括-
出血血液从血管和Z或从毛细血管流出，如图4;血管溶解终末毛细血管消失，血管树枝样变，如图5;凝血指血管内和血管外蛋白的变性，如图6。
结果评价刺激因子法(irritation score, IS).下列公式显示了如何计算IS值:
V、
301-出血时间' 300
、 x5+
」
'301-血管溶解时间
、、
x7+
J 」
301-凝血时间 300
x9
出血时间=加入刺激物到鸡胚尿囊卵黄膜上观察到开始发生出血的时间(秒)
血管溶解时间=加入刺激物到鸡胚尿囊卵黄膜上观察到开始发生出血的时间(秒)
凝血时间=加入刺激物到鸡胚尿囊卵黄膜上观察到血管开始出现溶解的时间(秒) 抑制率(％) =IS,/ (IS「IS。) X 100% IS卜'加入抗敏化合物后测得NA0H的IS值 IS,,:未加入抗敏化合物对照组测得的NA0H的IS值
结果该天然提取的抗敏化合物A对1%十二垸基硫酸钠的刺激性有抑制作用。浓度为0，
1, 10tool/l时，抑制率分别为0， 32%， 71% (p<0.01)。
实施例3
材料与方法
材料
1、 鸡卵无特定病原体(SPF)级受精鸡卵，3日龄,购于北京梅里亚通实验动物技术有限 公司；
2、 各种试剂购于北京化学试剂公司及sigma试剂公司；
方法
1、 将鸡卵用75%酒精消毒后置于有加湿水盘的孵箱中孵化90小时；
2、 用牙科钻在蛋壳中央垂直长轴磨切出一道3cm长切口，以切口为界向两侧掰开蛋壳， 将鸡胚移入90,直径的无菌玻璃平皿中，平皿中预先加入预热37"C的丌壳缓冲液2ml，开壳 缓冲液的成分为CaCU. 2H20 : 0 . 265g/l;无水MgS04 : 0. 09767 g/l; KC1 : 0. 4 g/1; NaHC03 :
2. 2 g/l; NaCl:6. 8 g/1;无水Na異:0. 122g/l;青霉素0. 066g/l;链霉素0. 154g/l;
3、 选择卵黄膜未破、鸡胚尿囊卵黄膜血管网位于卵黄中央上方的鸡胚，盖好平皿盖，放 入37. 5'C恒温孵育箱中继续孵育到第15天，如图3;
4、选择鸡胚尿囊卵黄膜血管发育好的鸡胚15只，随机分为3组，加入待测水溶性差的植 物提取物，加入的方式为，首先用二甲基亚砜溶解该物质，溶解(二甲基亚砜终浓度小于0. 1%) 浓度为0， 1, 10陶o1/1，血管内注射，每剂量组各5只，每只0.2毫升，继续放入孵箱孵育， 上述操作均是在无菌的环境下完成，继续孵化12小时后，在鸡胚尿囊卵黄膜血管网上分别加入1%十二烷基硫酸钠lml ,加入方式为表面滴加，采用刺激因子法(irritation score, IS)对其刺激性进行判定，计算每组的刺激性抑制率及p值。
结果观察加入1%十二烷基硫酸钠后300秒内观察鸡胚尿囊卵黄膜血管的反应，监 控并记录每一种预期变化出现的时间，精确到秒。观察终点包括
出血血液从血管和/或从毛细血管流出，如图4;血管溶解终末毛细血管消失，血管 树枝样变，如图5;凝血指血管内和血管外蛋白的变性，如图6。
结果评价刺激因子法(irritation score, IS).下列公式显示了如何计算工S值
V、
301-出血时间' 300
、、
x 5 」 」+
301-血管溶解时间
人 、 x7
/7
+
301-凝血时间、 300 ,
x9
出血时间=加入剌激物到鸡胚尿囊卵黄膜上观察到开始发生出血的时间(秒) 血管溶解时间=加入刺激物到鸡胚尿囊卵黄膜上观察到开始发生出血的时间(秒) 凝血时间=加入刺激物到鸡胚尿囊卵黄膜上观察到血管开始出现溶解的时间(秒)
抑制率(。/。卜isy(is,-is。) X100%
IS':加入抗敏化合物后测得NA0H的IS值 ISn:未加入抗敏化合物对照组测得的NA0H的IS值
结果该植物提取物对1%十二垸基硫酸钠的剌激性有抑制作用。浓度为0， 1， lOMmol/1 时，抑制率分别为0， 21%， 51% (p<0.01)。 实施例4 材料与方法 材料
1、 鸡卵无特定病原体(SPF)级受精鸡卵50只，3 R龄,购于北京梅里亚通实验动物技 术有限公司；
2、 各种试剂购于北京化学试剂公司及sigma试剂公司； 方法
1、 将鸡卵用75%酒精消毒后置于有加湿水盘的孵箱中孵化84小时；
2、 用牙科钻在蛋壳中央垂直长轴磨切出一道5cm长切口，以切口为界向两侧掰开蛋壳， 将鸡胚移入75mm直径的无菌玻璃平皿中。选上述鸡胚40只，随机分成两组每组20只， 一组 放入平皿中； 一组平皿中预先加入预热37'C的开壳缓冲液2ml，开壳缓冲液的成分为 CaCU 2即:0. 265g/l;无水MgS04 : 0. 09767 g/l; KC1: 0.4g/l; Na跳:2.2g/l; NaCl: 6.8g/l;无水Na2HP04 : 0. 122g/l;青霉素0.066g/l;链霉素0. 154g/l;以上操作均是在无菌条件下完成。将两组鸡胚放入37. 5"恒温孵育箱中继续孵育至15天。
结果未加开壳缓冲液时，孵化第8天鸡胚存活率为30%,第9天为15%，第10天为
10%，第11天5%，第12天为0%孵化时间越长，死亡率越高。加入开壳缓冲液后，孵化第
8天鸡胚存活率为80%，第9天为80%，第10天为80%，第12天为75%，第13天为75%
孵化第14天为70%，第15天为70%。
通过加入开壳缓冲液延长了鸡胚在平皿中的存活时间。
9
权利要求
1、检测化合物抗过敏作用的方法，其特征在于依次包括以下步骤1)将受精鸡卵用75％酒精消毒后置于有加湿水盘的孵箱中孵化75到100小时；2)打开蛋壳，将鸡胚移入75到90mm直径的无菌玻璃平皿中，平皿中预先加入预热37℃的开壳缓冲液1到4ml，开壳缓冲液的成分为CaCL2.2H2O0.265g/l；无水MgSO40.09767g/l；KCl0.4g/l；NaHCO32.2g/l；NaCl6.8g/l；无水Na2HPO40.122g/l；青霉素0.066g/l；链霉素0.154g/l；3)选择卵黄膜未破、鸡胚尿囊卵黄膜血管网位于卵黄中央上方的鸡胚，盖好平皿盖，放入37.5℃恒温孵育箱中继续孵育到第8到15天；4)选择鸡胚尿囊卵黄膜血管发育好的鸡胚，随机进行分组，分别加入不同浓度的待测化合物和空白对照物，加入化合物和空白对照物的方式为鸡胚尿囊卵黄膜血管网表面滴加或血管内注射，之后将鸡胚放入37.5℃恒温孵育箱中继续孵育，在继续孵育到1小时或12小时或24小时或48小时的时候，在鸡胚尿囊卵黄膜血管网表面滴加等量的浓度为1％十二烷基硫酸钠或0.1mmol/L NaOH等已知对鸡胚尿囊卵黄膜血管有刺激性的物质，上述操作均是在无菌的环境下完成，依照刺激因子法对血管的变化进行评分，并计算不同浓度化合物的抑制率。
2、 依权利要求1检测化合物抗过敏作用的方法，其特征在于所述打开蛋壳的方法为，用 牙科钻在蛋壳中央垂直长轴磨切出一道1. 5到5cm长切口，以切口为界向两侧掰开蛋壳。
3、 依权利要求2检测化合物抗过敏作用的方法，其特征在于所述待测化合物为水溶性成 分，将其溶于生理盐水中，各剂量组加入的化合物的量为，滴加时0. lml到lml或血管注射 时0. 1 ml到0. 5ml。
4、 依权利要求2检测化合物抗过敏作用的方法，其特征在于所述待测化合物水溶性差， 先用二甲基亚砜将该化合物溶解，并用生理盐水将二甲基亚砜浓度稀释至小于0.1%，各剂量 组加入的化合物的量为，滴加时0. lml至ij lml或血管注射时0. 1 ml到0.5ml。
全文摘要
检测化合物抗过敏作用的方法，依次包括以下步骤将受精鸡卵用75％酒精消毒后置于有加湿水盘的孵箱中孵化75到100小时；打开蛋壳，将鸡胚移入75到90mm直径的无菌玻璃平皿中，平皿中预先加入预热37℃的开壳缓冲液，选择卵黄膜未破的鸡胚放入37.5℃恒温孵育箱中继续孵育到第8到15天；随机进行分组，加入待测化合物之后将鸡胚放入恒温孵育箱中继续孵育，在继续孵育到1小时或12小时或24小时或48小时的时候，加入已知对鸡胚尿囊卵黄膜血管有刺激性的物质，依照刺激因子法对血管的变化进行评分，并计算不同浓度抗过敏化合物的抑制率。该方法简便，价格便宜、观察指标明。
文档编号G01N33/50GK101487839SQ200910078358
公开日2009年7月22日 申请日期2009年2月26日 优先权日2009年2月26日
发明者杨晓冉, 王军兵, 董益阳, 邹运动, 郑洪艳 申请人:中国检验检疫科学研究院