专利名称：一种注射用鹿蹄草素含量测定的方法
技术领域：
本发明涉及药物含量测定的方法，特别是涉及注射用鹿蹄草素含量测定的方法。
背景技术：
注射用鹿蹄草素(又称鹿衔草素、甲基氢醌)是中国农业科学院兰州畜牧与兽药 研究所新兽药工程重点实验室化学合成的抗菌新兽药，药理、毒理实验表明该药具有广谱、 高效、无毒、无残留、不易产生耐药性等特点，对大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌等20 多种革兰氏阳性和革兰氏阴性菌均具有良好的抑杀作用。注射用鹿蹄草素主要用于治疗奶 牛乳腺炎、仔猪水肿病、牛子宫内膜炎、仔猪黄痢和白痢、猪的各种腹泻、雏鸡白痢等。由于鹿蹄草素是一种氢醌类物质，其溶液易氧化变色、含量极不稳定，严重影响了 注射用鹿蹄草素含量RP-HPLC测定的精密性和准确性。研究发现，大部分被测物质贮备液 的稳定性除了受自身结构、溶剂影响外，还跟环境有关，因此除了通过改变溶剂提高被测物 质储备液的稳定性以外，还可以通过加入适当适量的附加物来改变环境，进而提高贮备液 的稳定性。目前关于被测物质贮备液稳定化的研究在国内外尚无报道，本研究在注射用鹿蹄 草素的贮备液中加入了适量的亚硫酸氢钠及依地酸二钠，提高贮备液的稳定性，从而大大 增加RP-HPLC测定的精密性和准确性，延长测定时间。
发明内容
本发明的目的是提供一种的注射用鹿蹄草素含量测定的方法。主要通过在注射用 鹿蹄草素的贮备液中加入适量的亚硫酸氢钠及依地酸二钠，从而使其极不稳定的贮备液变 得稳定，大幅度增加RP-HPLC测定的线性、精密性和准确性，而且使其在测定时间方面的限 制较小。本发明所提供的注射用鹿蹄草素含量测定的具体方法，包括以下步骤(1)、配制流动相，设置色谱条件按甲醇水=15-35 90配制流动相，设置色谱条件为检测波长260-360nm，流 速为0. 8ml/min,进样量为20 μ 1 ；(2)、贮备液的制备①准确称取鹿蹄草素标准品10-34mg、附加物3. 5_18mg，在IOOml容量瓶中用流动 相定容至刻度，即成标准品贮备液，备用；②取批号不同的的注射用鹿蹄草素，配制方法同(1)，制成供试品贮备液，备用；③准确称取对苯二酚70_120mg，在IOOml容量瓶中加流动相溶解、定容至刻度，即 成内标物贮备液，备用；(3)、专属性考察在步骤(1)所述的色谱条件下，对附加物、对苯二酚、鹿蹄草素及三者混合物进行 RP-HPLC分离检测；
(4)、线性关系考察分别精密量取鹿蹄草素标准品贮备液和内标物贮备液，混合后用流动相溶解至刻 度，过滤、进样、检测，以鹿蹄草素和对苯二酚的峰面积比(Y)与鹿蹄草素的质量浓度(X)进 行线性回归；(5)、精密度试验取同一批号的鹿蹄草素供试品贮备液，加内标物贮备液后，过滤进样，按内标法以 峰面积测定鹿蹄草素的含量；(6)、稳定性试验取另一批号的注射用鹿蹄草素样品溶液于室温避光放置0_72h后，分别进样测 定；(7)、样品含量测定将步骤(2)中所述的鹿蹄草素供试品贮备液，加内标物贮备液后，按内标法以峰 面积计算样品中鹿蹄草素的含量。所述的标准品贮备液或供试品贮备液配方中的附加物为亚硫酸氢钠和依地酸二 钠的混合物，其中亚硫酸氢钠3-14mg，依地酸二钠0. 5-4. Omg，样品含量测定结果列于表1。表1样品含量测定结果(η = 3，% ) 本发明具有以下有益效果贮备液变得稳定，操作简便快速，大幅度增加RP-HPLC 测定的线性、精密性和准确性，而且使其在测定时间方面的限制较小。
图1注射用鹿蹄草素的RP-HPLC色谱2注射用鹿蹄草素含量测定的标准曲线图中各序号名称如下A-附加物、B-内标物、C-鹿蹄草素、D-附加物、内标物及鹿蹄草素的混合物；
具体实施例方式现通过下列实施例对本发明做进一步说明实施例1 注射用鹿蹄草素含量测定的具体方法，包括以下步骤(1)、配制流动相，设置色谱条件按甲醇水=20 90配制流动相，实验色谱柱规格为Symmetry C18 (4. 6mmX 150mm, 5 μ m)，设置流速为 0. 8ml/min，进样量20 μ 1，检测波长302nm ；
(2)、贮备液的制备①准确称取鹿蹄草素标准品15mg、亚硫酸氢钠8mg、依地酸二钠1. 5mg,在IOOml容 量瓶中用流动相溶解、定容至刻度，即成标准品贮备液，备用；②取批号分别为070123、070511、071026的注射用鹿蹄草素，配制方法同(1)，制 成供试品贮备液，备用；③准确称取对苯二酚85mg，置于IOOml容量瓶中，加流动相溶解、定容至刻度，即 成内标物贮备液，备用；(3)、专属性考察在步骤(1)所述的色谱条件下，对附加物、对苯二酚、鹿蹄草素及三者混合物进行 RP-HPLC分离检测；(4)、线性关系考察分别精密量取鹿蹄草素标准品贮备液3、4、5、6、7、8ml，分别置于IOml容量瓶中， 各加入Iml内标物贮备液，用流动相溶解至刻度，制成浓度分别为60、80、100、120、140μ g/ ml的溶液，摇勻，0. 45 μ m微孔滤膜过滤，进样20 μ 1，依照步骤(1)所述的色谱条件检测，记 录峰面积。以鹿蹄草素和对苯二酚的峰面积比(Y)与鹿蹄草素的质量浓度(X)进行线性回 归。(5)、精密度试验取批号为070123的鹿蹄草素供试品贮备液，加内标物贮备液后，过滤进样，每份 样品10 μ 1，按内标法以峰面积测定鹿蹄草素的含量；(6)、稳定性试验取批号为070322的溶液样品9份，于室温避光放置0、2、4、6、8、12、24、48、72h后 分别进样测定。(7)、样品含量测定将步骤(2)中所述的鹿蹄草素供试品贮备液，准确量取5ml置IOml容量瓶中，力口 内标物贮备液lml，再加流动相稀释至刻度，摇勻，按内标法以峰面积计算样品中鹿蹄草素 的含量。实施例21. 一种注射用鹿蹄草素含量的测定方法，包括以下步骤(1)、配制流动相，设置色谱条件按甲醇水=15 90配制流动相，实验色谱柱规格为Symmetry C18 (4. 6mmX 150mm, 5 μ m)，设置流速为 0. 8ml/min，进样量20 μ 1，检测波长:302nm ；(2)、贮备液的制备①准确称取鹿蹄草素标准品45mg、亚硫酸氢钠lmg、依地酸二钠0. Img,在IOOml容 量瓶中用流动相溶解并定容至刻度，即成标准品贮备液，备用；②取批号分别为070123、070511、071026的注射用鹿蹄草素，配制方法同(1)，制
成供试品贮备液，备用；③准确称取对苯二酚85mg，置于IOOml容量瓶中，加流动相溶解并定容至刻度，即 成内标物贮备液，备用；(3)、专属性考察
在步骤(1)所述的色谱条件下，对附加物、对苯二酚、鹿蹄草素及三者混合物进行RP-HPLC分离检测；(4)、线性关系考察分别精密量取鹿蹄草素标准品贮备液3、4、5、6、7、8ml，分别置于IOml容量瓶中， 各加入Iml内标物贮备液，用流动相溶解至刻度，制成浓度分别为60、80、100、120、140μ g/ ml的溶液，摇勻，0. 45 μ m微孔滤膜过滤，进样20 μ 1，依照步骤(1)所述的色谱条件检测，记 录峰面积。以鹿蹄草素和对苯二酚的峰面积比(Y)与鹿蹄草素的质量浓度(X)进行线性回 归。(5)、精密度试验取批号为070511的鹿蹄草素供试品贮备液，加内标物贮备液后，过滤进样，每份 样品10 μ 1，按内标法以峰面积测定鹿蹄草素的含量；(6)、稳定性试验取批号为070126的注射用鹿蹄草素样品溶液于室温避光放置0_72h后，分别进样 测定；(7)、样品含量测定将步骤(2)中所述的鹿蹄草素供试品贮备液，准确量取5ml置IOml容量瓶中，力口 内标物贮备液lml，再加流动相稀释至刻度，摇勻，按内标法以峰面积计算样品中鹿蹄草素 的含量。实施例31. 一种注射用鹿蹄草素含量的测定方法，包括以下步骤(1)、配制流动相，设置色谱条件按甲醇水=35 90配制流动相，设置色谱条件为检测波长260-360nm，流速为 0. 8ml/min,进样量为 20 μ 1 ；(2)、贮备液的制备①准确称取鹿蹄草素标准品2mg、亚硫酸氢钠25mg、依地酸二钠6. Omg,置于IOOml 容量瓶中，加50ml流动相溶解并定容至刻度，即成标准品贮备液，备用；②取批号分别为070123、070511、071026的注射用鹿蹄草素，配制方法同(1)，制 成供试品贮备液，备用；③准确称取对苯二酚85mg，置于IOOml容量瓶中，加流动相溶解并定容至刻度，即 成内标物贮备液，备用；(3)、专属性考察在步骤(1)所述的色谱条件下，对附加物、对苯二酚、鹿蹄草素及三者混合物进行 RP-HPLC分离检测；(4)、线性关系考察分别精密量取鹿蹄草素标准品贮备液3、4、5、6、7、8ml，分别置于IOml容量瓶中， 各加入Iml内标物贮备液，用流动相溶解至刻度，制成浓度分别为60、80、100、120、140μ g/ ml的溶液，摇勻，0. 45 μ m微孔滤膜过滤，进样20 μ 1，依照步骤(1)所述的色谱条件检测，记 录峰面积。以鹿蹄草素和对苯二酚的峰面积比(Y)与鹿蹄草素的质量浓度(X)进行线性回 归。
取批号为070511的鹿蹄草素供试品贮备液，加内标物贮备液后，过滤进样，每份 样品10 μ 1，按内标法以峰面积测定鹿蹄草素的含量；(6)、稳定性试验
取批号为070126的注射用鹿蹄草素样品溶液于室温避光放置0_72h后，分别进样 测定；(7)、样品含量测定将步骤(2)中所述的鹿蹄草素供试品贮备液，准确量取5ml置IOml容量瓶中，力口 内标物贮备液lml，再加流动相稀释至刻度，摇勻，按内标法以峰面积计算样品中鹿蹄草素 的含量。
权利要求
一种注射用鹿蹄草素含量的测定方法，其特征在于包括以下步骤(1)、配制流动相，设置色谱条件按甲醇∶水＝15-35∶90配制流动相，设置色谱条件为检测波长260-360nm，流速为0.8ml/min，进样量为20μl；(2)、贮备液的制备①准确称取鹿蹄草素标准品10-34mg、附加物3.5-18mg，在100ml容量瓶中用流动相定容至刻度，即成标准品贮备液，备用；②取批号不同的的注射用鹿蹄草素，配制方法同(1)，制成供试品贮备液，备用；③准确称取对苯二酚70-120mg，在100ml容量瓶中加流动相溶解、定容至刻度，即成内标物贮备液，备用；(3)、专属性考察在步骤(1)所述的色谱条件下，对附加物、对苯二酚、鹿蹄草素及三者混合物进行RP-HPLC分离检测；(4)、线性关系考察分别精密量取鹿蹄草素标准品贮备液和内标物贮备液，混合后用流动相溶解至刻度，过滤、进样、检测，以鹿蹄草素和对苯二酚的峰面积比(Y)与鹿蹄草素的质量浓度(X)进行线性回归；(5)、精密度试验取同一批号的鹿蹄草素供试品贮备液，加内标物贮备液后，过滤进样，按内标法以峰面积测定鹿蹄草素的含量；(6)、稳定性试验取另一批号的注射用鹿蹄草素样品溶液于室温避光放置0-72h后，分别进样测定，每份样品10μl，；(7)、样品含量测定将步骤(2)中所述的鹿蹄草素供试品贮备液，加内标物贮备液后，按内标法以峰面积计算样品中鹿蹄草素的含量。
2.根据权利要求1所述的一种注射用鹿蹄草素含量的测定方法，其特征在于标准品贮 备液或供试品贮备液配方中的附加物为亚硫酸氢钠和依地酸二钠的混合物，其中亚硫酸氢 钠 3-14mg、依地酸二钠 0. 5-4. Omg。
全文摘要
本发明公开了一种注射用鹿蹄草素含量测定的方法，涉及化学药物含量测定领域。该方法包括以下步骤配置流动相、设置色谱条件、配置鹿蹄草素标准品、供试品贮备液、制作鹿蹄草素标准曲线，进样检测含量。其中配制鹿蹄草素标准品、供试品贮备液时加入了附加物亚硫酸氢钠、依地酸二钠，增加贮备液稳定性。本实验所采用的方法不但适用于注射用鹿蹄草素含量测定，而且为在溶液中极不稳定的氢醌类、酚类等药物的RP-HPLC含量测定提供了一种新方法。该方法具有操作简便快速、结果准确可靠、测定时间方面限制较小的优点，同样适用于在溶液中极不稳定的氢醌类、酚类等药物。
文档编号G01N30/02GK101839896SQ200910119068
公开日2010年9月22日 申请日期2009年3月20日 优先权日2009年3月20日
发明者刘宇, 华兰英, 叶得河, 尚若峰, 梁剑平, 王学红, 王曙阳, 郑红星, 郭志廷, 郭文柱 申请人:中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所