以荧光金纳米团簇为探针的尿素测定方法
【专利摘要】本发明公开一种以荧光金纳米团簇为探针的尿素测定方法，其特征是利用脲酶特异性催化尿素生成氨和二氧化碳，新生成的氨能提高体系的pH值，使N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇的荧光发生猝灭，从而表现出荧光发射光谱特征的变化，可以直接用于尿素的含量测定。在0.055~0.55mmol/L范围内F650与尿素浓度呈线性关系，检测限为0.055mmol/L。本发明选择性高，重现性好，能够作为分析方法应用于环境及生命科学体系中尿素的高灵敏测定。
【专利说明】以荧光金纳米团簇为探针的尿素测定方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及以N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇为荧光探针的尿素测定方法，属于分析化学及纳米【技术领域】。
【背景技术】
[0002]尿素是人体蛋白质代谢的终产物，由肝脏产生，经血液运输至肾脏以尿液形式排出。尿素的生成量取决于蛋白质的摄入量、组织蛋白质的分解代谢以及肝功能状况。尿素是临床及生物化学一个重要的目标分析物，它是评价尿毒症毒素水平、肾脏及肝脏细胞功能的重要标志。目前，尿素的测定方法包括:氨电极法、脲酶-波氏法，脲酶-谷氨酸脱氢酶偶联法，脲酶-亮氨酸脱氢酶偶联法等。
[0003]近年来，荧光金属纳米团簇作为一种新型的荧光纳米材料备受关注。金属纳米团簇是指在一定的分子层保护作用下，由几个到几百个金属原子构成的分子级聚集体，其直径一般小于2 nm，接近于电子的费米波长(约0.7 nm)。由于其独特的物理、电学和光学性质，金属纳米团簇在单分子光电、催化、生物成像和传感器等领域显示出广泛的应用前景。在所有的金属纳米团簇材料中，金纳米团簇(gold nanoclusters, AuNCs)因其具有化学性质稳定和生物相容性好等优点，是目前研究最多的一种金属纳米团簇材料。与小分子荧光染料和荧光蛋白相比，AuNCs用作荧光探针具有水溶性好、比表面积大、表面易于修饰、抗光漂白能力强以及荧光性质可调等优点。因此，金纳米团簇有望弥补一些有毒小分子荧光染料的不足，甚至可以取代某些光稳定性差的传统荧光探针。
[0004]本发明以N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇为荧光探针，建立了一种尿素测定的新方法。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种以N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇为荧光探针的尿素测定方法。
[0006]为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案:
本发明所述的以荧光金纳米团簇为探针的尿素测定方法，其特征是利用脲酶特异性催化尿素生成氨和二氧化碳的体系，新生成的氨能提高所述体系的PH值，使N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇的荧光发生猝灭，从而表现出荧光发射光谱特征的变化，能直接用于尿素的含量测定。
[0007]所述金纳米团簇溶液，脲酶溶液和尿素测定液按体积比为4:4:1混合，25° C反应40分钟测定发射光强度值F65tl以判断尿素的浓度。
[0008]所使用的脲酶浓度为10 U/mL。
[0009]所使用的N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇采用N-乙酰-L-半胱氨酸还原氯金酸的方法制备:将浓度为0.02、.18 mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液和浓度为0.Γ0.8 mol/L的氢氧化钠溶液加入到浓度为0.θΓθ.1 g/L的氯金酸溶液中，混匀，置于2(T70° C水浴恒温反应(Γ3.5小时，反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行透析纯化处理，得到N-乙酰-L-半胱氨酸-金纳米团簇荧光材料水溶液。
[0010]所使用的N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇采用N-乙酰-L-半胱氨酸还原氯金酸的方法制备:将0.6 mL浓度为0.5 mol/L的氢氧化钠溶液与0.4 mL浓度为0.02 g/L的氯金酸溶液加入到4 mL浓度为0.08 mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，混匀，置于37° C恒温水浴槽中反应2.5 h，反应液由浅黄色变为无色，反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行纯化处理得到N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇溶液。
[0011]利用N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇在650 nm处的发射光强度值(F65tl)以判断尿素含量，所使用的激发波长为355 nm。
[0012]将金纳米团簇溶液和脲酶溶液混合均匀后，将不同浓度尿素溶液加入到上述混合液中，在25° C的恒温水浴槽中反应后，测定发射光强度值F65tl，在尿素浓度为0.055?0.55mmol/L的范围内F65tl与尿素浓度呈线性关系，检测限为0.055mmol/L。
[0013]本发明所述的以荧光金纳米团簇为探针的尿素测定方法，包括如下步骤:取新鲜人尿液，用pH=6.0的缓冲液稀释，取0.05 mL稀释液加入到由0.2 mL N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇溶液和0.2 mL、浓度为10 U/mL的脲酶溶液组成的混合液中，在25° C的恒温水浴槽中反应40分钟，测定发射光强度值F65tl,通过标准曲线进行定量，获得尿液中的尿素含量。
[0014]所使用的N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇采用N-乙酰-L-半胱氨酸还原氯金酸的方法制备:将0.6 mL浓度为0.5 mol/L的氢氧化钠溶液与0.4 mL浓度为0.02 g/L的氯金酸溶液加入到4 mL浓度为0.08 mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，混匀，置于37° C恒温水浴槽中反应2.5 h，反应液由浅黄色变为无色，反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行纯化处理，纯化后的金纳米团簇溶液放置于4° C冰箱避光保存。
[0015]所述的新鲜人尿液为用pH=6.0的醋酸盐缓冲液稀释200倍后选取的0.05 mL稀释液。
[0016]具体地说，本发明采用的技术方案为:
(一)金纳米团簇荧光材料的制备
以下过程中使用的所有玻璃器皿均经过王水浸泡，并用双蒸水彻底清洗，晾干。金纳米团簇荧光材料的制备方法如下:将0.6 mL浓度为0.5 mol/L的氢氧化钠溶液与0.4 mL浓度为0.02 g/L的氯金酸溶液加入到4 mL浓度为0.08 mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，混匀，置于37° C恒温水浴槽中反应2.5小时，反应液由浅黄色变为无色。反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行纯化处理，纯化后的金纳米团簇溶液放置于4° C冰箱避光保存。
[0017](二)尿素的测定:
0.2毫升步骤(一)制备的金纳米团簇溶液与0.2毫升浓度为10 U/mL的脲酶溶液(pH=6.0)混合均匀后，将0.05毫升(pH=6.0)的样品溶液加入到上述混合液中，在25 ° C的恒温水浴槽中反应40分钟。反应结束后，以355 nm为激发波长，测定在650 nm处的发射光强度值(F65tl),通过标准曲线进行尿素的测定。
[0018]本发明的优点: (I)本发明基于脲酶特异性催化尿素生成氨和二氧化碳，新生成的氨能提高体系的PH值，使N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇的荧光发生猝灭，从而表现出荧光发射光谱特征的变化，可以直接用于尿素的含量检测。
[0019](2)本发明所使用的金纳米团簇直接由N-乙酰-L-半胱氨酸还原氯金酸得到，无需进行进一步的修饰，制备过程简单快速。
[0020](3)本发明对样品的处理要求低，抗干扰性好，尿液仅需适当稀释即可进行测定。
[0021](4)本发明的检测灵敏度高，荧光分光光度计测定的检测限为0.055 mmol/L。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1为金纳米团簇溶液在紫外灯下的外观图。图中:(A)空白对照组；(B)尿素组(尿素浓度为0.88 mmol/L)。
[0023]图2为金纳米团簇溶液的发射光谱图。图中:(A)空白对照组；(B)尿素组(尿素浓度为 0.88 mmol/L)。
[0024]图3为在金纳米团簇溶液中加入脲酶和尿素后，荧光发射光强度随时间的变化图。
[0025]图4为金纳米团簇溶液与脲酶催化反应液(不同浓度尿素)孵育后的荧光发射光谱图。
[0026]图5为金纳米团簇溶液的发射光强度值(F65tl)与尿素浓度之间的关系图。
[0027]图6为金纳米团簇溶液的发射光强度值(F65tl)与尿素浓度之间的线性关系图。
[0028]图7为金纳米团簇溶液与不同有机物作用后的发射光强度(F65tl)图。(黑柱:有机物+脲酶+金簇；白柱:有机物+脲酶+尿素(0.55 mM) +金簇)
图8为金纳米团簇溶液与不同阳离子作用后的发射光强度(F65tl)图。(黑柱:阳离子+脲酶+金簇；白柱:阳离子+脲酶+尿素(0.55 mM) +金簇)
图9为金纳米团簇溶液与不同阴离子作用后的发射光强度(F65tl)图。(黑柱:阴离子+脲酶+金簇；白柱:阴离子+脲酶+尿素(0.55 mM) +金簇)。
【具体实施方式】
[0029]实例1:
金纳米团簇荧光材料的制备过程如下:将0.6 mL浓度为0.5 mol/L的氢氧化钠溶液与0.4 mL浓度为0.02 g/L的氯金酸溶液加入到4 mL浓度为0.08 mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，混匀，置于37° C恒温水浴槽中反应2.5 h。反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行纯化处理。所得到的金纳米团簇溶液可见光下为无色，紫外灯照射下产生强烈的红色荧光。4° C暗处保存，能保持至少一个月的相对稳定。
[0030]实例2:
0.2毫升实例I所制得的金纳米团簇溶液与0.2毫升浓度为10 U/mL的脲酶溶液(pH=6.0)混合均匀后，将0.05毫升(pH=6.0)尿素溶液(0.88 mmol/L)加入到上述混合液中，在25° C的恒温水浴槽中反应40分钟。设置一组无尿素的空白对照。反应结束后，在紫外灯下观察，空白对照组显现红色荧光(图1中的A)，而尿素组的金纳米团簇的红色荧光发生猝灭(图1中的B)。图2为空白对照组和尿素组金纳米团簇溶液的荧光发射光谱图。
[0031]实例3:
0.2毫升实例I所制得的金纳米团簇溶液与0.2毫升浓度为10 U/mL的脲酶溶液(pH=6.0)混合均匀后，将0.05毫升(pH=6.0)含有不同浓度尿素的溶液加入到上述混合液中，在25° C的恒温水浴槽中反应(Γ50分钟。结果表明，金纳米团簇的荧光在40分钟后趋于稳定(见图3)。
[0032]实例4:
0.2毫升实例I所制得的金纳米团簇溶液与0.2毫升浓度为10 U/mL的脲酶溶液(pH=6.0)混合均匀后，将0.05毫升(pH=6.0)含有不同浓度尿素的溶液加入到上述混合液中，在25° C的恒温水浴槽中反应40分钟。由图可知，随着尿素浓度的逐渐增大，金纳米团簇的发射光谱逐渐受到抑制(见图4)，发射光强度值F65tl逐渐减小(见图5)。如图6所示，在尿素浓度为0.055、.55 mmol/L的范围内发射光强度值F65tl与尿素浓度呈线性关系，检测限为 0.05Smmol /I,η
[0033]实例5:
0.2毫升实例I所制得的金纳米团簇溶液与0.2毫升浓度为10 U/mL的脲酶溶液(pH=6.0)混合均匀后，将0.05毫升(pH=6.0)浓度为0.22 mmol/L尿素的溶液加入到上述混合液中，在25° C的恒温水浴槽中反应40分钟，测定发射光强度值F65tlt5重复上述实验12次，得相对标准偏差(RSD)为3.6%，表明本方法重现性良好。
[0034]实例I:
0.2毫升实例I所制得的金纳米团簇溶液与0.2毫升浓度为10 U/mL的脲酶溶液(pH=6.0)混合均匀后，将0.05毫升(pH=6.0)浓度为0.1 mmol/L的不同有机物溶液加入到上述混合液中，在25° C的恒温水浴槽中反应40分钟，测定发射光强度值F65tlt5如图7所示，(Γ20依次为空白、谷胱甘肽、抗坏血酸、牛血清蛋白、ATP、尿酸、葡萄糖、L-精氨酸、L-半胱氨酸、L-甲硫氨酸、L-丝氨酸、L-缬氨酸、L-异亮氨酸、L-组氨酸、L-天冬氨酸、L-苯丙氨酸、L-亮氨酸、L-丙氨酸、L-苏氨酸、L-乳糖、麦芽糖，结果表明本方法抗有机物干扰能力强。
[0035]实例8:
0.2毫升实例I所制得的金纳米团簇溶液与0.2毫升浓度为10 U/mL的脲酶溶液(pH=6.0)混合均匀后，将0.05毫升(pH=6.0)浓度为0.01 mmol/L的不同阳离子加入到上述混合液中，在25° C的恒温水浴槽中反应40分钟，测定发射光强度值F65tlt5如图8所示，0?19 依次为空白，Ni2+、Mg2+、Fe3+、Cd2+、Mn2+、NH:、Cu2+、Ag+、Fe2+、Al3+、Pb2+、Zn2+、Ba2+、Co2+、Hg+、Cr3+、Ca2+、Na+、K+,结果表明本方法抗阳离子干扰能力强。
[0036]实例9:
0.2毫升实例I所制得的金纳米团簇溶液与0.2毫升浓度为10 U/mL的脲酶溶液(pH=6.0)混合均匀后，将0.05毫升(pH=6.0)浓度为0.01 mmol/L的不同阴离子加入到上述混合液中，在25° C的恒温水浴槽中反应40分钟，测定发射光强度值F65tlt5如图8所示，0?18 依次为空白、S2O32' NO2' SO32' F' SCN' S2' H2PO4' Br072\ 13' Br03\ SO42' NO3' S2O82'C104_、Γ、Br'CO广、Ac_，结果表明本方法抗阴离子干扰能力强。
[0037]实例10:
取新鲜人尿液，用pH=6.0的醋酸盐缓冲液稀释200倍，取0.05 mL稀释液加入到由实例I所制得的0.2 mL金纳米团簇溶液和0.2 mL脲酶溶液(浓度为10 U/mL)组成的混合液中，在25° C的恒温水浴槽中反应40分钟，测定发射光强度值F65tlt5通过标准曲线进行定量，获得尿样中的尿素含量。与标准方法测定结果进行比较，结果表明本发明所使用的方法与标准方法无显著性差异(表1)。
[0038]表 I
【权利要求】
1.一种以荧光金纳米团簇为探针的尿素测定方法，其特征是利用脲酶特异性催化尿素生成氨和二氧化碳的体系，新生成的氨能提高所述体系的PH值，使N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇的荧光发生猝灭，从而表现出荧光发射光谱特征的变化，能直接用于尿素的含量测定。
2.根据权利要求1所述的以荧光金纳米团簇为探针的尿素测定方法，其特征是所述金纳米团簇溶液，脲酶溶液和尿素测定液按体积比为4:4:1混合，25° C反应40分钟测定发射光强度值F65tl以判断尿素的浓度。
3.根据权利要求1或2所述的以荧光金纳米团簇为探针的尿素测定方法，其特征是所使用的脲酶浓度为10 U/mL。
4.根据权利要求3所述的以荧光金纳米团簇为探针的尿素测定方法，其特征是所使用的N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇采用N-乙酰-L-半胱氨酸还原氯金酸的方法制备:将浓度为0.02、.18 mo I/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液和浓度为0.Γθ.8 mo I/L的氢氧化钠溶液加入到浓度为0.0f0.1 g/L的氯金酸溶液中，混匀，置于2(T70° C水浴恒温反应(Γ3.5小时，反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行透析纯化处理，得到N-乙酰-L-半胱氨酸-金纳米团簇荧光材料水溶液。
5.根据权利要求4所述的以荧光金纳米团簇为探针的尿素测定方法，其特征是所使用的N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇采用N-乙酰-L-半胱氨酸还原氯金酸的方法制备:将0.6 mL浓度为0.5 mol/L的氢氧化钠溶液与0.4 mL浓度为0.02 g/L的氯金酸溶液加入到4 mL浓度为0.08 mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，混匀，置于37° C恒温水浴槽中反应2.5 h，反应液由浅黄色变为无色，反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行纯化处理得到N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇溶液。
6.根据权利要求4或5所述的以荧光金纳米团簇为探针的尿素测定方法，其特征是利用N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇在650 nm处的发射光强度值(F65tl)以判断尿素含量，所使用的激发波长为355 nm。
7.根据权利要求6所述的以荧光金纳米团簇为探针的尿素测定方法，其特征是将金纳米团簇溶液和脲酶溶液混合均匀后，将不同浓度尿素溶液加入到上述混合液中，在25° C的恒温水浴槽中反应后，测定发射光强度值F65tl，在尿素浓度为0.055、.55mmol/L的范围内F65tl与尿素浓度呈线性关系，检测限为0.055mmol/Lo
8.一种以荧光金纳米团簇为探针的尿素测定方法，包括如下步骤:取新鲜人尿液，用pH=6.0的缓冲液稀释，取0.05 mL稀释液加入到由0.2 mL N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇溶液和0.2 mL、浓度为10 U/mL的脲酶溶液组成的混合液中，在25° C的恒温水浴槽中反应40分钟，测定发射光强度值F65tl，通过标准曲线进行定量，获得尿液中的尿素含量。
9.根据权利要求8所述的以荧光金纳米团簇为探针的尿素测定方法，其特征是所使用的N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇采用N-乙酰-L-半胱氨酸还原氯金酸的方法制备:将0.6 mL浓度为0.5 mol/L的氢氧化钠溶液与0.4 mL浓度为0.02 g/L的氯金酸溶液加入到4 mL浓度为0.08 mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，混匀，置于37° C恒温水浴槽中反应2.5 h，反应液由浅黄色变为无色，反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行纯化处理，纯化后的金纳米团簇溶液放置于4° C冰箱避光保存。
10.根据权利要求8或9所述的以荧光金纳米团簇为探针的尿素测定方法，其特征是所述的新鲜人尿液为用pH=6.0的醋酸盐缓冲液稀释200倍后选取的0.05 mL稀释液。
【文档编号】G01N21/64GK104198454SQ201410468937
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年9月13日 优先权日:2014年9月13日
【发明者】陈伟, 邓豪华, 林逢林, 何少斌, 彭花萍 申请人:福建医科大学