专利名称：：一种检测双烯雌酚的间接竞争法酶联免疫试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明属于酶联免疫和兽药残留检测
技术领域：
，具体而言，本发明涉及一种用于检测双烯雌酚的间接竞争法酶联免疫检测试剂盒。
背景技术：
：双烯雌酚(dienestrol，DE)是一种人工合成的非甾体类雌激素，其化学名为3，4-双(对羟基苯基)-2，4-己二烯，含有酚羟基，是一种弱酸性化合物，主要应用于提高奶牛产奶量和畜禽动物的生长催肥。相对于天然雌激素，人工合成雌激素通常比较稳定，在体内滞留时间长，易在人和动物的脂肪及其他组织中残留，因此，可以通过食物链危害人类健康。具体表现为女性幼儿提前发育，男性儿童乳腺发育成女性化；男性生殖发育异常与病变及女性乳腺癌和子宫内膜异位症发生率上升，同时具有致癌作用。目前，世界上许多国家禁止其应用。现有的双烯雌酚检测方法为色谱法(参见，例如，中国食品卫生杂志，2006，18(5)，第420-422页)，但是这些方法需要有完善的实验室，有经验的技术人员及昂贵的仪器设备，且检测过程繁琐，不适应现场大量样本的筛查。基于抗原抗体免疫反应的免疫学检测技术为小分子残留物的分析检测提供了一个新的途径。基于此原理建立的间接竞争酶联免疫吸附测定技术具有便捷，快速，灵敏等特点。该技术的关键是人工抗原的合成和抗体的制备。
发明内容本发明的目的在于提供一种快速检测双烯雌酚(dienestrol，DE)的酶联免疫试剂本发明所述试剂盒的检测原理为将双烯雌酚抗原吸附于固相载体上，加入样本或双烯雌酚标准品溶液并加入双烯雌酚抗体工作液，待测样品中双烯雌酚和固相载体上包被的双烯雌酚抗原竞争双烯雌酚抗体，再加入酶标记抗抗体进行酶活性的放大作用，显色后终止，测定样品的吸光度值，该值与样品中双烯雌酚的量呈负相关，与标准曲线比较即可得出双烯雌酚浓度范围。本发明提供了一种快速检测双烯雌酚的酶联免疫试剂盒，该试剂盒包括双烯雌酚特异性抗体、双烯雌酚-载体蛋白偶联物和酶标二抗。其中所述双烯雌酚特异性抗体为兔抗双烯雌酚的多克隆抗体，所述多克隆抗体用双烯雌酚与载体蛋白偶联物作为免疫原通过免疫动物(例如兔)制得。所述的载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白(OVA)或匙孔铜兰蛋白(KLH)。所述的双烯雌酚-载体蛋白偶联物采用化学方法偶联得到。所述酶标二抗的标记酶为辣根过氧化物酶，所述酶标二抗可以用商品化的辣根过氧化物酶酶标二抗，也可以通过过碘酸钠法或戊二醛法将辣根过氧化物酶与二抗偶联制得。在本发明的一个优选实施方案中，所述酶标二抗为酶标羊抗兔IgG抗体。用于制备所述酶标板的固相材料，包括但不限于，例如，聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯。载体的形式是微量反应板凹孔。为方便现场检测和大量样本筛查，所述试剂盒还可以进一步包括包被有双烯雌酚抗原的酶标板、双烯雌酚标准溶液、显色剂、浓縮洗涤液、终止液和浓縮样品稀释液。所述的浓縮洗涤液为0.5%吐温-2010倍磷酸盐缓冲液。所述的显色剂由显色剂A液和显色剂B液组成(例如，使用体积比为l:1)，显色剂A液为过氧化氢或过氧化脲，显色剂B液为四甲基联苯胺或邻苯二胺。所述的浓縮样品稀释液为含0.1%吐温-20的io倍磷酸盐缓冲液。另一方面，本发明还提供了一种检测饲料、水产品或食品样品中双烯雌酚含量的方法，包括步骤(l)样品前处理；(2)用本发明所述试剂盒实施检测，向包被有双烯雌酚抗原的酶标板孔中加入标准品或样品溶液，再加入抗双烯雌酚多克隆抗体，孵育后洗涤拍干，加入酶标记二抗，孵育后洗涤拍干，显色、终止，用酶标仪测定吸光度值；(3)分析检测结果。有益效果本发明检测双烯雌酚的试剂盒主要采用间接竞争酶联免疫吸附测定法定性或定量测定样品中双烯雌酚含量；对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单，能同时快速检测大批样品。本发明中，该试剂盒采用高特异性的双烯雌酚多克隆抗体，主要试剂以工作液形式提供，可以减少试剂盒的操作步骤，为使用者节省时间并降低因操作步骤冗繁造成的误差，本发明具有灵敏度高、特异性强、高精确度、高准确度、对仪器设备要求低、试剂保存时间长、自动化程度高、无放射性同位素污染的等优点，可在饲料及动物源性产品检测中发挥重要作用。图l为双烯雌酚抑制曲线。其中横坐标为抑制浓度(ng/ml)，纵坐标为吸光度(OD)，系列1是1yg/ml-l:40000组合，系列2是0.5yg/ml-l:20000组合，系列3是0.25iig/ml-l:10000组合。实施例提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，而决不对本发明的内容和保护范围构成任何限制。实施例1免疫原的合成及免疫血清的制备1.1试剂与仪器双烯雌酚(德国Dr)，琥珀酸酐(Sigma公司)，吡啶(Sigma公司)，EDC(上海共价化学试剂公司)，牛血清白蛋白(BSA)、匙钥孔血蓝蛋白(KLH，Sigma公司)，辣根过4氧化物酶(HRP)(上海楷洋生物技术有限公司)，其它试剂均为分析纯。双光束紫外可见分光光度仪(TU-1909，北京普析通用仪器有限公司)，层析装置(3057型便携式记录仪，重庆川仪四厂；SBS系列数控计滴器，恒流泵，自动部分收集器，层析柱，上海沪西分析仪器厂)，磁力搅拌器(上海东荣丰科学仪器有限公司)，台式离心机(Minispin最大转速13400rpm最大离心力12100rcf，2mlX12)。1.2双烯雌酚人工抗原的合成1.2.1免疫原的合成称取26.6毫克(O.lmmol)双烯雌酚溶于lmlDMSO中，充分搅拌使其完全溶解，加入11.7毫克氯乙酸钠，室温搅拌1小时；称取50毫克KLH，以O.lmol/L的PBS溶解，缓慢滴加DMSO充分搅拌，使其占总溶液的50%，将氯乙酸钠活化的双烯雌酚加入到KLH溶液中，以10M氢氧化钠调溶液pH值至ll，加入EDC0.2-0.3M(约100mg)，搅拌反应过夜，即得双烯雌酚-KLH偶联物。然后，将偶联物过SephadexG-25M凝胶层析纯化，用0.01MpH7.4PBS三倍柱床体积平衡，调节流速至3ml/min，样品浓縮至5ml加入到平衡好的层析柱中层析提纯偶联物，洗脱液用pH7.40.01MPBS。提纯后的免疫原分装后-201:冻存。1.2.2包被抗原的合成称取26.6毫克(O.lmmol)的双烯雌酚溶于lml无水吡啶中，加入10毫克琥珀酸酐，室温下搅拌4小时，W吹干，以一定体积DMSO复溶。称取40毫克卵清蛋白(OVA)，以O.lmol/L的PBS溶解，缓慢滴加DMSO充分搅拌，使其占总溶液的50%，将琥珀酸酐活化的双烯雌酚加入到OVA溶液中，以10M氢氧化钠调溶液pH值至ll，加入EDC0.2-0.3M(约100-150mg)，搅拌反应过夜，即得双烯雌酚-卵清蛋白偶联物(DE-OVA)。然后，将上述DE-OVA过SephadexG-25M凝胶层析纯化，用0.01MpH7.4PBS三倍柱床体积平衡，调节流速至3ml/min，样品浓縮至5ml加入到平衡好的层析柱中层析提纯偶联物，洗脱液用pH7.40.01MPBS。提纯后的包被抗原DE-OVA加等量甘油，分装后-20°〇保存。1.3免疫原及特异性多克隆抗体的制备将1.2.1中制备的双烯雌酚-KLH偶联物用生理盐水稀释成lmg/ml溶液备用。选取5只体重22.5Kg健康雄性新西兰大白兔。将偶联物与等量弗氏完全佐剂通过注射器对抽法混合成油包水的乳浊液，按lmg/Kg体重的量进行首次免疫，采取背部皮下多点注射。每隔两周加强免疫一次，用弗氏不完全佐剂代替弗氏完全佐剂，剂量及方法同首次免疫。从第三次免疫开始，每次免疫后10天，耳缘静脉取血lml，进行抗体效价检测，当抗体效价不再升高时，不加佐剂进行最后一次(第7次)免疫，大腿肌肉注射，7天后颈动脉放血，室温凝固2h后4t:过夜，8000r/min离心IO分钟，除去血块，血清部分用50%饱和硫酸铵溶液沉淀，离心去上清液，沉淀用磷酸盐缓冲液重悬，再用33%饱和硫酸铵溶液沉淀两次，沉淀物用尽可能少的磷酸缓冲液溶解，经透析后用SephadexG-25M层析，即得多克隆抗体。51.4多克隆抗体效价和特异性测定1.4.1间接ELISA检测多克隆抗体效价以10iig/ml的DE-BSA按每孔100y1包被酶标板，4"包被24h，洗涤5次，拍干，每孔加入200iU2X的牛血清白蛋白磷酸盐缓冲液(封闭液)，fC下封闭12h，洗涤3次，拍干。加入不同稀释倍数的多克隆抗体100iU，37t:孵育2h，洗涤三次，立即加入100iU酶标羊抗兔抗体，37t:孵育30min，洗涤三次，加50y1显色剂A液和50y1显色剂B液，室温避光作用15min，加50y1终止液终止反应，酶标仪检测OD值(450nm)。同时设置阴性血清对照孔和平行重复孔。多克隆抗体以1000倍、5000倍、10000倍、50000倍、100000倍、1000000倍稀释。以两倍于阴性血清OD值的多克隆抗体OD值对应的多克隆抗体稀释度为多克隆抗体效价。检测结果见表-1表-1多克隆抗体效价检测结果(平均OD值)血清稀1000'5000IOO聽500001000001000000隨性愈清空白释倍数__—_OD值3.5822,8672,3741J751,3390,389(U370,048从表-l可知，多克隆抗体效价为1000000以上，满足实验要求。1.4.2间接竞争ELISA检测多克隆抗体特异性ELISA操作方法同1.4.1。每孔加入100ii1不同浓度的游离双烯雌酚与包被物竞争随后加入多克隆抗体，得出不同的OD值。根据1.4.1的结果，所用多克隆抗体最佳浓度为l:50000。双烯雌酚系列浓度和试验孔的排列顺序见表-2，同时设置平行重复孔和空白对照孔。以0抑制孔的OD值为最大值B。，其它抑制浓度孔OD值为B，B/B。=50%时对应的双烯雌酚浓度为此抗体的IC5。值。检测结果见表-2表-2多克隆抗体特异性检测结果(OD平均值)仰制浓,度Mg01392781/1L双烯雌酚3.5471,3841.0450.7280.4320.2040-053己烯雌酚i.51S1.5091.4671,4551,4281.4750.06己烷雌酚1.4031.3681.3141.3161.4151.3560.047由表-2数据可知，双烯雌酚多克隆抗体IQ。值在9yg/L左右，其它几个类似物的IQ。值在所试验的浓度范围内未见明显抑制，此范围内，几乎没有交叉反应性，表明本发明制备的多克隆抗体特异性较好。实施例2间接竞争ELISA方法的建立2.1ELISA棋盘法确定包被抗原和多克隆抗体最佳工作浓度将100iig/ml、10iig/ml、1iig/ml、0.5iig/ml、0.25iig/ml、0.125iig/ml系列浓度的DE-OVA按每孔100iU包被酶标板，4t:包被24h，用洗液洗涤4次，在吸水纸上拍干，每孔用200iU封闭液4t:下封闭12h，洗涤3次，在吸水纸上拍干。加入l:5000，i:ioooo，i:20000，i:40000，1:80000，1:100000稀释的多克隆抗体100y1，室温作用lh，洗涤4次，立即加入100iU酶标羊抗兔抗体，室温作用30min，洗涤三次，加50iU显色剂A液和50iU显色剂B液，室温避光作用10min，每孔加入50y1终止液终止反应，酶标仪检测A值(450nm)。同时设置阴性对照孔和平行重复孔，取0D值为1.8左右时对应的包被抗原和多克隆抗体浓度组合做抑制曲线，选取最佳曲线的浓度组合。试验数据列于表-3。表-3<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>取包被浓度分别为1yg/ml，0.5yg/ml，0.25yg/ml对应的多克隆抗体稀释度为i:40000，i:20000，i:ioooo做抑制曲线，抑制浓度分别为oyg/L、lyg/L、3yg/L、9iig/L、27iig/L、81iig/L，得抑制曲线图如附图1。附图1中0.25yg/ml-l:10000为系歹lj1;0.5iig/ml-l:20000为系歹lj2，1yg/ml-l:40000为系歹lj3。结果表明，系列2(即0.5iig/ml-l:20000组合)所得的曲线为最佳曲线。实施例3双烯雌酚间接竞争酶联免疫试剂盒的组建组建检测双烯雌酚的酶联免疫试剂盒，使其包含下述组分(1)包被双烯雌酚抗原的酶标板；(2)抗双烯雌酚多克隆抗体工作液；(3)用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体；(4)双烯雌酚标准品溶液6瓶，浓度分别为0iig/L、1yg/L、3iig/L、9iig/L、27iig/L、81iig/L;(5)底物显色液A液为过氧化脲或过氧化氢，底物显色液B液为四甲基联苯胺或邻苯二胺；(6)浓縮洗涤液为含0.5%吐温20的10倍磷酸盐缓冲液；(7)浓縮样品稀释液为0.1%吐温-20的10倍磷酸盐缓冲液；[ooee](8)终止液为2mol/L的硫酸溶液。实施例4试剂盒精密度试验本实验例为标准可重复性试验。具体操作为从每批实施例2或3中的方法制备的酶标板中，各抽取10个孔，测定9iig/L的标准溶液的吸光度值(OD)，重复3次，计算变异系数CVX。结果表明变异系数范围在4.8-7.6%之间，符合了变异系数小于20%的规定，说明本试剂盒标准品精密度达到了要求。实施例5试剂盒的回收率试验取两个浓度的双烯雌酚标样，对样品进行添加回收试验，每个浓度做4个平行，分别计算回收率。结果表明饲料中的添加回收率为60%-85%。实施例6试剂盒保存期试验试剂盒保存条件为2-8°C，经过6个月的测定，试剂盒的最大吸光度值(零添加)、50%抑制浓度、双烯雌酚添加实际测定值均在正常范围之内。考虑在运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37t:保存条件下放置两周，进行加速老化实验，结果表明该试剂盒各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放入-2(TC冰箱冷冻5天，测定结果表明试剂盒各项指标完全正常。从以上结果可得出试剂盒可以在2-8t:保存12个月以上。实施例7样品中双烯雌酚残留的检测7.1样品前处理准确称取5g鱼肉样品于40ml离心管中。加入20mlDMSO，充分振荡10分钟，4000rpm离心10min，取上清5ml。7.2用试剂盒进行检测向双烯雌酚-OVA偶联物包被的酶标板微孔中加系列标准品或样品溶液100ii1，再加入抗体工作液50iU，室温反应l小时。倒出孔中液体，每孔加入250ii1经10倍稀释了的洗涤液，30秒后倒出孔中液体，如此重复操作共洗板4次，在吸水纸上拍干。每孔加入酶标记羊抗兔抗体100iU，避光室温孵育30min。倒出孔中液体，每孔加入250iU经10倍稀释了的洗涤液，30秒后倒出孔中液体，如此重复操作共洗板4次，在吸水纸上拍干。加入底物显色液A液50iU，B液50iU，轻轻振荡混匀，室温避光显色10min，每孔加入终止液(2mol/L盐酸)50iU，轻轻振荡混匀，用酶标仪测定每孔吸光度值(OD值)。结果分析计算百分吸光度值并绘制标准曲线，相对应每一个样品中双烯雌酚的浓度可以从标准曲线上读出，也可以用回归方程法计算出在样本中双烯雌酚的含量。利用专业电脑软件更便于大量的样本的快速分析。根据酶标板上的样本颜色的深浅与系列浓度标准溶液颜色的比较，可以判断出样本中双烯雌酚的浓度范围。8权利要求一种检测双烯雌酚的酶联免疫试剂盒，其中包括双烯雌酚特异性抗体、双烯雌酚-载体蛋白偶联物和酶标二抗。2.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括包被了双烯雌酚抗原或抗双烯雌酚特异性抗体的酶标板、双烯雌酚标准溶液、底物显色剂、洗涤液、终止液和浓縮样品稀释液。3.根据权利要求1或2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述双烯雌酚特异性抗体为多克隆抗体。4.根据权利要求1或2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述的载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白或钥孔铜兰蛋白(KLH)。5.根据权利要求1或2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述的酶标二抗的酶为辣根过氧化物酶。6.根据权利要求1或2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述的酶标二抗为羊抗兔IgG抗体。7.根据权利要求2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述的洗涤液为含有0.05%-0.5%吐温-20磷酸盐缓冲液。8.根据权利要求2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述的显色剂由显色剂A和显色剂B组成，显色剂A为过氧化氢或过氧化脲，显色剂B为邻苯二胺或四甲基联苯胺。9.根据权利要求2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述的浓縮样品稀释液为含0.1%吐温-20的磷酸盐缓冲液。10.—种检测样品中双烯雌酚含量的方法，包括步骤(1)样品前处理；(2)用权利要求1-9任一所述的试剂盒进行检测，向包被有双烯雌酚抗原的酶标板孔中加入标准品或样品溶液，再加入抗双烯雌酚多克隆抗体，孵育后洗涤拍干，加入酶标记二抗，孵育后洗涤拍干，显色、终上，用酶标仪测定吸光度值；(3)分析检测结果。全文摘要本发明公开了一种检测双烯雌酚的酶联免疫试剂盒。本发明所提供的双烯雌酚的酶联免疫试剂盒包括双烯雌酚特异性抗体、双烯雌酚与载体蛋白的偶联物、酶标二抗。本发明的检测双烯雌酚的酶联免疫试剂盒灵敏、快速、准确，主要用于大批样品的筛查；盒中的主要试剂均以工作液的形式提供，使用方便，具有高特异性、高灵敏性、高精确性、高准确性等特点，可快速检测饲料及畜产品及食品中残留的双烯雌酚。文档编号G01N33/52GK101692086SQ20091017791公开日2010年4月7日申请日期2009年10月19日优先权日2009年10月19日发明者于洪侠,张薇薇,李平,杨曙明,邱静,陈刚申请人:中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所