专利名称：一种微囊化细胞活性的检测方法
技术领域：
本发明涉及细胞活性的检测方法，具体地说是一种通过能荷计算表征微囊化细胞 活性的检测方法。
背景技术：
微囊化细胞培养作为一种大规模细胞培养技术，因其特殊微囊环境能使细胞呈现 三维立体生长而在单克隆抗体生产、细胞移植及细胞扩增等领域具有广泛应用。培养过程中微囊化细胞活性直接影响下游产率和应用效果。目前采用噻唑蓝 (MTT)法对微囊化细胞活性进行检测。该方法是利用胞内线粒体琥珀酸脱氢酶将外源 性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，再用二甲基亚砜 (DMSO)溶解结晶，测定溶液光吸收值作为细胞活性的指标。MTT法作为一种基于低细胞密 度、单层培养体系建立的检测方法，虽然在常规细胞培养中广泛应用，但未考虑微囊特殊环 境中，细胞三维生长模式对MTT进入胞内和甲瓒产物充分溶出造成障碍，对实验结果准确 性产生影响。腺苷酸作为细胞直接能量物质，和细胞生存代谢状态紧密相关，通过检测胞内腺 苷酸种类及含量的变化，可达到对微囊化细胞活性检测的目的。腺苷酸常见提取方法为酸抽提，即在待测物中加入酸性物质沉淀蛋白后，通过反 复离心获取上清中腺苷酸，再用碱中和进行下游检测。但该抽提方法不适用于特殊的微囊 化细胞的培养体系，原因如下1、抽提过程PH变化影响腺苷酸稳定性，造成部分产物分解 而使检测结果低于实际值；2、微囊材料和酸的相互作用，降低提取效率。针对上述问题，本专利设计了一套适用于微胶囊培养体系的腺苷酸抽提方案，发 明了以胞内腺苷酸种类数量变化及能荷变化表征微囊内细胞活性的方法，达到对微囊化细 胞活性检测的目的。
发明内容
本专利设计了一套适用于微胶囊培养体系的腺苷酸抽提方案，发明了以胞内腺苷 酸种类数量变化及能荷变化表征微囊内细胞活性的方法，达到对微囊化细胞活性检测的目 的。为实现上述目的，本发明采用技术方案为将待分析的微囊化细胞样品机械破囊处理后，加入预热的裂解液中孵育裂解蛋白 后，上清液采用高效液相色谱法分离定量腺苷酸，计算能荷，以腺苷酸种类数量变化以及能 荷变化作为评价微囊化细胞活性的指标。具体为1)样品制备A 裂解液45-55mM HEPES(PH7. 0-7.幻，10_80mAU/ml 蛋白酶 k(提取 DNA 用的商 品化蛋白酶)，50-80°C水浴预热。B:收集微囊化培养的贴壁细胞或悬浮细胞，滤除培养液，预冷PBS清洗至洗液无色后滤干液体。采用机械破囊法，将样品转移至注射器中，反复抽吸研磨破囊。显微镜下见 微囊膜全部破损后，加入预热裂解液，30-80°C水浴孵育15-45分钟，5分钟间隔震荡，再将 反应体系转移至30-80°C水浴继续反应15-45分钟，过滤收集上清液；2)腺苷酸分离定量采用高效液相色谱法对提取样品中腺苷酸进行分离含量。测定条件为紫外检测 器，波长 ^Onm，C18 反相柱，流动相为 PH = 7. 0-7. 5、50_200mM 的 K2P04，3_10mM 的 TBABr， 流速0. 5-1. Oml/min。分离定量ATP、ADP、AMP，计算单位细胞产物含量。按照能荷= ([ATP] +0. 5 [ADP]) / ([ATP] + [ADP] + [AMP])计算细胞能荷。其中，能荷< 0. 5表明细胞已经走向凋亡；能荷> 0. 5表明细胞存活，且数值越高 细胞活性越好。本发明与现有技术相比具有以下优点由于本发明所检测的是全细胞裂解液中腺 苷酸的含量，且利用高效液相色谱进行分离定量，可避免由于微囊材料以及不同细胞生长 方式对实验结果的影响，适用于多种材料制备的微囊，包括海藻酸钠、壳聚糖、明胶、聚乳酸 等；检测过程不添加任何有机试剂，具有测定方法稳定、测定结果可靠等优点。本发明适用 于贴壁培养或悬浮培养的动物细胞、植物细胞以及微生物细胞。测定结果能正确反映细胞 的活性，对微囊化细胞的应用研究有指导意义。
图1为本发明实施例1不同培养时间海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠(APA)微囊 化细胞能荷变化曲线，可见随着培养时间延长，微囊中细胞能荷值逐渐降低，能荷低于0.5 时，预示细胞出现凋亡。图2为本发明中抽提方法(NEW)和酸法抽提(PCA)的比较，可见本发明样品损失 小，抽提效率更高。
具体实施例方式实施例1一种通过能荷表征微囊化细胞活性的检测方法1)样品制备A 裂解液50mM HEPES, (PH7. 4)，50mAU/ml 蛋白酶 k，50°C水浴预热。B 收集APA微囊化培养!fepg2细胞，滤除培养液，预冷PBS清洗至洗液无色后滤干 液体。Iml注射器研磨抽打破囊。显微镜下见微囊膜全部破损后，加入预热裂解液，50°C水 浴孵育30分钟，5分钟间隔震荡。将反应体系转移至80°C水浴继续反应15分钟，过滤收集 上清；2)腺苷酸分离定量采用高效液相色谱法对提取样品中腺苷酸进行分离含量。测定条件为紫外检测 器，波长 260nm, C18 反相柱，流动相为 PH = 7. OUOOmm 的 K2P04, 5mm 的 TBABr,流速 0. 8ml/ min。计算单位细胞量各种腺苷酸含量分别是=ATP为13. 88士2. 05nmol/106celU ADP为 5. 91 士 1. 13nmol/106cell、AMP 为 1. 12士0. 36nmol/106cel、能荷为 0. 8士0. 0035。在微囊化细胞培养早期，由于细胞增殖旺盛，代谢活跃，产生大量ATP供应细胞合成；随着培养时间延长，细胞代谢缓慢，能量供给降低，胞内AMP增高，能荷降低，细胞走向 凋亡。采用本方法能准确定量不同培养时期腺苷酸种类数量变化以及能荷变化(见附图 1)，实现对微囊化细胞活性的检测。实施例2一种通过能荷表征微囊化细胞活性的检测方法1)样品制备A 裂解液50mM HEPES, (PH7. 4)，50mAU/ml 蛋白酶 k，50°C水浴预热。B 收集单甲氧基聚乙二醇聚乳酸(PELA)微囊化培养微生物细胞S. cerevisiae, 滤除培养液，预冷PBS清洗至洗液无色后滤干液体加入预热裂解液，50°C水浴孵育30分钟， 5分钟间隔震荡。将反应体系转移至80°C水浴继续反应15分钟，过滤收集上清；2)腺苷酸分离定量采用高效液相色谱法对提取样品中腺苷酸进行分离含量。测定条件为紫外检测 器，波长 260nm, C18 反相柱，流动相为 PH = 7. OUOOmm 的 K2P04, 5mm 的 TBABr,流速 0. 8ml/ min0计算单位细胞量各种腺苷酸含量。比较例1MTT法检测微囊化细胞活性与实施例相同的微囊化!fepg2细胞样品，接种于M孔板，每孔anl，每孔加入5mg/ ml的MTT溶液100μ1，241ι取样，用aiil DMSO溶解结晶，每个时间点3个重复。以570nm为 检测波长，630nm为参比波长，酶标仪测定吸光度。三组平行样测定结果分别为1. 61,1. 58,1. 83，其标准偏差0. 111与实施例1的 比较结果见表1。表 权利要求
1.一种微囊化细胞活性的检测方法，其特征在于将待分析的微囊化细胞样品机械破 囊处理后，加入预热的裂解液中孵育裂解蛋白后，上清液采用高效液相色谱法分离定量腺 苷酸，计算能荷，以腺苷酸种类数量变化以及能荷变化作为评价微囊化细胞活性的指标。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于微囊化样品采用的机械破囊方法是将样 品转移至注射器中，反复抽吸研磨破囊。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于加入的裂解液组成是PH7.0-7.5，45-55mM HEPES，10-80mAU/ml 蛋白酶 k。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于孵育裂解蛋白的条件是30-80°C水浴孵育 15-45分钟，5分钟间隔震荡，再将反应体系转移至30-80°C水浴继续反应15-45分钟，过滤 收集上清液。
5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于采用高效液相色谱法对提取样品中腺苷 酸进行分离，并对其中ATP、ADP、AMP含量定量，测定条件为紫外检测器，波长260nm，C18反 相柱，流动相为 PH = 7. 0-7. 5、50-200mM 的 K2P04，3_10mM 的 TBABr，流速 0. 5-1. Oml/min。
6.按照权利要求1所述的方法，其特征在于能荷的计算方法为 能荷=([ATP] +0. 5 [ADP]) / ([ATP] + [ADP] + [AMP])能荷<0.5表明细胞已经走向凋亡；能荷>0.5表明细胞存活，且数值越高细胞活性越好。
7.按照权利要求1所述的方法，其特征在于包埋在微囊内的细胞可以是贴壁培养或 悬浮培养的动物细胞、植物细胞以及微生物细胞。
8.按照权利要求1所述的方法，其特征在于制备微胶囊的材料包括海藻酸钠、聚乳 酸、明胶或壳聚糖。
全文摘要
本发明涉及一种微囊化细胞活性的检测方法。检测步骤包括样品提取、腺苷酸分离定量，通过能荷计算表征微囊内细胞活性。本发明针对微胶囊这样的特殊体系设计了一套用于微囊内细胞腺苷酸定量的操作方案，能准确定量微囊化细胞腺苷酸含量，克服现有技术存在的提取过程样品损失大，测试不稳定，重复性差等缺陷。测定结果可作为微囊化细胞活性的评价指标。
文档编号G01N30/06GK102053123SQ200910219620
公开日2011年5月11日 申请日期2009年11月4日 优先权日2009年11月4日
发明者于炜婷, 王为, 肖静, 马小军 申请人:中国科学院大连化学物理研究所