人源化抗整联蛋白α9抗体及其应用的制作方法

专利名称：人源化抗整联蛋白α9抗体及其应用的制作方法
人源化抗整联蛋白α9抗体及其应用1.发明领域本发明涉及可免疫特异性地识别人整联蛋白α 9的人源化抗体，并涉及它们在治 疗和诊断各种与整联蛋白α9有关或涉及整联蛋白α9的疾病或病症中的应用，这些病症 或疾病包括癌症、炎症性疾病、自身免疫性疾病等。2.
背景技术：
细胞在一群称作整联蛋白(integrins)的细胞表面受体的介导下粘附于细胞外 基质(下文简称作ECM)。整联蛋白通过形成α和β链的1 1异源二聚体而发挥其功能。 迄今为止，已经鉴定和确认了至少18种α链、8种β链和24种α β异源二聚体。已知每 种整联蛋白识别一种特异的配体。根据整联蛋白的配体特异性或功能将整联蛋白归为多个 亚家族，并将它们分为存在于纤连蛋白、玻连蛋白等内的胶原蛋白受体、层粘连蛋白受体、 识别Arg-Gly-Asp(RGD)序列的RGD受体，和仅存在于白细胞内的白细胞特异受体(Hynes， R. 0.,2002, Integrins !Bidirectional, Allosteric Signaling Machines. Cell 110 673-87 ；Miyasaka,M. ,2000,New edition of Adhesion Molecule Handbook,Shuiunsya)。 α 4和α 9整联蛋白是一个不属于上述任何类型的亚家族的成员，该亚家族称作α 4整联蛋 白亚家方矣(Elise L. Palmer, Curzio Rfiegg, RonaldFerrando, Robert Pytela, Sheppard D.，1993, Sequence and Tissue Distribution ofthe Integrin α 9 Subunit, a Novel Partner of β 1 That Is Widely Distributed inEpithelia and Muscle. The Journal of Cell Biology, 123 1289-97) 0迄今为止ECM被认为仅发挥细胞间的粘合物质(cementing substance)的作用。现在已经清楚，整联蛋白介导的ECM-细胞相互作用显著地参与了细胞 生长、粘附、移动等的调节，并与多种疾病的发生有关，包括癌症的进展、炎症加重等。例如，骨桥蛋白(osteopontin)(下文简称作0ΡΝ)，一种ECM，是一种分泌型酸性磷 酸化糖蛋白，分子量为大约41kDa，该分子的表达被广泛发现于乳汁、尿液、肾小管、破骨细 胞、成骨细胞、巨噬细胞、活化的T细胞、肿瘤组织等。OPN具有粘附序列GRGDS(SEQ ID NO 1)，位于其分子中心；人OPN中的SVVYGLR(SEQ ID NO 2)序列或小鼠OPN中的SLAYGLR(SEQ ID NO 3)序列；及与其非常邻近的一个凝血酶切割位点。OPN通过所述GRGDS(SEQ ID NO 1)序列与RGD整联蛋白结合，或者通过SVVYGLR(SEQ ID NO 2)序列或SLAYGLR (SEQ ID NO: 3)序列与α4(α4β 1)禾口 α9(α9β 1)整联蛋白结合。WO 02/081522公开了通过使用OPN敲除小鼠或针对OPN的中和抗体抑制OPN的功 能对风湿性关节炎或肝炎的治疗效果。而且，该公开文献表明，SVVYGLR(SEQ ID NO 2)序 列通过识别α9和α 4整联蛋白对于炎症性疾病的发病是至关重要的，并且OPN受体在免 疫活性细胞等内表达并与炎症性疾病有关。已经发现，α9和α 4的结合谱的差异在于，α 4 β 1既结合未被凝血酶切割的 OPN(未切割的0ΡΝ)，也结合被凝血酶切割后OPN的N端片段(已切割的0ΡΝ)，而α 9 β 1 仅结合已切割的 OPN(Y. Yokosaki，et al. , (1999) TheJournal of Biological Chemistry, 274 36328-36334 ；P. Μ. Green, et al. , (2001)FEBS Letters, 503 75-79 ；S.Τ.Barry, et al. , (2000)Experimental Cell Research，258 :342_351)。
除了 OPN之外，α 4和α 9整联蛋白有许多共同的配体。已知的配体有纤连蛋白 的EDA域、前肽-血管性血友病因子(prop印tide-von Willebrandfactor，pp-vWF)、组织 转谷氨酰胺酶(tTG)、凝血因子XIII、血管细胞粘附分子-I(VCAM-I)等。此外，纤连蛋白的 CS-I域、MadCAM-I (α 4β 7)等已知是被α 4整联蛋白特异识别的配体。生腱蛋白-C、纤溶 酶等已知是被α9整联蛋白特异识别的配体。整联蛋白亚单位α 9、α 4和β 1的氨基酸序列是公知的。例如，在GenBank中，人 α 9被登记为ΝΜ_002207，小鼠α 9被登记为ΝΜ_133721，人α 4被登记为ΝΜ_000885，小鼠 α 4被登记为ΝΜ_010576，人β 1被登记为Χ07979，小鼠β 1被登记为ΝΜ_010578。还已知 这些整联蛋白的氨基酸序列在物种间高度相似。3.发明概要尽管目前已知有多种治疗癌症、炎症性疾病和自身免疫性疾病的药物，但是人们 仍然希望开发对癌症、炎症性疾病和自身免疫性疾病具有更好的治疗效果的预防和/或抑 制剂等。本发明是部分地基于本发明人的如下发现，即针对整联蛋白α 9的特异性抑制抗 体具有抑癌和抗炎作用。先前，本发明人分离了可免疫特异性地识别人整联蛋白α 9的小鼠单克隆抗体， 它们是由杂交瘤克隆1K11、21C5、24I11、25B6和28S1 (保藏号分别是FERM BP_10510、FERM BP-10511、FERM BP-10512、FERMBP-10513 和!7ERM BP-10832)产生的，并分离了可免疫特 异性地识别小鼠整联蛋白α 9的小鼠单克隆抗体，它们是由杂交瘤克隆18R18D、12C4’ 58、 11L2B 和 55A2C(保藏号分别是 FERM ABP_10195、FERM ABP-IO196、FERM ABP-IO197 和 FERM ABP-10198)产生的。这里，杂交瘤克隆的名称可以和由该克隆产生的单克隆抗体的名称互 换使用。所有这些小鼠抗人α 9整联蛋白抗体均是IgGl同种型。这些单克隆抗体中的一 些可抑制人和/或小鼠整联蛋白α9与整联蛋白α9的配体(例如骨桥蛋白)之间的结 合。因此，这些抗整联蛋白α9抗体可抑制整联蛋白α 9的功能，并对癌症，例如癌细胞的 生长或转移，和炎症性疾病，例如类风湿性关节炎、骨关节炎、肝炎、支气管哮喘、纤维化、糖 尿病、动脉硬化、多发性硬化、肉芽肿、炎性肠病(溃疡性结肠炎和克罗恩氏病)、自身免疫 性疾病等，具有治疗作用。而且，本发明的抗整联蛋白α 9抗体可以用作体内诊断剂，用于检测受试者体内 整联蛋白α 9表达的存在和水平，藉此诊断涉及整联蛋白α 9的疾病或病症。然而，因为这些单克隆抗体是小鼠来源的，由于它们在人体内的免疫原性可能导 致不良作用，这妨碍了它们直接应用于人体的诊断或治疗。为了降低免疫原性，本发明人制 备了一种人源化抗体，它们具备作为所述人源化抗体来源的原始小鼠抗整联蛋白α 9抗体 所展示的生物学活性。因此，本发明提供了一种可免疫特异性地识别人α 9整联蛋白的人源化抗体或其 抗原结合片段，所述抗体包括部分地衍生自非人类来源且部分地衍生自人类来源的抗原结 合区。在一个具体的实施方案中，本发明的人源化抗体或其抗原结合片段包括衍生自非人 类来源(供体)，例如1K11、21C5、24I11、25B6和28S1单克隆抗体，的互补决定区(CDR)，和 衍生自人类来源(受体)的框架区(FR)。在一个实施方案中，所述人源化抗体或其抗原结 合片段可抑制人α9整联蛋白与人α9整联蛋白的配体之间的结合。在一个具体的实施方案中，所述可免疫特异性地识别人α 9整联蛋白的人源化抗体或其抗原结合片段包括(i)重链(H链)，其包括至少一个衍生自人H链可变区(V区) 的H链FR (FRH)，和至少一个H链互补决定区(⑶RH)，所述⑶RH衍生自可免疫特异性地识 别人α 9整联蛋白的非人类抗体的CDRH中的至少一个；或(ii)轻链(L链)，其包括至少一 个衍生自人L链V区的L链FR(FRL)，和至少一个L链互补决定区(⑶RL)，该⑶RL衍生自 可免疫特异性地识别人α 9整联蛋白的非人类抗体的CDRL中的至少一个；或(iii)上面的
(i)和(ii)。例如，所述非人类抗体，作为本发明人源化抗体中的至少一个CDRH和/或至 少一个⑶RL的来源，是由从下组选出的杂交瘤产生的单克隆抗体保藏号FERM BP-10510、 FERM BP-10511、FERMBP-10512、FERM BP-10513 和 FERM BP-10832。在一个优选的具体实施方案中，本发明的人源化抗体或其抗原结合片段包含(i) 至少一个衍生自人FRH的FRH，以及至少一个⑶RH，所述⑶RH包含选自氨基酸序列SEQ ID NO :4、5和6中的氨基酸序列；或(ii)至少一个衍生自人FRL的FRL，以及至少一个⑶RL，所 述⑶RL包含选自氨基酸序列SEQ ID NO :11、12和13中的氨基酸序列；或(iii)同时包含上 面的⑴和(ii)。所述的本发明人源化抗体或其抗原结合片段包含CDRH1、CDRH2和CDRH3， 它们分别包含氨基酸序列SEQ ID NO :4、5和6。或者，所述的本发明人源化抗体或其抗原结 合片段包含⑶RLl、⑶RL2和⑶RL3，它们分别包含氨基酸序列SEQ ID NO :11，12和13。在一 个优选实施方案中，所述的本发明人源化抗体或其抗原结合片段包含CDRHl、CDRH2、CDRH3、 CDRL1、CDRL2和CDRL3，它们分别包含氨基酸序列SEQ ID NO :4、5、6、11、12和13。又或者， 所述的本发明人源化抗体或其抗原结合片段包含从由GenBank登录号No. X65891 (SEQ ID NO 18)编码的人H链可变区衍生的FRH，或从由GenBank登录号No. X72441 (SEQID NO 23) 编码的人κ-L链可变区衍生的FRL。在一个优选实施方案中，本发明人源化抗体的FRH包 含至少一个选自氨基酸序列SEQ ID NO :19、20、21和22(FRH1、FRH2、FRH3和FRH4，分别由 X65891的相应部分编码)中的氨基酸序列。在另一个优选实施方案中，本发明人源化抗体 的FRL包含至少一个选自氨基酸序列SEQ ID NO :24、25、26和27 (FRL1、FRL2、FRL3和FRL4， 分别由X72441的相应部分编码)中的氨基酸序列。在一个最优选的实施方案中，本发明的 人源化抗体或其抗原结合片段包括(i) H链可变区(VH区)，其包含氨基酸序列SEQ ID NO 29;或(ii)L链可变区(VL区)，其包含氨基酸序列SEQ ID NO :31 ；或(iii)上面的⑴和
(ii)。在另一个优选具体实施方案中，本发明的人源化抗体或其抗原结合片段包括(i) 至少一个衍生自人FRH的FRH，以及至少一个⑶RH，所述⑶RH包含选自氨基酸序列SEQ ID NO :32、33和34中的氨基酸序列；或(ii)至少一个衍生自人FRL的FRL，以及至少一个 ⑶RL，所述⑶RL包含选自氨基酸序列SEQ ID NO :37、38和39中的氨基酸序列；或(iii)上 面的(i)和(ii)。所述的本发明人源化抗体或其抗原结合片段可以包括CDRH1、CDRH2和 ⑶RH3，它们分别包含氨基酸序列SEQ ID N0:32、33和34。或者，所述的本发明人源化抗体 或其抗原结合片段包括⑶RL1、⑶RL2和⑶RL3，它们分别包含氨基酸序列SEQ ID NO :37、 38和39。在一个优选实施方案中，所述的本发明人源化抗体或其抗原结合片段包括CDRH1、 CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2 和 CDRL3，它们分别包含氨基酸序列 SEQ ID NO :32、33、34、37、 38 禾口 39。在另一个优选具体实施方案中，本发明的人源化抗体或其抗原结合片段包括(i) 至少一个衍生自人FRH的FRH，以及至少一个⑶RH，所述⑶RH包含选自氨基酸序列SEQID NO :42、43和44中的氨基酸序列；或(ii)至少一个衍生自人FRL的FRL，以及至少一个 ⑶RL，所述⑶RL包含选自氨基酸序列SEQ ID NO :47、48和49中的氨基酸序列；或(iii)上 面的(i)和(ii)。所述的本发明人源化抗体或其抗原结合片段可以包括CDRH1、CDRH2和 ⑶RH3，它们分别包含氨基酸序列SEQ ID NO :42、43和44。或者，所述的本发明人源化抗体 或其抗原结合片段包括⑶RL1、⑶RL2和⑶RL3，它们分别包含氨基酸序列SEQ ID NO :47、 48和49。在一个优选实施方案中，所述的本发明人源化抗体或其抗原结合片段包括CDRH1、 CDRH2, CDRH3, CDRL1、CDRL2 和 CDRL3，它们分别包含氨基酸序列 SEQ ID NO :42、43、44、47、 48 禾P 49。在另一个优选具体实施方案中，本发明的人源化抗体或其抗原结合片段包括(i) 至少一个衍生自人FRH的FRH，以及至少一个⑶RH，所述⑶RH包含选自氨基酸序列SEQ ID NO :52、53和54中的氨基酸序列；或(ii)至少一个衍生自人FRL的FRL，以及至少一个 ⑶RL，所述⑶RL包含选自氨基酸序列SEQ ID NO :57、58和59中的氨基酸序列；或(iii) 上面的(i)和(ii)。所述的本发明人源化抗体或其抗原结合片段可以包括CDRH1、CDRH2 和⑶RH3，它们分别包含氨基酸序列SEQ ID NO :52、53和54。或者，所述的本发明人源化 抗体或其抗原结合片段可以包括⑶RL1、⑶RL2和⑶RL3，它们分别包含氨基酸序列SEQ ID N0:57、58和59。在一个优选实施方案中，所述的本发明人源化抗体或其抗原结合片段包括 CDRHl、CDRH2、CDRH3、CDRLl、CDRL2 和 CDRL3，它们分别包含氨基酸序列 SEQ ID NO :52、53、 54、57、58 和 59。在另一个优选具体实施方案中，本发明的人源化抗体或其抗原结合片段包括(i) 至少一个衍生自人FRH的FRH，以及至少一个⑶RH，所述⑶RH包含选自氨基酸序列SEQ ID NO :62、63和64中的氨基酸序列；或(ii)至少一个衍生自人FRL的FRL，以及至少一个 ⑶RL，所述⑶RL包含选自氨基酸序列SEQ ID NO :67、68和69中的氨基酸序列；或(iii)上 面的(i)和(ii)。所述的本发明人源化抗体或其抗原结合片段可以包括CDRH1、CDRH2和 ⑶RH3，它们分别包含氨基酸序列SEQ ID NO :62、63和64的。或者，所述的本发明人源化抗 体或其抗原结合片段包括⑶RLl、⑶RL2和⑶RL3，它们分别包含氨基酸序列SEQ ID NO :67、 68和69。在一个优选实施方案中，所述的本发明人源化抗体或其抗原结合片段包括CDRH1、 CDRH2、CDRH3，CDRLl、CDRL2 和 CDRL3，它们分别包含氨基酸序列 SEQ ID NO :62、63、64、67、 68 和 69。本发明进一步提供了一种分离的核酸分子，其包含编码可免疫特异性地识别人 α9整联蛋白的本发明人源化抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。具体地，本发明提供 了一种分离的核酸分子，其包含这样的核苷酸序列，该序列编码包含从SEQ ID Ν0:4、5、6、 32、33、34、42、43、44、52、53、54、62、63和64中选出的至少一种氨基酸序列的人源化H链，或 包含从 SEQ ID NO :11、12、13、37、38、39、47、48、49、57、58、59、67、68 和 69 中选出的至少一 种氨基酸序列的人源化L链，或者所述人源化H链和所述人源化L链二者。在一个优选的 具体实施方案中，这样的分离的核酸分子包括编码VH区的核苷酸序列SEQ ID Ν0:28，或编 码氨基酸序列SEQ ID NO :29的核苷酸序列。在另一个优选的具体实施方案中，这样的分离 的核酸分子包括编码VL区的核苷酸序列SEQ ID NO :30，或编码氨基酸序列SEQ ID NO 31 的核苷酸序列。在另外一个优选的具体实施方案中，这种分离的核酸分子同时包括核苷酸 序列SEQ ID Ν0:28和30。在另外一个优选的具体实施方案中，本发明的分离核酸分子进一步包括编码供体来源的信号肽(例如氨基酸序列SEQ ID N0:10和17，分别地)或异种 来源的信号肽的核苷酸序列。本发明进一步提供了一种载体，例如表达载体，其包括编码本发明的可免疫特异 性地识别人α 9整联蛋白的人源化抗体或其抗原结合片段的H链和/或L链的核苷酸序列。 在这样的载体中，本发明的核苷酸序列可与一种或多种调节元件可操作连接。本发明的核 苷酸序列可以包括编码信号肽的核苷酸序列，其中所述信号肽是作为CDR来源的非人类供 体抗体的天然信号肽，或者是异种来源的信号肽。而且，本发明提供了一种宿主细胞，其包含本发明的核酸分子，包括含有本发明核 酸分子的载体。在一个实施方案中，本发明提供了一种分离的宿主细胞，其包括编码本发明 人源化H链的第一核酸分子和编码本发明人源化L链的第二核酸分子，所述第一和第二核 酸分子各自与调节元件可操作连接，使得有生物功能的本发明人源化抗体或其抗原结合片 段得以被表达。因此，本发明进一步提供了一种用于制备本发明人源化抗体的方法，其包括在使 得所述人源化抗体表达的条件下培养本发明的宿主细胞；并收集所产生的人源化抗体。本发明进一步提供了 一种组合物，其包含至少一种本发明的人源化抗体。此外，本 发明提供了一种用于预防或治疗与α9整联蛋白有关的病症或疾病的药物组合物，其包含 至少一种本发明的人源化抗体和可药用的载体。所述任何一种组合物均可进一步包含其它 可以加和性或协同性地改善疾病或病症的活性化合物。这样的活性化合物包括，但不仅限 于，抗炎化合物、化疗化合物，等等，以及抗体或其抗原结合片段，例如能够免疫特异性地结 合人α 4整联蛋白的抗体。在另一个方面中，本发明提供了一种用于预防或治疗与α 9整联蛋白有关或涉及 α 9整联蛋白的疾病或病症的方法，所述方法包括向需要的受试者施用预防或治疗有效量 的至少一种本发明人源化抗体。对于这类应用，本发明的人源化抗体可以和可增强该人源 化抗体生物学效应的治疗性模块偶联。这样的治疗性模块的实例包括另一种抗体，例如抗 α 4抗体(例如形成双特异性抗体)，细胞生长抑制性或细胞杀伤性的细胞毒素，放射性元 素，和/或其它治疗剂，包括抗炎剂、抗生素等。在另外一个方面中，本发明提供了一种用于诊断受试者体内与α 9整联蛋白有关 或涉及α 9整联蛋白的病症或疾病的方法，所述方法包括向待检查的受试者施用诊断有效 量的本发明人源化抗体。对于这类诊断应用，本发明的人源化抗体可以用可检测的标志物， 例如放射性元素，标记。3. 1 定义如这里所使用的，术语“抗体”是指能够免疫特异性地结合期望抗原，例如α 9整 联蛋白，的抗体分子，并且涵盖完整抗体或其片段，包括抗原结合片段。这里使用的术语“免疫特异性地识别”是指抗体或其抗原结合片段特异性地结合 靶多肽或蛋白(尤其是人α9整联蛋白)的能力。这样的抗体不与其它多肽或蛋白非特异 性结合。然而，免疫特异性结合靶多肽或蛋白(例如人α9整联蛋白)的抗体或其抗原结 合片段可能和其它抗原交叉反应。例如，本发明可免疫特异性地识别人α9整联蛋白的人 源化抗体或其抗原结合片段可能与例如鼠α9整联蛋白交叉反应。优选地，可免疫特异性 地结合人α 9整联蛋白的抗体或其抗原结合片段不与其它抗原交叉反应。
这里使用的术语“抗原结合片段”是指抗体的保留有免疫特异性结合靶多肽或蛋 白(特别是人α 9整联蛋白和/或小鼠α 9整联蛋白)的能力的任意片段，包括单链抗体、 Fab片段、F(ab' )2片段、二硫键连接的Fvs，以及含有轻链(VL)可变区和/或重链(VH)可 变区或者甚至互补决定区(CDR)的可以特异性结合靶多肽或蛋白的片段。因此，人源化抗 体的这种抗原结合片段可以包含或者可以不包含部分或全长人类恒定区。各种用于获得上 述抗体片段的方法在本领域是众所周知的。这里使用的术语“衍生自人类来源”或“衍生自非人类来源”是指这样的抗体部分， 其氨基酸序列衍生自人类抗体或非人类抗体的相应部分。这里使用的术语“受体序列”是指来自人类抗体的VH或VL区的框架区的核苷酸 或氨基酸序列，所述框架区充当来自供体抗体(通常是非人类抗体)的CDR的受体。4.附图简述

图1显示了小鼠24111 VH cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO :7)和推导氨基酸序 列(SEQ ID NO :8)。氨基酸残基用单字母编码显示。信号肽序列(SEQID NO=IO)用斜体 标记。成熟VH的N端氨基酸残基(E)用双下划线标记。根据Kabat等(Sequences of Proteins of Immunological Interests, Fifth edition, NIH Publication No. 91-3242, U. S. Department of Health and Human Services, 1991)定义的 CDR 序列用下划线标记。图2显示了小鼠24111 VL cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO 14)和推导的氨基酸序 列(SEQ ID N0:15)。氨基酸残基用单字母编码显示。信号肽序列(SEQ ID N0 17)用斜体 标记。成熟VL的N端氨基酸残基⑶用双下划线标记。根据Kabat等(1991)定义的⑶R 序列用下划线标记。图3显示了两侧有SpeI和HindIII位点(下划线)的设计的24111 VH基因的核 苷酸序列(SEQ ID NO 72)和推导的氨基酸序列(SEQ ID NO :8)。氨基酸残基用单字母编 码显示。信号肽序列(SEQ ID N0 10)用斜体标记。成熟VH的N端氨基酸残基(E)用双下 划线标记。根据Kabat等(1991)定义的⑶R序列用下划线标记。内含子序列用斜体标记。图4显示了两侧有NheI和EcoRI位点(下划线)的设计的24111 VL基因的核苷 酸序列(SEQ ID NO 73)和推导的氨基酸序列(SEQ ID NO :15)。氨基酸残基用单字母编码 显示。信号肽序列(SEQ ID NO 17)用斜体标记。成熟VL的N端氨基酸残基(D)用双下划 线标记。根据Kabat等(1991)定义的⑶R序列用下划线标记。内含子序列用斜体标记。图5显示了 pCh24Ill和pHu24Ill (统称“表达载体”)的结构示意图。从顶部的 SalI位点出发顺时针方向，质粒包含以人类巨细胞病毒(CMV)主立即早期启动子(major immediate early promoter)和增强子(CMV启动子)的重链转录单位，用于起始抗体重链 基因的转录。CMV启动子后面是VH外显子，一段含有人类Yl重链恒定区的基因组序列，其 包括CH1、铰链、CH2和CH3外显子以及间插的内含子，和一个位于CH3后面的、用于mRNA加 工的Y-I基因多聚腺苷酸位点。在重链基因序列之后，轻链转录单位从CMV启动子开始， 随后是VL外显子和一段含有人κ链恒定区外显子(CL)及其前面的部分内含子的基因组 序列，和κ基因的多聚A信号。轻链基因的后面是SV40早期启动子(SV40启动子)、大肠 杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因(gpt)和一个含有SV40多聚腺苷酸位点(SV40 poly(A)位点)的区段。最后，质粒含有质粒pUC19的一部分，包括细菌复制起点(pUC ori) 和β内酰胺酶基因(β内酰胺酶)。
图 6 显示了 24111 VH(SEQ ID NO :9)、人源化 24111 (Hu24Ill) VH(SEQID NO 29) 和人类受体序列 FRHl (SEQ ID NO :19)、FRH2 (SEQ ID NO :20)、FRH3 (SEQ ID NO :21)禾口 FRH4 (SEQ ID NO 22)的氨基酸序列比对，这些序列衍生自由GenBank登录号No. X65891的 核苷酸序列编码的氨基酸序列。氨基酸残基用单字母编码显示。序列上方的数字表示根据 Kabat等(1991)的位置。由Kabat等(1991)定义的⑶R序列用下划线标记。双下划线标 记的残基被预测与⑶R接触，并且在人源化形式中在这些位置上保留小鼠残基。图中省略 了 X65891中的CDR残基。图 7 显示了 24111 VL (SEQ ID NO 16)、人源化 24111 VL (SEQ ID NO 16)和人类 受体序列 FRLl (SEQ ID NO 24), FRL2 (SEQ ID NO 25), FRL3 (SEQID NO 26)禾口 FRL4(SEQ ID NO 27)的氨基酸序列比对，这些序列衍生自由GenBank登录号No. X72441的核苷酸序 列编码的氨基酸序列。氨基酸残基用单字母编码显示。序列上方的数字表示根据Kabat等 (1991)的位置。由Kabat等(1991)定义的CDR序列用下划线标记。双下划线标记的残基 被预测与⑶R接触，并且在人源化形式中在这些位置上保留小鼠残基。图中省略了 X72441 中的⑶R残基。图8显示了用于构建Hu24Ill VH基因的寡核苷酸。图9显示了用于构建Hu24Ill VL基因的寡核苷酸。图10显示了用于构建两侧有SpeI和HindIII位点的Hu24Ill VH基因(SEQ ID N0:74在5’端有5’-GGG尾巴，在3’端有CCC-3’尾巴)的寡核苷酸。箭头指示每条寡核 苷酸的位置和方向(5，到3，)。信号肽(SEQ ID NO 10)和VH区(SEQ ID NO 29)的氨基
酸残基用单字母编码显示。图11显示了用于构建两侧有NheI和EcoRI位点(SEQ ID NO :75在5，端有5，_GGG 尾巴，在3’端有CCC-3’尾巴)的Hu24Ill VL基因的寡核苷酸。箭头指示每条寡核苷酸的 位置和方向(5，到3，)。信号肽(SEQ ID NO 17)和VL区(SEQ ID NO 31)的氨基酸残基
用单字母编码显示。图12显示了两侧有SpeI和HindIII位点(下划线)的Hu24Ill VH基因的核苷 酸序歹Ij (SEQ ID NO 74)，以及信号肽(SEQ ID NO 10 ；斜体显示)和VH区(SEQ ID NO 29) 的推导氨基酸序列。氨基酸残基用单字母编码显示。成熟VH的N端氨基酸残基(Q)用双 下划线标记。根据Kabat等(1991)定义的⑶R序列用下划线标记。内含子序列用斜体标记。图13显示了两侧有NheI和EcoRI位点(下划线)的Hu24Ill VL基因的核苷酸 序歹丨J (SEQ ID NO 75)，以及信号肽(SEQ ID NO 17 ；斜体显示)和VL区(SEQ ID NO 31) 的推导氨基酸序列。氨基酸残基用单字母编码显示。成熟VL的N端氨基酸残基(D)用双 下划线标记。根据Kabat等(1991)定义的⑶R序列用下划线标记。内含子序列用斜体标记。图14显示了嵌合24111抗体和人源化24111抗体与人α 9整联蛋白亲和性之间 的比较。通过细胞ELISA考察了 1和0. Syg/ml的嵌合和人源化24111与CHO/α 9细胞的 结合。实验重复进行三次。图中显示了平均吸光度值和SEM。图15显示了小鼠、嵌合和人源化24111抗体与人α 9整联蛋白结合的FACS分析 结果。测试每种抗体在1，0. 33，0. 11，0. 037和0. 012yg/ml下与CHO/hu α 9细胞的结合。该图中，以几何平均通道荧光值(MCF ；Y轴)在被测的每种抗体浓度(X轴)作图。图16显示了抗人α 9整联蛋白抗体对人α 9/CH0-K1细胞与hOPN(RAA)N_half、生 腱蛋白-C、VCAM-I或人纤连蛋白之间细胞粘附抑制活性的结果。图17显示了在抗人整联蛋白α4抗体的存在下，抗人α9整联蛋白抗体对人黑素 瘤细胞的细胞粘附抑制作用的结果。图18显示了抗整联蛋白α 4抗体和抗α 9整联蛋白抗体对肝炎的治疗效果。在 图中，NHG指示正常仓鼠抗体，NRG指示正常大鼠抗体。图19显示B16-BL6细胞的生长被抗α 9整联蛋白抗体抑制。图20显示了使用抗人α 9整联蛋白抗体对人α 9/CH0-K1细胞(图20a)、人α 4/ CHO-Kl (图20b)和人嗜中性粒细胞(图20c)的FACS分析结果。图21显示了在使用固定的VCAM-I作为ECM时，抗α 9整联蛋白抗体对B16-BL6 细胞生长的抑制。图22显示了抗α 9整联蛋白抗体在小鼠类风湿性关节炎模型中的治疗作用。5.发明详细说明5. 1针对人α 9整联蛋白的抗体的制备可以免疫特异性地识别人α 9整联蛋白或其任何表位的抗体可以通过任何合适 的本领域已知方法来产生。在本发明中用作抗原的α 9整联蛋白可以是⑴衍生自所有表达α 9整联蛋白 的人类细胞或所有存在这些细胞的组织的蛋白质；(2) α 9整联蛋白编码基因DNA(优选地 cDNA)被转染进入细菌、酵母、细胞系包括动物细胞系等并表达而得的重组蛋白质；或(3) 合成蛋白质。α 9整联蛋白包括包含与人α 9整联蛋白(SEQ ID NO :76，其中残基1_29是信号 肽)的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列的多肽。这里，术语“包含基本上相同氨基酸序列的多肽”是指这样的变体多肽，其包含这 样的氨基酸序列，其中有多个氨基酸，优选地1-10个氨基酸，更优选地，1个至数个(例如 1-5)氨基酸被替换、删除和/或修饰，只要这些变异体多肽仍具有与天然存在的人α 9整联 蛋白基本上等价的生物学性质；以及这样的变体多肽，其包含这样的氨基酸序列，其中有多 个氨基酸，优选地1-10个氨基酸，更优选地，1个至数个(例如1-5个)氨基酸被添加到天 然存在的人α9整联蛋白的氨基酸序列。而且，变体多肽可以是具有多个这样的氨基酸替 换、删除、修饰和添加的多肽。作为本发明抗原的人α 9整联蛋白可以通过本领域众所周知的方法加以产生，除 了基因重组技术之外，还可以使用例如化学合成方法、细胞培养方法等，或者它们的修改形 式。用于产生变体多肽的方法实例包括合成寡核苷酸定点突变(缺口双链体法 (gapped duplex method))、涉及通过用亚硝酸盐或亚硫酸盐处理随机引入点突变的点突 变方法、涉及用Bal31酶或其它酶制备删除突变体的方法、盒式诱变、接头扫描法、错误掺 入法(miss incorporation method)、错配引物法、DNA区段合成法等。在本发明中用作抗原的人α 9整联蛋白还包括所述α 9整联蛋白的“部分”。如这 里所使用的，“部分”是指包含与α 9整联蛋白配体(例如0ΡΝ、VCAM-I、生腱蛋白-C等)结合所需区域的部分；具体地说，包含成熟人α 9整联蛋白(SEQ ID NO 76的第30-第1035 个氨基酸残基)第14-第980个氨基酸残基的部分，和包含第11-第981个氨基酸残基的 部分。所述α 9整联蛋白的“部分”可以根据下文所述的本领域已知方法通过基因重组或 化学合成或其修改形式来产生，或者可以通过用蛋白水解酶等适当地消化通过细胞培养方 法分离的人α 9整联蛋白来产生。作为抗原，也可以使用在细胞膜或其膜级分上过表达α9整联蛋白的细胞本身。 过表达人α 9整联蛋白的细胞可以通过本领域众所周知的重组DNA技术加以制备。使用如上所述制备的合适抗原，可以通过本领域众所周知的各种方法制备特异针 对人α9整联蛋白或其任意表位的抗体。可以通过本领域众所周知的各种程序产生针对人 α 9整联蛋白的多克隆抗体。例如，可以将目的抗原施用于多种宿主动物，包括但不限于， 家兔、小鼠、大鼠等，诱导含有抗原特异多克隆抗体的抗血清的产生。可以使用各种佐剂以 提高免疫响应，这取决于宿主物种，包括但不限于，弗氏佐剂(完全或不完全)、矿物凝胶例 如氢氧化铝、表面活性物质例如溶血卵磷脂、普卢兰尼克多元醇类(pluronicpolyols)、聚 阴离子、肽、油乳液、钥孔血蓝蛋白、二硝基苯酚，和潜在可用于人类的佐剂，例如BCG(卡介 苗)和短棒状杆菌(Corynebacteriumparvum)。这些佐剂也是本领域众所周知的。单克隆抗体可以使用本领域已知的多种技术加以制备，包括使用杂交瘤、重组、噬 菌体展示技术或其组合。例如，单克隆抗体可以用杂交瘤技术产生，所述杂交瘤技术包括 本领域己知的禾口例如下列文献中教导的Harlow等，Antibodies :A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor LaboratoryPress,2nd ed.1988) ；Hammerling 等，Monoclonal Antibodies and T-CellHybridomas,pp. 563-681 (Elsevier,N. Y.，1981)(本文通过提述并 入两篇文献的全部内容)。这里使用的术语“单克隆抗体”不仅限于通过杂交瘤技术产生 的抗体。术语“单克隆抗体”是指衍生自单个克隆，包括任何真核、原核或噬菌体克隆，的抗 体，并不指产生它们的方法。用杂交瘤技术产生和筛选特异抗体的方法是常规的并且是本领域众所周知的。在 一个非限制性实例中，可以用感兴趣的抗原或表达这种抗原的细胞对小鼠进行免疫。一旦 检测到免疫响应，例如在小鼠血清中检测到特异针对该抗原的抗体，即收集小鼠的脾脏并 分离脾细胞。然后通过众所周知的技术将脾细胞与任何合适的骨髓瘤细胞(例如P3U1， P3X63-Ag8，P3X63-Ag8-Ul，P3NSl-Ag4，SP2/0-Agl4，P3X63-Ag8-653 等)融合。通过有限稀 释对杂交瘤进行筛选和克隆。然后通过本领域已知的方法对杂交瘤克隆进行测定，检测分 泌能够结合该抗原的抗体的细胞。可以通过用阳性杂交瘤克隆对小鼠进行腹腔接种以产生 腹水，其一般含有高水平的抗体。识别特异表位的抗体片段可以通过已知技术加以产生。例如，Fab和F(ab’)2片 段可以通过用酶，例如木瓜蛋白酶(用于产生Fab片段)或胃蛋白酶(用于产生F(ab’ )2 片段)，对免疫球蛋白分子进行蛋白酶切割加以产生。F(ab’)2片段含有完整的轻链和重链 的可变区、CHl区和铰链区。本发明的抗体或其抗原结合片段还可以通过任何本领域已知的用于合成抗体的 方法来产生，特别是通过化学合成，或者优选地，通过重组表达技术产生。编码抗体的核苷酸序列可以从本领域技术人员能够获得的任何信息来获得(即， 从Genbank、文献或者通过常规克隆和序列分析)。如果含有编码特定抗体或其表位结合片段的核酸的克隆无法获得，但是该抗体分子或其表位结合片段的序列已知，则可以化学合 成编码该免疫球蛋白的核酸，或者通过使用可与序列的5’端杂交的合成引物进行PCR扩 增，从合适的来源[例如抗体cDNA文库，或者从任何表达该抗体的组织或细胞(例如被选 择用于表达抗体的杂交瘤细胞)产生的cDNA文库或从其分离的核酸，优选为poly A+RNA] 获得编码该免疫球蛋白的核酸，或者通过用特定针对特殊基因序列的寡核苷酸探针进行克 隆，从编码该抗体的cDNA文库中鉴定出例如cDNA克隆。PCR产生的扩增核酸随后可通过任 何本领域众所周知的方法克隆到可复制的克隆载体内。5. 2重组抗体的制备—旦确定了抗体的核苷酸序列，就可以用本领域众所周知的核苷酸序列操作 方法对抗体的核苷酸序列进行操作，例如重组DNA技术、定点诱变、PCR等(见例如前文 Sambrook 等中描述的技术；禾口 Ausubel 等编，1998，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & SonS，NY，本文通过提述并入其全部内容)，通过向抗体的表位结合 域区域或任何可能提高或降低抗体生物学活性的抗体部分内引入例如氨基酸替换、删除、 和/或插入，而产生具有不同氨基酸序列的抗体。抗体的重组表达需要构建含有编码该抗体的核苷酸序列的表达载体。一旦获得了 编码抗体分子或抗体的重链或轻链或其一部分的核苷酸序列，就可以通过使用如前面部分 讨论的本领域众所周知的技术通过重组DNA技术产生用于产生抗体分子的载体。本领域技 术人员众所周知的方法可以用于构建含有抗体编码序列和合适转录和翻译控制信号的表 达载体。这些方法包括例如体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。可以将编码重 链可变区、轻链可变区、重链和轻链可变区、重链和/或轻链可变区表位结合片段、或抗体 的一个或多个互补决定区(⑶幻的核苷酸序列克隆到这样的载体内，用于表达。可以使这 样的序列和编码原始抗体的天然信号肽或异源信号肽的多核苷酸融合。然后可以将这样制 备的表达载体引入到合适的宿主细胞内，用于表达该抗体。因此，本发明包括含有编码可免 疫特异性地识别人α 9整联蛋白的人源化抗体或其抗体结合片段的多核苷酸的宿主细胞。可以用本发明的两种表达载体共转染宿主细胞，第一个载体编码衍生自重链的 多肽，第二个载体编码衍生自轻链的多肽。两个载体可以含有相同的选择标记，以便同等 (equal)表达重链和轻链多肽，或含有不同的选择标签，以确保维持这两种质粒。或者，可以 使用编码并且能够表达重链和轻链多肽二者的单个载体。重链和轻链的编码序列可以包含 cDNA或基因组DNA。在另一个实施方案中，抗体还可以用本领域已知的各种噬菌体展示方法来产生。 在噬菌体展示方法中，功能性抗体域被展示在携带有它们的编码多核苷酸序列的噬菌体颗 粒的表面上。在一个特定的实施方案中，这样的噬菌体可用于展示从全套或组合抗体文库 (例如人或鼠)表达的抗原结合域，例如Fab和Fv或二硫键稳定化Fv。对于展示与感兴 趣的抗原结合的抗原结合域的噬菌体，可以用抗原来选择或鉴定它们，例如使用标记抗原 或结合或捕获于固体表面或珠子上的抗原。在这些方法中使用的噬菌体典型地为丝状噬菌 体，包括fd和M13。抗原结合域被表达作为与噬菌体基因III或基因VIII蛋白融合的重 组融合蛋白。可用于制造本发明的免疫球蛋白或其片段的噬菌体展示方法的实例包括在 如下文献中公开的方法Brinkman etal.，J. Immunol. Methods, 182 :41_50，1995 ；Ames et al. , J. Immunol. Methods, 184 177—186,1995 ；Kettleborough et al. , Eur. J. Immunol.,24 952-958,1994 ；Persic et al. , Gene,187 9-18,1997 ；Burton et al. , Advances in Immunology, 57 191-280,1994 ；PCT 申请 No.PCT/GB91/01134 ;PCT 公开 TO 90/02809 ； WO 91/10737 ；WO 92/01047；WO 92/18619 ；WO 93/11236；WO 95/15982 ；WO 95/20401 ；和 美国专禾Ij Nos. 5，698，426 ；5，223，409 ；5，403，484 ；5，580，717 ；5，427，908 ；5，750，753 ； 5，821，047 ；5，571，698 ；5，427，908 ；5，516，637 ；5，780，225 ；5，658，727 ；5，733，743 和 5，969，108，本文通过提述并入上述所有文献的全部内容。如在上述参考文献中介绍的，在噬菌体选择之后，可以从噬菌体分离出抗体编码 区，并用它们产生完整抗体，包括人抗体，或者产生任何其它期望的片段，并在任何期望的 宿主内表达，包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母、细菌，例如将在下文详细介绍 的。例如，也可以采用重组产生Fab，Fab'和F(ab’)2片段的技术，其中可以使用本领域 已知的方法，例如在下列文献中公开的方法PCT公布WO 92/22324 ；Mullinax et al.， BioTechniques, 12(6) :864_869，1992 ；禾口 Sawai et al.，AJRI，34 :26_34，1995 ；禾口 Better et al. , Science，240 :1041-1043，1988(本文通过提述并入上述所有文献的全部内容)。 可以用于产生单链Fvs和抗体的技术的实例包括在下列文献中介绍的技术美国专利 Nos. 4，946，778 禾口 5，258，498 ；Huston et al. ,Methods in Enzymology, 203 46-88,1991 ； Shu et al.，PNAS，90 -.7995-7999,1993 ；和 Skerra et al.，Science，240 1038-1040，1988。一旦通过上述任何方法产生了本发明的抗体分子，就可以用任何本领域已知的用 于纯化免疫球蛋白分子的方法加以纯化，例如通过色谱(例如离子交换色谱、亲和色谱，特 别是经蛋白A或蛋白G纯化后借助针对特定抗原的亲和性，和大小排阻柱色谱)、离心、差异 溶解性、或任何其它用于纯化蛋白的常规技术。进一步，本发明的抗体或其片段可以和本文 所述的或者本领域已知的异源多肽序列相融合以帮助纯化。对于一些应用，包括抗体在人体内的体内使用和体外检测试验，可以优选地使用 嵌合、人源化或人抗体。嵌合抗体和人源化抗体在下文5. 3部分中有详细讨论。在体外免疫测定、纯化方法(例如亲和色谱)以及体内治疗或诊断应用中，可 以使用与其它化合物或异源多肽融合或偶联的抗体。见例如PCT公布WO 93/21232 ； EP 439，095 ；Naramura et al.，Immunol. Lett.，39 :91_99，1994 ；美国专利 5，474，981 ； Gillies et al.，PNAS，89 :1428_1432，1992 ；和Fell et al.，J. Immunol.，146 :2446_2452， 1991，本文通过提述并入它们的全部内容。例如，抗体可以用已知方法或商业可得的试剂盒 以多种方式加以标记(例如生物素标记、FITC标记、APC标记)。作为另一个实例，可以将 抗体和可在体内提高抗体生物学效应的治疗性模块偶联。这些治疗性模块的实例包括另一 种抗体，细胞生长抑制性或细胞杀伤性的细胞毒素，放射性元素，和/或其它治疗剂，包括 抗炎剂、抗生素等。在本发明中，人源化抗人α 9整联蛋白抗体可以和另一种抗体(例如抗 α抗体)偶联(以便例如形成双特异性抗体)。作为另一个实例，本发明的人源化抗体可 以用可检测的标志物(例如放射性元素)加以标记，用于体内诊断用途。5. 3嵌合和人源化抗体嵌合抗体是这样的分子，其中抗体的不同部分来源于不同的动物物种，例如抗 体具有衍生自鼠单克隆抗体的可变区和衍生自人免疫球蛋白的恒定区。用于产生嵌合 抗体的方法是本领域已知的。见例如Morrison，Science，229 :1202，1985 ;0i et al.， BioTechniques,4 214 1986 ；Gillies et al. , J. Immunol. Methods, 125 191-202,1989 ；美国专利Nos. 5，807，715 ；4, 816，567 ；和4，816，397，本文通过提述并入其全部内容。人源化抗体是这样的分子，其结合期望的抗原，并包含如下所述的可变区该可变 区含有一个或多个衍生自非人物种的互补决定区(CDR)和一个或多个衍生自人免疫球蛋 白分子的框架区。典型的非人类抗体人源化方法已经在多种参考文献中有描述，例如Queen et al.，1989，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 10029-10033 和美国专利 Nos. 5，585，089 和 5, 693, 762 ；Riechmann etal. ,Nature, 332 :323,1988 ；禾口 Tsurushita et al. ,Methods 36 69-83，2005，本文通过提述并入上述所有文献的全部内容。例如，Tsurushita等(2005， 前文；下文称作“Tsurushita”)的参考文献提供了一种根据Queen等(1989，前文)最初 开发的抗体-人源化方法改进的用于小鼠单克隆抗体人源化的实际且有指导性的方案。 Tsurushita中公开的通用方案简述如下。5. 3. 1.用于制备人源化抗体的通用方案小鼠V基因克降和测序有多种方法可用于克隆编码目标小鼠单克隆抗体VH和VL区的cDNA。例如，使用 SMART RACE cDNA 扩增试剂盒(BD Biosciences, CA)或 GeneRacer 试剂盒(Invitrogen, CA)的5’RACE(CDNA末端快速扩增)方法已经被普遍使用。根据靶单克隆抗体H链和L链 的同种型可以制备用于5’ RACE的基因特异引物，从而能够结合每条H链和L链可变区的 直接下游。因此，5’ RACE引物可以被设计成对小鼠的每个亚型(例如γ 1，y 2a, γ 2b或 Y3)特异。或者，可以根据亚型间的共有或高度同源区设计用于所有亚型的通用引物。在 Tsurushita中，公开了如下的5’ RACE引物作为举例⑴ 5，-GCCAGTGGATAGACTGATGG- (SEQ ID NO 129)(用于克隆小鼠 Y 1, Y 2a, y 2b 和Y3H链)(ii) 5‘ -GATGGATACAGTTGGTGCAGC- (SEQ ID NO 130)(用于克隆小鼠 κ 轻链)PCR扩增的V基因片段可以被直接克隆到质粒载体内，例如使用ZeroBlimt Τ0Ρ0 PCR克隆试剂盒(Invitrogen)，并确定它们的DNA序列。对所得的序列应当加以确认，例如 通过将其编码的氨基酸序列与目标单克隆抗体的氨基酸序列进行比较，该靶单克隆抗体的 序列通过N端氨基酸测序来确定，例如通过使用Model 241蛋白测序仪(Hewlett-Packard， CA)。典型地，确定目标抗体N端的至少15-20个氨基酸残基，例如通过例如Edman降解，即 足以确认所克隆的DNA序列的真实性。Tsurushita提醒，当N端氨基酸是谷氨酰胺-小鼠 N端氨基酸最常见的两种氨基酸之一-时，它可能已被转换成焦谷氨酸(pyroglutamine)并 可阻断N端测序。在这种情况下，必须将N端去阻断以获得序列。V区的三维建模首先，基于VH 和 VL 区的序列，依照例如 R. Levy et al. , 1989,Biochemistry 28: 7168-7175 和 B. Zilber et al.，1990，Biochemistry29 10032-10041 介绍的方法，鉴定对 于保持⑶R构象结构具有潜在重要性的目标抗体框架残基。典型地，将每一个VH和VL区 分成14个结构上有意义的区段，它们是包含免疫球蛋白超家族域结构的β折叠片和类环 结构。在PDB数据库中，将每个来自目标抗体的区段的氨基酸序列与结构已知的抗体的相 应区段进行比对(见 H. M.Berman et al. ,2000, Nucleic Acids Res. 28 :235_342)。通过 多重序列比对，选择与每个目标区段具有最高序列同源性的相应区段，并构建V区的三维 模型。为了使结构最优化，将模型进行多个循环的共轭梯度能量最小化(例如使用ENCAD，或如 Press et al. , 1990,"Numerical Recipes, Cambridge University Press, Cambridge 所述；AMBER，如 Weiner et al.，1981，J. Comp. Chem. 2 :287_303 所述；3D-JIG-SAW，可在由 Cancer Research UK 运营的 BioMolecularModelling 或"BMM”网站访问；或 SWISS-MODEL， 可在由 Swiss Institute of Bioinformatics,Geneva 运营的 ExPASy Proteomics Server 网站访问)。人框架的诜择与V区结构建模并行地，将分别依据小鼠VH和VL区cDNA克隆推导出的氨基酸 序列与数据库中，例如 Kabat 数据库(见 Johnson et al.，2000，Nucleic Acids Res. 28 214-218.)、GenBank等，的人V区序列进行比较。与小鼠序列具有至少大约65%、至少大约 70%、至少大约80%、至少大约85%、至少大约90%、或者至少大约95%整体同一性的人框 架序列可以使用，例如，Smith-Waterman 算法(Gusf ield，1997，‘‘Algorithms on Strings, Trees, andSequences，，，Cambridge University Press, Cambridge)或 BLAST (Karlin et al. , 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268)等来检索。这些人序列可以以基于 cDNA的序列或者是蛋白质衍生序列为基础；然而，常常优选地使用胚系(germline)，因 为胚系可有助于消除与基于cDNA的或蛋白质衍生的序列中的体细胞高度突变(somatic hypermutations)相关的潜在免疫原性。或者，如Queen等(1989，前文)中介绍的，使用共 有框架序列也能够鉴定和除去从基于cDNA的或蛋白质衍生的序列获得的框架内的这些超 突变残基。在使用胚系VH区段作为受体框架的情况下，应当使用14号染色体，而非15和 16号染色体上编码的VH片段，因为只有14号染色体上的VH片段可产生有功能的VH区。人源化V区的设计根据Queen等(1989，前文)，必须鉴定⑶R的大约4_6人内的框架氨基酸，因为这 些残基被认为是支持正确CDR结构的潜在的关键框架残基。这个过程可以用根据原子坐标 计算原子间距离的计算机程序来实现，或者通过计算机模型进行人工检查来实现，所述计 算机程序例如 RASM0L，其可以在由 National Science Foundation (NSF)支持的 Molecular VisualizationFreeware网站访问。如果关键框架位置处的氨基酸在小鼠供体与人受体序 列之间不同，则通常用小鼠供体的氨基酸代替人类残基。然而，如果这些残基对支持CDR结 构的贡献极小，则通常使用相应的人类残基。另外，如果所选的人类受体含有“非典型”氨 基酸，此类氨基酸在少于大约10-20%的V区序列中出现，则它们可能是在亲和力成熟期间 发生了体细胞高度突变的结果，应当用供体残基代替它们，以避免人体内的潜在免疫原性。此外，为了设计人源化的V区，还需要仔细考虑其它的因素，例如潜在N连接糖基 化信号的残基(详见Tsurushita)。取决于治疗用途所需要获得的或需要消除的效应物功能，人源化抗体可以含有衍 生自人抗体的人κ或λ轻链和/或γ 1、γ 2、γ 3、γ 4、μ、α 1、α 2、δ，或ε重链的人 类恒定区或其一部分，或其变异体。例如，含有突变的恒定区Fc部分可以和本发明嵌合或 人源化抗体的可变区融合，从而减少抗体与Fc受体的结合，和/或减少其修复(fix)补体 的能力(见例如 Winter et al. , GB2, 209, 757 B ；Morrison et al.，WO 89/07142, Morgan et al.，WO 94/29351)。这些抗体分子操作可以借助在5. 2部分介绍的重组DNA技术来实 施。优选地，所得的嵌合或人源化抗体具有与非人类供体抗体相同的特异性，并具有与非人类供体抗体相似的或者至少为其大约1/3、至少大约1/2、或至少大约2/3的亲和力。 在另一方面中，所得的嵌合或人源化抗体的亲和力常数为至少大约IxlO7M-1,优选地至少大 约IxlO8M^并且最优选地至少大约IxlO9MA除了上述的通用方案之外，抗体可以用本领域已知的多种技术进行人源化， 包括例如 CDR 移植(EP 239，400 ；PCT 公布 WO 91/09967 ；美国专利 Nos. 5，225，539 ； 5，530，101 和 5，585，089)，饰面或表面重修(EP 592，106 ；EP519, 596 ；Padlan, Molecular Immunology,28 (4/5) 489-498,1991 ；Studnicka etal., Protein Engineering,7 (6) 805-814,1994 ；Roguska et al. , Proc Natl. Acad. Sci. USA，91 :969_973，1994)，和链改组 (chain shuffling)(美国专利No. 5，565，332)，本文通过提述并入这些文献的全部内容。5. 3. 2用于制备人源化抗体作为药物的其它考虑为了提供用作药物的人源化抗体，需要为其准备一个高效、持续的产生系统。例 如，通过插入H和L链序列来制备用于人源化抗体的合适表达载体，并且可以获得用该表达 载体转染的高产率细胞系作为主细胞库(master cell bank MCB)的种子细胞，其充当工作 细胞库(working cell bank, WCB)的稳定和半永久性来源。然后，可通过培养来自WCB的 工作细胞并收集培养基来制备人源化抗体。多种具有合适调节基因的表达载体均可用于制备这种生产细胞系。作为宿主细 胞，可以使用常用于表达哺乳动物蛋白质的细胞来表达人源化抗体。这些宿主细胞的实例 包括，但不限于，中华仓鼠卵巢(CHO)细胞、SP2/0-Agl4. 19细胞、NSO细胞等。可以通过选 择表达载体与宿主细胞的最佳组合使人源化抗体的生产率最大化。而且，应当探索培养基 的组成，以便从各种无血清培养基和补充物中选择合适的介质，使宿主细胞的人源化抗体 表达得以最优化。根据效率和最终的产率，可以用本领域众所周知的各种方法从培养上清纯化由宿 主细胞产生的人源化抗体，包括亲和色谱、离子交换色谱、疏水互作色谱等。5. 4药物组合物和治疗用途本发明提供了一种药物组合物，其包含如上所述的可免疫特异性地识别人α 9整 联蛋白的人源化抗体或其抗体结合片段。包含本发明人源化抗体作为活性成分的药物组 合物可用作预防和/或治疗与α 9整联蛋白有关的疾病或病症的药剂，所述疾病或病症包 括但不限于，癌症，例如癌细胞的生长和转移，和炎症性疾病，例如类风湿性关节炎、骨关节 炎、肝炎、支气管哮喘、纤维化、糖尿病、癌症转移、动脉硬化、多发性硬化、肉芽肿、炎性肠病 (溃疡性结肠炎和克罗恩氏病)、自身免疫性疾病等。包含本发明人源化抗体的药物组合物还可用于治疗器官移植后的慢性排斥，和 自身免疫性疾病，例如全身性自身免疫性疾病、红斑狼疮、葡萄膜炎、白赛氏病(Behcet’ s disease)、多肌炎、增生性肾小球肾炎、结节病等。包含本发明人源化抗体的用于预防或治疗上述疾病或病症的预防和/或治疗剂， 具有低毒性，通过与合适的溶剂混合直接作为液体制备物，或者作为呈合适剂型的药物组 合物，能够经口或肠胃外施用给人类。用于上述施用的药物组合物含有前述抗体或其盐，以及可药用的载体、稀释剂或 赋形剂。这种组合物以适于口服或胃肠外施用的剂型提供。剂量可以根据待施用的受试者的年龄、体格、目标疾病、状况、施用途径等而改变。当抗体用于预防和/或治疗例如成年患者的类风湿性关节炎时，有利的是通过静脉内施用 本发明抗体，通常为单个剂量大约0. 01-大约20mg/kg体重，优选地大约0. 1-大约10mg/kg 体重，更优选地大约0. 1-大约5mg/kg体重，每天大约1-5次，优选地大约每天1-3次。在 其它胃肠外施用和口服施用中，抗体可以按照相应于上面给定剂量的剂量施用。当状况特 别严重时，剂量可以根据状况而增加。各种输送系统是已知的，并可用于施用本发明的药物组合物，例如包裹在脂质体、 微颗粒、微胶囊内，能够表达突变病毒的重组细胞，受体介导的内吞(见例如Wu and Wu, 1987，J. Biol. Chem. 262 =44294432)。导入的方法包括，但不仅限于，皮内、肌内、腹膜内、静 脉内、皮下、鼻内、硬膜外和经口途径。化合物可以通过任何方便的途径施用，例如通过输注 或推注，通过上皮细胞或黏膜衬里(例如口腔黏膜、直肠和肠粘膜等)吸收，并可以和其它 生物活性剂一起施用。施用可以是全身性的或局部的。也可以采用肺部施用，例如通过使 用吸入器或喷雾器并与气溶胶化剂配方。在一个具体实施方案中，可能希望将本发明的药物组合物局部施用于需要治 疗的区域；这可以通过包括但不限于下述的方法实现手术期间的局部灌注、局部施加 (topical application)，例如与手术后的创口包扎一起进行，通过注射、通过导管、通 过栓剂、通过鼻喷雾、或通过植入体，所述植入体是有孔、无孔或胶状材料，包括膜，例如 sialastic膜，或纤维。在一个实施方案中，施用可以是通过在被感染组织部位(或之前部 位)直接注射。在另一个实施方案中，药物组合物可以用在囊泡，特别是脂质体中投递(见 Langer,1990, Science 249 1527-1533 ；Treat et al. , in Liposomes in theTherapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez Berestein and Fidler(eds. ), Liss, New York, pp. 353-365 (1989) ；Lopez-Berestein,上文，pp. 317-327 ；通见上文)。在另外一个实施方案中，药物组合物可以用控释系统投递。在一个实施方案 中，可以使用泵(见 Langer,前文；Sefton, 1987，CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14 201 ； Buchwald et al.，1980，Surgery 88 507 ；禾口 Saudek et al.，1989，N. Engl. J. Med. 321 574)。在另一个实施方案中，可以使用聚合物材料(见Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds. ), CRC Pres. , Boca Raton, Florida(1974)； Controlled Drug Bioavailability, Drug ProductDesign and Performance, Smo1en and Ball (eds.), Wiley, New York(1984) ；Ranger and Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23 61 (1983) ；seealso Levy et al. , 1985, Science 228:190 ；During et al.，1989，Ann. Neurol. 25 351 ；Howard et al.，1989，J. Neurosurg. 71 105)。在另外一 个实施方案中，可以将控释系统置于组合物的目标的附近，这样就仅需要全身剂量的一部 分(见例如 Goodson, in Medical Applications of Controlled Release,前文，vol. 2, pp. 115-138(1984))。其它的控释系统在 Langer (Science 249 1527-1533 (1990))的综述 中有讨论。用于口服给药的组合物实例包括固体或液体剂型，具体地，药片(包括糖衣和薄 膜包衣的药片)、药丸、颗粒、粉末制备物、胶囊(包括软胶囊)、糖浆、乳剂、悬浮液等。这种 组合物通过公知的方法制造，并包含在药物制备领域中通常使用的载体、稀释剂或赋形剂 中。用于药片的载体或赋形剂实例有乳糖、淀粉、蔗糖、硬脂酸镁等。
可注射的制备物可以包括用于静脉内、皮下、皮内和肌肉内注射、点滴注射等的剂 型。这些可注射制备物可以通过公知的方法制备。可注射制备物可以通过例如将上述抗体 或其盐溶解、悬浮或乳化在常规用于注射的无菌水介质或油介质内加以制备。用于注射的 水介质有例如生理盐水、含有葡萄糖和其它助剂的等渗溶液等，其可以与合适的增溶剂联 合使用，例如醇(例如乙醇)、多元醇(polyalcohol)(例如丙二醇、聚乙二醇)、非离子表面 活性剂[例如聚山梨醇80(polysorbate 80)，HC0-50 (氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50mol)加 合物)]等。作为油介质，可以采用例如芝麻油、大豆油等，它们可以与增溶剂联合使用，例 如苯甲酸苄酯、苯甲醇等。这样制备的注射剂优选地填充在合适的安瓿小瓶内。用于直肠 给药的栓剂可以通过将前述抗体或其盐与常规的栓剂基质混合加以制备。有利地，上述用于经口或胃肠外使用的药物组合物被制备成与活性成分的某个剂 量相符合的单位剂量剂型(dosage forms in a unit dose)。这类单位剂量剂型包括例如 片剂、药丸、胶囊、注射剂(安瓿小瓶)、栓剂等。所含的前述抗体的量一般为每个单位剂量 剂型大约5-500mg ；特别地，在注射剂型中，优选地含有大约5-100mg前述抗体，对于其它剂 型，为大约10-250mg。上述的每种组合物可以进一步包含其它的活性化合物，除非配方会导致与上述抗 体发生任何不良相互作用。本发明还涉及细胞和/或组织重塑的抑制剂和/或促进剂，其包括α 9整联蛋白 结合性功能分子(例如0ΡΝ、VCAM-1、生腱蛋白-C、纤连蛋白、pp-vWF、tTG等)作为活性成 分；并涉及用于抑制和/或促进细胞和/或组织重塑的方法，其包括使表达α9整联蛋白的 细胞和/或组织(例如肿瘤细胞、嗜中性粒细胞、平滑肌等)与α 9整联蛋白结合性功能分 子接触。在这种治疗剂中活性成分的剂量、给药方法、药物制备等可以参考前述包含本发明 的人源化抗体的药物的说明合适地加以确定。如上所述，本发明进一步提供了用于预防或治疗涉及α 9整联蛋白或与α 9整联 蛋白有关的疾病或病症的方法，所述方法包括向需要的受试者施用有效量的至少一种本发 明人源化抗体。5. 5诊断用途包含本发明人源化抗体的药物组合物可以用作如下疾病的诊断剂癌症，例如癌 细胞的生长和转移，和炎症性疾病，例如类风湿性关节炎、骨关节炎、肝炎、支气管哮喘、纤 维化、糖尿病、癌症转移、动脉硬化、多发性硬化、肉芽肿等，或作为下述疾病的诊断剂器官 移植后慢性排斥，自身免疫性疾病，例如全身性自身免疫性疾病、红斑狼疮、葡萄膜炎、白赛 氏病、多肌炎、增生性肾小球肾炎、结节病等。本发明的人源化抗体能够特异识别α 9整联 蛋白，因此能够用于定量试液中的α 9整联蛋白，特别是用于通过夹心式免疫测定、竞争性 测定、免疫测量、浊度滴定法等、免疫染色等等的定量。在本发明的测试方法中应用这些免 疫学方法时，不需要陈述任何特定的条件、程序等。通过在常规条件和程序的基础上加以本 领域的普通技术上的考虑就足以构建测定系统。关于这些一般技术手段的细节，可以参考 综述、教科书等。如上所述，使用本发明的抗体可以高敏感度地定量α 9整联蛋白。本发明的人源 化抗体特别有用于通过应用体内定量α9整联蛋白的方法诊断各种与α9整联蛋白有关的 疾病。例如，当检测到α 9整联蛋白的表达水平增加或降低时，即可诊断某人很可能正患有与α 9整联蛋白有关的疾病，例如癌症或炎症性疾病，或者某人很可能将来会患上这些疾 病。因此，本发明还提供了用于诊断受试者涉及α9整联蛋白或与α9整联蛋白有关的疾 病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的至少一种本发明人源化抗 体或两种均施用。用于这种体内诊断的所需剂量可能少于治疗用途所需的剂量，并可以由 本领域的技术人员根据常规程序加以确定。本发明的人源化抗体还可用于特异性检测试液(例如体液、组织等)中存在的α 9 整联蛋白。所述人源化抗体还可用于制备纯化α 9整联蛋白用的抗体柱、用于在纯化时检 测每一组分中含有的α 9整联蛋白、或用于分析整联蛋白α在测试细胞内的行为。6.实施例下面的实施例举例说明了可免疫特异性识别人和/或小鼠α 9整联蛋白的单克隆 抗体的制备，单克隆抗体可变区的测序，抗体的表位作图和其它表征，这些抗体的嵌合和人 源化，以及所得的嵌合和人源化抗体的表征。这些实施例不应理解为限制性。6. 1针对人α 9整联蛋白的小鼠抗体的制备针对人α 9整联蛋白的小鼠单克隆抗体根据消减免疫法(Williams C. V. ,etal.， 1992，Biotechniques 12:842-847)加以制备。简而言之，三只Balb/c小鼠以4xl06细 胞/小鼠腹腔注射CHO-Kl细胞。随后2天内，对小鼠环磷酰胺腹腔给药，剂量为4mg/小 鼠。环磷酰胺注射后2周时，对小鼠进行腹腔注射表达人α 9整联蛋白的CHO-Kl细胞(人 α 9/CH0-K1细胞)，剂量为2χ106细胞/小鼠。在2周后再用相同的细胞以3χ106细胞/ 小鼠再进行一次腹腔注射。通过本领域众所周知的方法制备杂交瘤(见例如Harlow et al. , Antibodies :A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press,2nd ed. 1988) ；Hammerling, et al. , in :Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, pp. 563-681 (Elsevier,N. Y.，1981)。建立了产生与人α 9/CH0-K1细胞免疫特异性反应，但 不与表达人整联蛋白α 4的CHO Kl细胞反应的单克隆抗体的杂交瘤克隆，并分离了 5个产 生可免疫特异性识别人α 9整联蛋白的单克隆抗体的杂交瘤克隆(即1K11，21C5，24I11， 25B6 和 28S1)。6. 2抗人α 9整联蛋白单克隆抗体的表位分析制备了多个12残基多肽，它们从人α 9整联蛋白的N端及随后每隔3个残基开 始(即氨基酸残基1-12，4-15，7-18，以此类推)，并以5nmol/点将它们藉由C6间隔臂和 2 β Ala残基偶联到纤维素膜上。用封闭缓冲液(牛奶/0.05%Tween20溶于PBS)封闭膜， 并使之与IOml如下所述的溶液在室温下反应3小时，该溶液含有1. O μ g/ml用过氧化物酶 标记的每种抗人0 9整联蛋白单克隆抗体(即分别是11(11，2比5，24111和2586)。用1^^5 清洗后，使膜与增强化学发光(ECL)检测试剂在室温下反应1分钟。测量由于酶反应而发 射的冷光，并根据发光强度确定抗体的表位。作为对照，使用Y9A2(见Wang et al.，1996， Am J Respir Cell Mol Biol 15，664-672)，一种商业可得的针对人α 9整联蛋白的单克隆 抗体。下面的表1显示了表位作图的结果，表明本发明人分离的单克隆抗体具有与Υ9Α2 迥异的表位。表 1 6. 3抗人α 9整联蛋白抗体的⑶R分析单克隆抗体(即IKl 1，21 C5，24I11，25B6和28S1)的CDR氨基酸序列通过将从相 应杂交瘤提取的mRNA逆转录制备cDNA来加以确定。使用这些cDNA作为模板，使用ScFv克 隆弓I物(Light Primer Mix 禾口 Heavy PrimerMix ；Amersham Biosciences Corp. , IL 生产)
6.4 iESmaiMSE(1)因为已知细胞粘附涉及α 9整联蛋白与其配体，即各种ECM，包括0ΡΝ、纤连蛋 白、生腱蛋白-C、VCAM-I等，的结合，所以对分离的抗人α 9整联蛋白抗体的细胞粘附抑制
通过PCR对H链和L链的可变区进行延伸和扩增。将PCR产物克隆到pCRIITOPO载体内，
测序并确定氨基酸序列。每种抗体该过程重复3次。结果如表2所示。
活性进行了检查。简而言之，通过从大肠杆菌宿主细胞分离N端以下至OPN凝血酶切割位点为止的 部分，制备了与谷胱甘肽S转移酶(GST)形成融合蛋白的hOPN(RAA)N-half，其中GRD序 列已被RAA序列替换；并用Precision蛋白酶(Amersham Biosciences)切去GST部分。 VCAM-I从R&D Systems, Inc. (Minneapolis, MN)购买。生腱蛋白-C和人纤连蛋白通过 分别合成含有AEIDGIEL(SEQ ID NO 92)的多肽；生腱蛋白-C的α 9整联蛋白结合区和 CPEDGIHELFP (SEQ ID NO 93)；人纤连蛋白的α 9整联蛋白结合区)，随后将它们附接于牛 血清白蛋白(BSA)上来加以制备。对于人α 9整联蛋白，使用大量表达人α 9整联蛋白的 CHO-KO 细胞(人 α 9/CH0-K1)。将50 微升生腱蛋白-C、纤连蛋白、VCAM-I 或 hOPN(RAA)N-half 以 1. 25-5. 0 μ g/ml 添加到96孔板中，并在37°C温育1小时以包被平板。用封闭液(0. 5% BSA/PBS)封闭平板 后，用PBS清洗一次，然后向平板添加人ci9/CH0-Kl细胞(LOxlO5细胞/ml)并以200 μ 1/ 孔添加溶解于0. 25% BSA-最小基本培养基(MEM)中的分离单克隆抗体(10g/ml)，并在5% 0)2下37°0温育1小时。用PBS洗去未粘附细胞，固定粘附的细胞并用0.5%结晶紫(WAK0， Osaka, Japan)/20%甲醇进行染色。将经染色的细胞在室温下保持30分钟，并向其添加 20%乙酸以使之分散(dissolution)。通过测量590nm波长下的OD对粘附活性进行定量。如图16所示，涉及生腱蛋白-C的细胞粘附被21C5，24I11，25B6和28S1抑制，但不 被IKll抑制。涉及纤连蛋白的细胞粘附被21C5，25B6和28S1抑制，并被24111抑制(程 度低一些)，但不被IKll抑制。涉及VICAM-I的细胞粘附被21C5，24111，25B6和28S1抑 制，但不被IKll抑制。相似地，涉及hOPN(RAA)N-half的细胞粘附被21C5，24111，25B6和 28S1抑制，但不被IKll抑制。(2)因为整联蛋白α 4与α 9整联蛋白具有许多共同的ECM配体，故而预期抗整联 蛋白α 4和抗α 9整联蛋白抗体的共存可提高细胞粘附抑制活性。因此，对两种类型抗体 的组合效果进行体外检验，基于表达整联蛋白α 4和α 9整联蛋白的人黑素瘤细胞(G361) 的细胞粘附考察抗体组合对转移癌的可能抑制效果，以VCAM-I (1. 25 μ g/ml)为ECM，使用 大鼠单克隆抗体P1H4 (Cat. No. MAB 16983Z, Chemicon InternationalInc.，CA)作为抗人整 联蛋白α 4抗体。如图17所示，涉及VCAM-I的粘附不被单独任何一种抗人α 9整联蛋白抗体抑制， 但在抗人整联蛋白α 4抗体的共同存在下，可以被阳性对照(Y9A2)、21C5和24111抑制。由 于表达多种α9整联蛋白分子的细胞通常也表达整联蛋白α 4分子，所以这个结果提示，通 过组合使用抗人α9整联蛋白抗体和抗人整联蛋白α 4抗体，可有效实现对细胞粘附的抑 制，藉此增强对各种病症和疾病，包括涉及这些整联蛋白分子的转移癌，的抑制。6. 5抗人α 9整联蛋白抗体在FACS分析中的应用使用内源表达α 9整联蛋白的人α 9/CH0-K1细胞、CH0-K1细胞和人嗜中性粒细 胞检查抗人α 9整联蛋白抗体是否可用于FACS。在人嗜中性粒细胞中，FACS分析在细胞计 数为LOxlO5的条件进行，且抗体在冰上反应。用50%山羊血清封闭与Fc受体的非特异性 反应。使用FITC标记的抗小鼠IgG抗体作为第二抗体。结果(见图20a，20b和20c)，所 有抗人α 9整联蛋白抗体均可检测到人ci9/CH0-Kl和人嗜中性粒细胞上的α 9整联蛋白。 所有抗体均不与人α 4/CH0-K1细胞反应(见图20a，20b和20c)。这些结果显示，所有的抗人α 9整联蛋白抗体均可用FACS检测在细胞上表达的人α 9整联蛋白。6.6抗α 9整联蛋白抗体的治疗效果在小鼠系统中考察抗α 9整联蛋白的治疗效果。制备了抗小鼠α 9整联蛋白抗体(11L2B，12C4，58，18R18D和55A2C)，方法与制备 小鼠抗人α9整联蛋白抗体的方法(见前文6.1部分)基本上相同，只是仓鼠用表达小鼠 α 9整联蛋白的CHO-Kl细胞(小鼠CI9/CH0-K1细胞)进行免疫，并且选择所得的与小鼠 α 9/ΝΙΗ3Τ3细胞反应但不与小鼠α 4/ΝΙΗ3Τ3细胞反应的单克隆抗体。6.6. 1对肝炎的治疗效果WO 02/081522公开，抑制OPN功能可以治疗肝炎。因此，在小鼠肝炎模型中使用仓 鼠抗小鼠α 9整联蛋白抗体11L2B和大鼠抗小鼠整联蛋白α 4抗体RlI(Pharmingen)对 抗α 9整联蛋白抗体的治疗效果进行了研究。静脉内注射200yg伴刀豆球蛋白A(Con A) (Vector) 12 小时后，用 GPT/ALT-PIII 和 GOT/AST-PIII (Fuji Film)对小鼠血液的 AST 和 ALT水平进行测量。Con A注射前3个小时，施用200 μ g抗体。如图18所示，发现AST和 ALT水平被抗α 9整联蛋白抗体降低，可以见到治疗效果。此外，同时使用抗整联蛋白α4 抗体可以提高治疗效果。这些结果表明，抗α 9整联蛋白抗体可以治疗肝炎。6. 6. 2抗α 9整联蛋白抗体对小鼠癌细胞系牛长的影响鼠黑素瘤细胞系B16-BL6大量表达α 9整联蛋白。因此，对于已建立的抗小鼠α 9 整联蛋白抗体，考察了它们抑制癌细胞生长的活性。在细胞培养用96 孔板(Becton Dickinson)上准备 B16-BL6 细胞，10% FCS/DMEM 中5xl04细胞/mL。添加10yg/ml抗小鼠α 9整联蛋白抗体和抗小鼠整联蛋白α 4抗体之 后，向每个孔添加100 μ L细胞-抗体悬浮液。在5% C02下37°C温育24小时，并添加每孔 10 μ L Cell Counting Kit 8 (Do jinKagaku Kenkyu-sho)，随后在 5% C02 下 37°C温育 1 小 时。测量O.D. 450吸光值，并对细胞计数进行定量分析。如图19所示，12C4' 58给出最高 的抑制活性，对B16-BL6细胞生长的抑制为大约35%。55A2C和R1-2均可抑制生长达大约 20%。接下来，为了在接近体内条件下分析对细胞生长的抑制效果，将VCAM-I固定在 固相上，并类似地进行测定。VCAM-I是α 9整联蛋白的配体；使用了一种重组可溶形式的 VCAM-I蛋白rhVCAM-l-Fc嵌合体(Roche)。使用10 μ g/mL的固定在固相上的rhVCAM_l_Fc 嵌合体，用0.5%BSA/PBS封闭非特异性反应。在抗体单独使用时，嵌合体的添加浓度为 10yg/ml，在共同使用抗体时，添加浓度为各5yg/ml。之后，遵循与图19相同的程序。结 果，单独施用12C4' 58和单独使用α 4抑制抗体克隆Rl_2根本未获得效果或者仅获得微 弱的效果，而在同时施用12C4' 58和R1-2时，细胞生长抑制效果显示了大约20%的显著 增加，如图21所示。6. 6. 3抗α 9整联蛋白抗体在小鼠类风湿性关节炎模型中的治疗效果用仓鼠抗小鼠α 9整联蛋白抗体(55A2C)或正常仓鼠IgG(NHG)以400 μ g/小鼠 腹腔内注射7周龄雌性小鼠(Balb/c)(每组3只)。24小时后，以2mg/小鼠静脉内注射 II型胶原特异性单克隆抗体关节炎诱导鸡尾酒(Chondrexlnc.)。72小时后，腹腔内注射 400 μ g/小鼠的55A2C或NHG以及50 μ g/小鼠的LPS。从LPS注射前3天到LPS注射后6 天对小鼠进行观察，根据 Wood等人(1969，Int. Arch. Allergy App 1. Immunol. 35 456)的方
24法对关节炎水平进行打分。结果如图22所示。注射对照NHG的小鼠具有高分值，并发生了 类风湿性关节炎，而在注射了抗小鼠α 9整联蛋白抗体的小鼠体内，类风湿性关节炎的发 生被完全阻断。因此，表明抗α9整联蛋白抗体对类风湿性关节炎具有预防和治疗效果。6.7非人抗体的人源化6.7.1小鼠24111 V基因的克隆和测序小鼠24111杂交瘤细胞在含有10%胎牛血清(FBS ;HyClone，Logan，UT)的 TIL 培养基 I (Immuno-Biological Laboratories, Gunma, Japan)中在 7· 5 % C02 培养箱 内37°C生长。使用TRIzoI试剂(Invitrogen，Carlsbad, CA)按照供应商的方案从大约 3xl06个杂交瘤细胞提取总RNA。使用GeneRacer试剂盒(Invitrogen)按照供应商的规 程合成以寡dT为引物的cDNA。通过聚合酶链式反应(PCR)扩增24111重链和轻链的可 变区 cDNA，其中使用 PhusionDNA 聚合酶(New England Biolabs, Beverly, ΜΑ)、分别对小 鼠Yl-和κ链恒定区退火的引物、以及GeneRacer试剂盒提供的GeneRacer 5'引物 (5，-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-) (SEQ ID NO :94)。对于重链可变区(VH)的 PCR 扩增，引 物序列为 5' -GCCAGTGGATAGACAGATGG-(SEQ IDNO 95)。对于轻链可变区(VL)的 PCR扩增， 引物序列为 5' -GATGGATACAGTTGGTGCAGC- (SEQ ID NO 96)。将扩增的 VH 和 VLcDNA 亚克 隆到 pCR4Blunt-T0P0 载体(Invitrogen)内，用于确定序列。在 Tocore (Menlo Park, CA) 进行可变区DNA测序。对多条重链和轻链克隆测序，鉴定了与典型小鼠重链和轻链可变区 同源的独特序列。图1和2分别显示了共有cDNA序列以及推导的氨基酸序列。6. 7. 2 嵌合 24IllIgGl/K 抗体的构津通过PCR生成了呈包括剪接供体信号和合适的侧翼限制酶位点的外显子形式的 编码 24111 VH 的基因，所述 PCR 用 24111 VH cDNA 作为模板，5，-GGGACTAGTACCACCATGAAA TGCAGCTGGGTTATCTTC- (SEQ IDNO 97) (SpeI 位点用下划线标记)作为 5’ 引物，5，-GGGAAGC TTAGAGGCCATTCTTACCTGAGGAGACGGTGACTGAGGTTCC-(SEQ ID NO 98) (HindIII位点用下划线 标记)作为3’引物(图3)。相似地，通过PCR生成了呈包括剪接供体信号和合适侧翼限制 酶位点的外显子形式的编码24111 VL的基因，PCR以24111 VL cDNA为模板，5’ -GGGGCTAGC ACCACCATGAGTGTGCCCACTCAACTCCTG-(SEQ IDNO 99) (NheI 位点用下划线标记)为 5，引物， 5’-GGGGAATTCTGAGAAGACTACTTACGTTTTATTTCCAGCTTGGTCCCCCC-(SEQ ID NO: 100) (EcoRHi 点用下划线标记)为3’引物(图4)。24111 VH和VL外显子的剪接供体信号分别衍生自小 鼠胚系JH4和J κ 2序列。PCR扩增片段用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen，Valencia, CA)进行凝胶纯化，用SpeI和HindIII (用于VH)或NheI和EcoRI (用于VL)消化，并克隆 到带有人Y-I和κ恒定区的哺乳动物表达载体内，用于产生嵌合24111 IgGl/κ抗体。图 5显示了所得的表达载体pCh24Ill的结构示意图。6. 7. 3人源化24111基因的产生24111 可变区的人源化按照 Queen 等(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10029-10033,1989)概述的方法进行。首先，在计算机程序的帮助下构建24111可变区的分 子模型。接着，基于面向人可变区序列的同源性搜索，选择了由GenBank登录号No. X65891 核苷酸序列编码的人氨基酸序列作为受体来提供人源化24111 VH的框架，其中X65891与 24111 VH具有高度同源性[FRH中的氨基酸同一性为74.2% (63/87)]。相似地，选择由 GenBank登录号No. X72441[FRH中的氨基酸同一性为77. 5% (62/80)]的核苷酸序列编码的人氨基酸序列作为受体，用于人源化24111 VL0在计算机模型提示与互补决定区(OTR)有显著接触的框架位置上，用来自24111 可变区的氨基酸代替人框架氨基酸。这在位置27、28、29、30、48、66、67和71上进行(根据 Kabat 编石马系统；见Kabat et al. , Sequences ofProteins of Immunological Interests, Fifth edition, NIH Publication No. 91-3242, U. S. Department of Health and Human Services, 1991)，从而产生人源化24111 (Hu24Ill) VH(图6)。对于轻链，在残基70和71进 行替换，以产生人源化24111 (Hu24111) VL (图7)。图6和图7分别显示了 VH和VL的24111、 设计的HU24I11和人受体氨基酸序列的比对结果。将编码每一个HU24I11 VH和VL的基因设计为这样的外显子，其包含信号肽、剪 接供体信号、和用于后续克隆到哺乳动物表达载体内的合适的限制酶位点。Hu24Ill VH和 VL外显子的剪接供体信号分别来自人胚系JH4和Jk 1序列。Hu24Ill VH和VL外显子内 的信号肽序列分别衍生自相应的小鼠Hu24111 VH和VL序列。使用ThermalAce DNA聚合 酶(Invitrogen)，通过多个重叠合成寡核苷酸引物的延伸和PCR扩增，构建了 Hu24Ill VH 和VL基因，如He等(J. Immunol. 160 1029-1035，1998)所概述的那样。图8和9分别列 举了用于构建Hu24Ill VH和VL基因的寡核苷酸。图10和11分别显示了所述寡核苷酸在 Hu24Ill VH和VL基因内的位置。用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)对PCR扩增片段 进行凝胶提纯，并克隆到pCR4Blunt-T0P0载体内，用于确定序列。用SpeI和HindIII (用 于VH)或NheI和EcoRI (用于VL)消化后，将Hu24Ill VH和VL基因亚克隆到哺乳动物表 达载体内的相应位点，用于产生人IgGl/κ形式。图5显示了所得的表达载体pHu24Ill的 示意结构。图12和13分别显示了所得的Hu24Ill VH和VL基因的核苷酸序列和推导的氨 基酸序列。6.7.4嵌合和人源化24111 IgGl/κ的瞬时表达根据Durocher等(Nuc 1. Acids Res. 30 :e9，2002)的方法利用聚乙烯亚胺分别将 pCh24111和pHu24111质粒DNA转染到HEK293细胞内，对嵌合和人源化的24111 IgGl/ κ抗 体进行瞬时表达。将经瞬时转染的ΗΕΚ293细胞在含有10% FBS的DMEM内在7. 5% C02培 养箱内37°C保持4天。通过夹心式ELISA测量培养上清中每种Ch24Ill和Hu24Ill IgGl/ κ抗体的表达水平。取块ELISA板，加入100 μ 1/孔在PBS中以1/2，000稀释过的山羊抗 人IgG Fcy链特异多克隆抗体(SouthernBiotech，Birmingham，AL)在4°C过夜进行包被， 用清洗缓冲液(含有0. 05% Tween 20的PBS)清洗，并用300 μ 1/孔封闭缓冲液(含有2% 脱脂牛奶和0. 05% Tween 20的PBS)在室温下封闭1小时。用清洗缓冲液清洗后，向ELISA 板添加100 μ 1/孔的适当溶解于ELISA缓冲液(含有脱脂牛奶和0. 025% Tween 20的 PBS)中的样品。使用从人骨髓瘤血清纯化的人IgGl/κ抗体(SouthernBiotech)作为标 准。在室温下温育ELISA板2小时并用清洗缓冲液清洗之后，用100 μ 1/孔的1/2，000稀 释的辣根过氧化物酶(HRP)偶联的山羊抗人κ链多克隆抗体(SouthernBiotech)检测结 合的抗体。在室温下温育1小时并用清洗缓冲液清洗之后，通过添加100 μ 1/孔ABTS底物 (bioWORLD，Dublin，0Η)进行显色。通过添加100 μ 1/孔的2%草酸终止显色。读取405nm 吸光度。6. 7. 5人源化24111的表征通过细胞ELISA考察嵌合和人源化24111抗体与人α9整联蛋白的结合。将在表面上表达重组人α 9整联蛋白的CHO-Kl稳定转染体(CHO/hu α 9 ；由Gene Techno Science提供)以2xl05个细胞/孔接种在96孔组织培养板的50 μ 1含有10% FBS的F12/ DMEM(HyClone)内，并使其在7. 5% CO2培养箱内37°C过夜生长。为了检测与人α9整联 蛋白的结合，向每个孔添加50 μ 1溶于含有10% FBS的F12/DMEM中的嵌合24111、人源化 24111或无关人IgGl/κ骨髓瘤抗体(SouthernBiotech)。在4°C温育1小时并用冰冷PBS 清洗细胞两次后，向每个孔添加100 μ 1/孔1/1，000稀释的HRP偶联山羊抗人IgG多克隆 抗体(SouthernBiotech)。在4°C温育1小时后，用冰冷PBS清洗细胞三次。为了显色，添 加100 μ 1 ABTS底物。通过添加100 μ 1 2%草酸终止显色。读取405nm吸光度。结果显 示，在0. 5和1 μ g/ml下，嵌合24111抗体与人α 9整联蛋白的结合与人源化24111抗体几 乎相同(图14)。还利用CHO/hu α 9细胞进行FACS结合测定检查了小鼠、嵌合和人源化24111单克 隆抗体的抗原结合。纯化的小鼠24111单克隆抗体由Gene TechnoSciences提供。每次试 验大约8xl05个CHO/hu α 9细胞，用FACS结合缓冲液(含有0. 5% BSA和0. 05% NaN3的 PBS)清洗，并悬浮在200 μ 1含有各种量的测试抗体的FACS结合缓冲液中。冰上30分钟后， 用FACS结合缓冲液清洗细胞两次。然后将被小鼠24111染色的细胞悬浮在200μ 1以1/200 稀释在FACS结合缓冲液内的FITC标记山羊抗小鼠IgG多克隆抗体(SouthernBiotech) 内。将被嵌合或人源化24111染色的细胞悬浮在200 μ 1以1/200稀释在FACS结合缓冲液 内的FITC标记羊抗人IgG多克隆抗体(SouthernBiotech)内。冰上30分钟后，将细胞用 FACS结合缓冲液清洗，并悬浮在200 μ 1 FACS结合缓冲液中，用FACSCan流式细胞仪(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ)进行分析。在本分析中，嵌合和人源化24111抗体与 CHO/hu α 9细胞的结合彼此非常相似(图15)。使用瞬时表达抗体的细胞ELISA和FACS的实验结果表明，小鼠24111抗体的人源 化是成功的。这里公开的其它小鼠抗人0 9抗体(即1K11，21C5，25B6和28S1)的人源化也同 样可以通过采用本文说明的程序来进行。这些小鼠单克隆抗体各自的VH和VL区DNA序列 和氨基酸序列汇总如下。 1每一个抗体的V基因通过使用Amersham简并引物的方法克隆。2每个克隆的推导氨基酸序列从VH区的第2个残基开始(根据Kabat编码体系)7.保藏根据微生物保藏布达佩斯条约，可产生抗人α 9整联蛋白单克隆抗体的在这里称 作11(11，2比5，24111，2586和283 1的杂交瘤于2006年2月15日储存于日本产业技术综 合研究所国际专利生物保管(International PatentOrganism D印ositary)，地址为AIST Tsukuba Central 6,1-1, Higashi 1-chomeTsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566 Japan, 授予的登录号分别为 Nos. FERMBP-10510, FERM BP-10511，FERM BP-10512，FERM BP-10513 和FERMBP-10832，本文引用所有这些的全部内容作为参考。8.工业实用性本发明的人源化单克隆抗体可抑制α 9整联蛋白的功能，从而对癌症，例如癌细 胞的生长或转移，和炎症性疾病，例如类风湿性关节炎、骨关节炎、肝炎、支气管哮喘、纤维 化、糖尿病、癌症转移、动脉硬化、多发性硬化、肉芽肿、炎性肠病(溃疡性结肠炎和克罗恩 氏病)、自身免疫性疾病等，显示治疗作用。本发明的包含抗α 9整联蛋白抗体和抗整联蛋 白α 4抗体二者的的药物组合物显示出对癌症和炎症性疾病具有更高的治疗作用。9.序列表整个说明书中引用的序列总结如下。
权利要求
一种可免疫特异性地识别人α9整联蛋白的人源化抗体或其抗原结合片段，其包括(i)H链，其包含至少一个衍生自人抗体VH区的FRH，以及至少一个CDRH，所述CDRH衍生自可免疫特异性地识别人α9整联蛋白的非人类抗体的至少一个CDRH；或(ii)L链，其包含至少一个衍生自人抗体VL区的FRL，以及至少一个CDRL，所述CDRL衍生自可免疫特异性地识别人α9整联蛋白的非人类抗体的至少一个CDRL；或(iii)上述的(i)和(ii)。
2.权利要求1的人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述非人类抗体是由选自下组的 杂交瘤产生的小鼠单克隆抗体保藏号FERM BP-10510、FERM BP-1051U FERM BP-10512、 FERM BP-10513 和 FERM BP-10832。
3.权利要求1的人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体的至少一个CDRH 包含选自氨基酸序列SEQ ID NO :4、5和6中的氨基酸序列，并且所述人源化抗体的至少一 个⑶RL包含选自氨基酸序列SEQ IDNO 11、12和13中的氨基酸序列。
4.权利要求2或3的人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述人抗体VH区包含从由 GenBank登录号为X65891 (SEQ ID NO :18)的核苷酸序列编码的氨基酸序列衍生的氨基酸 序列，并且所述人抗体VL区包含从由GenBank登录号X72441 (SEQ ID NO 23)的核苷酸序 列编码的氨基酸序列衍生的氨基酸序列。
5.权利要求4的人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述H链包含氨基酸序列SEQID NO :29，并且所述L链包含氨基酸序列SEQ ID NO :31。
6.一种分离的核酸分子，其包含编码氨基酸序列SEQ ID NO :29的核苷酸序列。
7.权利要求6的核酸分子，其中所述核苷酸序列具有核苷酸序列SEQIDN0:28。
8.权利要求6的核酸分子，进一步包含编码信号肽的核苷酸序列。
9.权利要求8的核酸分子，其中所述信号肽包含氨基酸序列SEQIDNO=IO0
10.一种分离的核酸分子，其包含编码氨基酸序列SEQ ID NO :31的核苷酸序列。
11.权利要求10的核酸分子，其中所述核苷酸序列具有核苷酸序列SEQIDN0:30。
12.权利要求10的核酸分子，进一步包含编码信号肽的核苷酸序列。
13.权利要求12的核酸分子，其中所述信号肽包含氨基酸序列SEQIDNO :17。
14.一种载体，其包含权利要求6或10或其二者的核酸分子，其中所述核酸分子与一个 或多个调节元件可操作地连接。
15.一种分离的宿主细胞，其包含权利要求14的载体。
16.一种制备人源化抗体或其抗原结合片段的方法，包括在所述人源化抗体或其抗原 结合片段得以表达的条件下培养权利要求15的宿主细胞，并收集所表达的人源化抗体。
17.一种药物组合物，其包含权利要求1、2或5中任一项的人源化抗体或其抗原结合片 段以及可药用的载体。
18.一种预防或治疗与α 9整联蛋白有关的病症或疾病的方法，所述方法包括向有需 要的受试者施用有效量的权利要求5的人源化抗体或其抗原结合片段。
19.一种体内诊断与α 9整联蛋白有关的病症或疾病的方法，所述方法包括向待检受 试者施用有效量的权利要求1或2的人源化抗体或其抗原结合片段。
20.一种可免疫特异性地识别人α 9整联蛋白的人源化抗体或其抗原结合片段，其包含(i)H链，其包含至少一个衍生自人抗体VH区的FRH以及，至少一个⑶RH，所述⑶RH包 含选自氨基酸序列SEQ ID NO :32、33和34中的氨基酸序列；或(ii)L链，其包含至少一个衍生自人抗体VL区的FRL，以及至少一个CTRL，所述⑶RL包 含选自氨基酸序列SEQ ID NO :37、38和39中的氨基酸序列；或(iii)上述的⑴和(ii)。
21.一种可免疫特异性地识别人α 9整联蛋白的人源化抗体或其抗原结合片段，其包含(i)H链，其包含至少一个衍生自人抗体VH区的FRH，以及至少一个⑶RH，所述⑶RH包 含选自氨基酸序列SEQ ID NO :42、43和44中的氨基酸序列；或(ii)L链，其包含至少一个衍生自人抗体VL区的FRL，以及至少一个CTRL，所述⑶RL包 含选自氨基酸序列SEQ ID NO :47、48和49中的氨基酸序列；或(iii)上述的⑴和(ii)。
22.一种可免疫特异性地识别人α 9整联蛋白的人源化抗体或其抗原结合片段，其包含(i)H链，其包含至少一个衍生自人抗体VH区的FRH，以及至少一个⑶RH，所述⑶RH包 含选自氨基酸序列SEQ ID NO :52、53和54中的氨基酸序列；或(ii)L链，其包含至少一个衍生自人抗体VL区的FRL，以及至少一个CTRL，所述⑶RL包 含选自氨基酸序列SEQ ID NO :57、58和59中的氨基酸序列；或(iii)上述的⑴和(ii)。
23.一种可免疫特异性地识别人α 9整联蛋白的人源化抗体或其抗原结合片段，其包含(i)H链，其包含至少一个衍生自人抗体VH区的FRH，以及至少一个⑶RH，所述⑶RH包 含选自氨基酸序列SEQ ID NO :62、63和64中的氨基酸序列；或(ii)L链，其包含至少一个衍生自人抗体VL区的FRL，以及至少一个CTRL，所述⑶RL包 含选自氨基酸序列SEQ ID NO :67、68和69中的氨基酸序列；或(iii)上述的⑴和(ii)。
全文摘要
本发明提供了可免疫特异性地识别人α9整联蛋白的人源化抗体。这些抗体中的一些可以抑制整联蛋白α9的生物学功能，从而显示对多种与整联蛋白α9有关的病症或疾病具有治疗作用，这些病症或疾病包括癌症，例如癌细胞的生长和转移，和炎症性疾病，例如类风湿性关节炎、骨关节炎、肝炎、支气管哮喘、纤维化、糖尿病、动脉硬化、多发性硬化、肉芽肿、炎性肠病(溃疡性大肠炎和克罗恩氏病)、自身免疫性疾病等。
文档编号G01N33/577GK101918555SQ20098010202
公开日2010年12月15日 申请日期2009年1月13日 优先权日2008年1月11日
发明者今重之, 尚卡·库马, 曹仲欣, 鹤下直也 申请人:株式会社遗传科技;科研制药株式会社