基于免疫的血清型a肉毒杆菌毒素活性测定的制作方法

专利名称：：基于免疫的血清型a肉毒杆菌毒素活性测定的制作方法基于免疫的血清型A肉毒杆菌毒素活性测定本专利申请根据35U.S.C.§119(e)，要求以2008年3月14日提交的美国临时专利申请No.61/036，723作为优先权基础，该临时申请的全部内容均以援引的方式纳入本文。梭菌毒素-例如肉毒神经毒素(BoNT)BoNT/A、BoNT/B、BoNT/Cl、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F和BoNT/G以及破伤风神经毒素(TeNT)——抑制神经元传递的能力已经被用于多种治疗和美容用途，参见例如，WilliamJ.Lipham,CosmeticandClinicalApplicationsofBotulinumToxin(Slack、he.，2004)。市售的梭菌毒素药物组合物包括BoNT/A制剂，例如，BOTOX(Allergan,Inc.，Irvine,CA),DYSPORT/RELOXIN(IpsenLtd.，Slough,England)>PURTOX(MentorCorp.，SantaBarbara,CA)>XEOMIN(MerzPharmaceuticals,GmbH.,Frankfurt,Germany)、NEURONOX(Medy-Tox,Inc.,Ochang-myeon,SouthKorea)禾口BTX-A(Biogen-techLtd.,University,Yantai,Shandong,China)；以及BoNT/B制剂，例如MYOBLOC/NEUROBLOC(SolsticeNeurosciences,Inc.,SouthSanFrancisco,CA)。例如，BOTOX目前已被美国批准用于在成年人中治疗颈肌张力障碍以减轻与颈肌张力障碍有关的异常头位和颈痛的严重度；用于治疗外用剂不恰当处理的严重原发性腋部多汗症；以及用于治疗与张力障碍相关的斜视和睑痉挛，包括年龄在12岁和以上的患者中的良性原发性睑痉挛或VII神经病症。现在，一种致死试验小鼠LD5tl生物测定仍是所有药物制造商用于表示其制剂效能的“黄金标准”。S.S.Arnonetal.，JAMA2851059-1070(2001)。事实上，药物制剂标签上的单位是小鼠LD5tl单位，并且产生统计学可用的LD5tl数据需要的动物数目是很大的。小鼠LD5tl生物测定的优点是，它测量对肉毒毒素摄取(例如，毒素结合于细胞表面受体、毒素-受体复合体内化、轻链易位至细胞质、底物的轻链剪切)所必需的所有步骤，而不只是对此中毒过程的一部分测定活性，例如仅测量轻链酶活的体外测定。不幸的是，小鼠LD5tl生物测定有许多缺点，包括由于需要大量实验动物所导致的高操作成本，因为所有BoNT血清型都会引起相同的可测量终点而造成的无特异性，以及如果不使用大量动物的不准确的可能性。另外，动物权利组织已经向美国(FDA/NICEATM/ICCVAM)和欧洲(MHRA和EDQM)的监管机构以及制造肉毒神经毒素制品的制药公司施压，以减少动物试验并且——更重要地——替换用于产品发布的小鼠LD5tl生物测定。监管机构要求制药公司将三“R”原则应用于肉毒杆菌神经毒素的效能试验减少(Reduce)、精简(Refine)、替换(R印lace)。D.Straughan，ProgressinApplyingtheThreeRstothePotencyTestingofBotulinumToxinTypeA，Altern.Lab.Anim.34(3):305-313(2006)。在最近几年中，已经采取了数项措施来减少和精简小鼠LD5tl生物测定，目的是标准化方案以及在每次测定中使用更少的动物产生更一致的数据。因此，可以评估肉毒杆菌毒素摄取中必需的所有步骤的完整性的简单、可靠、经验证且政府机构可接受的肉毒毒素活性测定将会有重要价值，因为这种不基于动物的测定将减少对动物试验的需求以及与这类基于动物的测定相关的所有缺点、成本和伦理问题。本说明书提供了测定可用于在多个产业例如制药业和食品工业中的肉毒杆菌毒素A的活性的新型组合物、细胞和方法，并且还提供了相关的优点。这些组合物、细胞和方法不使用活动物或者取自活动物的组织，但能够评估对神经毒素作用所必需的所有步骤。图1为中枢和周围神经元中的神经递质释放和梭菌毒素中毒的现行范例的示意图。图IA为中枢和周围神经元中的神经递质释放机制的示意图。所述释放过程可被描述为包括两个步骤1)囊泡停靠，其中含有神经递质分子的囊泡上的与囊泡结合的SNARE蛋白和位于质膜上的与膜结合的SNARE蛋白相结合；和2)神经递质释放，其中囊泡与质膜相融合并以胞吐方式释放神经递质分子。图IB为破伤风毒素和肉毒毒素在中枢和周围神经元中活动的中毒机制的示意图。这一中毒过程可被描述为包括四个步骤1)受体结合，其中梭菌毒素与梭菌受体复合体相结合并启动中毒过程；幻复合体内化，其中在毒素结合之后，含有毒素/受体系统复合体的囊泡被胞吞至细胞内；幻轻链易位，其中认为发生了多个事件，包括囊泡内部PH的改变、包含梭菌毒素重链的Hn结构域的通道孔的形成、梭菌毒素轻链和重链的分离以及轻链的释放；和4)酶促靶标修饰，其中梭菌毒素的轻链对其靶标SNARE底物(例如SNAP-25、VAMP或突触融合蛋白)进行蛋白酶解剪切，由此阻止囊泡停靠和神经递质释放。图2示出了通过蛋白质印迹分析对4种细胞系中的BoNT/A摄取的比较。图2A示出了基于用于处理所述细胞系的BoNT/A的量检测到的SNAP-25剪切产物的曲线图。在SigmaPlot中使用4参数逻辑模型分析了这些数据，并获得了每种细胞系的EC5tl值。检测到的SNAP-25剪切产物信号的排序是SiMa>>Neuro-2a>LAl_55n>PC12。图2B示出了对所述测定计算的300pM对OpM以及1.2pM对OpM的原始信号的信噪比。SiMa细胞产生了最高信噪比和最低EC5tl值。图3示出了对已建立细胞系的细胞分化培养基的优化，所述细胞系可用于本说明书中公开的基于免疫的检测BoNT/A活性的方法。图4示出了对已建立细胞系包含的细胞的细胞分化时间的优化，所述细胞系可用于本说明书中公开的基于免疫的检测BoNT/A活性的方法。图5示出了对已建立细胞系包含的细胞的BoNT/A处理的优化，所述细胞系可用于本说明书中公开的基于免疫的检测BoNT/A活性的方法。结果表明，任一试验的BoNT/A处理均获得了小于2pM的EC5tl。图6示出了本说明书中公开的基于免疫的检测BoNT/A活性的方法的灵敏度。结果表明，细胞对BoNT/A的摄取花不到1分钟，然后产生相对背景显著量的SNAP-25剪切产物。图7示出了本说明书中公开的基于免疫的检测BoNT/A活性的方法特异性。结果表明，本说明书中公开的基于免疫的检测BoNT/A活性的方法可以测量BoNT/A中毒中包括的所有步骤。图8示出了使用本说明书中公开的基于免疫的检测BoNT/A活性的方法用BoNT/A复合体处理的分化SiMa细胞的剂量反应曲线。图9示出了使用本说明书中公开的基于免疫的检测BoNT/A活性的方法对制成制剂的BoNT/A药物产品进行基于免疫的BoNT/A活性测定的结果。图10示出了使用本说明书中公开的基于免疫的检测BoNT/A活性的方法中和人血清中的α"BoNT/A抗体的检测。具体实施例方式本说明书提供了用于测定样品中是否存在活性BoNT/A以及用于测定BoNT/A制剂的活性/效能的新型测定。本说明书中公开的基于细胞的新型测定倚赖能够使所述测定检测样品中皮摩尔量的BoNT/A的细胞、试剂和检测方法。本说明书中公开的基于细胞的新型测定减少了对动物毒性研究的需求，但仍可用于分析有关BoNT/A的多种功能，即毒素的结合和细胞摄取，易位至细胞胞质溶胶，以及蛋白酶活性。如下文进一步讨论的，所述新型方法和组合物可以用于分析粗样品和大量样品以及高度纯化的双链毒素和制成制剂的毒素产品，并且还可以适用于自动高通量测定形式。因此，本说明书中公开的一个方面提供了用于产生a-SNAP-25抗体的组合物，所述抗体可以结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位。组合物可包含佐剂和这样的组成，即所述组成包含SNAP-25抗原、连接于SNAP-25抗原的载体或者连接于与SNAP-25抗原连接的柔性间隔物的载体，其中所述柔性连接体介于所述SNAP-25抗原和所述载体之间。可想象的是，可触发产生α-SNAP-25抗体——该抗体可以结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位——的免疫反应的任一和所有SNAP-25抗原都可用作SNAP-25抗原，非限制地包括源自天然SNAP-25的SNAP-25抗原、源自非天然SNAP-25的SNAP-25抗原和包含天然或非天然SNAP-25的免疫反应性片段的SNAP-25抗原。可用于产生α-SNAP-25抗体——该抗体可以结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位——的SNAP-25抗原非限制地包括包含连接于载体肽的具有羧化C端谷氨酰胺的SNAP-25肽的SNAP-25抗原，非限制地包括SEQIDNO:38。用于制备α-SNAP-25抗体——该抗体可以结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位——的其他组合物非限制地包含这样的组成，即该组成包含连接于与具有羧化C端谷氨酰胺的SNAP-25抗原连接的柔性连接体的载体，其中所述柔性连接体介于所述SNAP-25抗原和所述载体之间。可想象的是，任一和所有佐剂都可用于这类组合物中，非限制地包括聚乙二醇(PEG)、单甲氧基聚乙二醇(mPEG)、聚乙烯醇(PVA)、完全和不完全弗氏佐剂。本说明书中公开的另一方面提供了生产α-SNAP-25抗体的方法，该抗体可以结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位。该方法的一些方面包括以下步骤(a)给予动物本说明书中公开的组合物；(b)从所述动物采集包含α-SNAP-25抗体或产生α-SNAP-25抗体的细胞的样品；和(c)从所述样品分离所述α-SNAP-25抗体。所公开方法可用于制备α-SNAP-25单克隆抗体或α-SNAP-25多克隆抗体，所述单克隆抗体和多克隆抗体都可以结合含有SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的羧基端谷氨酰胺的表位。本说明书中公开的又一方面提供a-SNAP-25抗体——该抗体可以结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位。除了包括单克隆α-SNAP-25抗体或多克隆α-SNAP-25抗体之外，这类α-SNAP-25抗体还包括天然和非天然抗体。可用作α-SNAP-25抗体——该抗体可以结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位——的单克隆α-SNAP-25抗体非限制地包括杂交瘤细胞系1D!3B8、2C9B10、2E2A6、3C1A5和3C3E2产生的单克隆α-SNAP-25抗体。本说明书中公开的再一方面提供了检测BoNT/A活性的方法。该方法的一些方面包括步骤(a)用包含BoNT/A的样品处理来自已建立细胞系的细胞，其中所述来自已建立细胞系的细胞对BoNT/A中毒是敏感的；(b)从所述处理的细胞分离包含在BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25剪切产物的SNAP-25组分；(c)将所述SNAP-25组分与α-SNAP-25抗体相接触，该抗体可以结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位；和(d)检测包含所述α-SNAP-25抗体和所述SNAP-25剪切产物的抗体-抗原复合体的存在情况；其中通过所述抗体-抗原复合体的检测结果指示BoNT/A活性。步骤c的α-SNAP-25抗体可任选地连接于固相支持物。本说明书中公开的再一方面提供了检测BoNT/A活性的方法。该方法的一些方面包括步骤(a)用包含BoNT/A的样品处理来自已建立细胞系的细胞，其中所述来自已建立细胞系的细胞可摄取BoNT/A；(b)从所述处理的细胞分离包含在BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25的SNAP-25组分；(c)将所述SNAP-25组分与α-SNAP-25抗体相接触，该抗体可以结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位；和(d)检测包含所述α-SNAP-25抗体和所述SNAP-25剪切产物的抗体-抗原复合体的存在情况；其中通过所述抗体-抗原复合体的检测结果指示BoNT/A活性。步骤c的α-SNAP-25抗体可任选地连接于固相支持物。本说明书中公开的又一方面提供了检测哺乳动物中的BoNT/A免疫抗性的方法。该方法的一些方面包括步骤(a)将BoNT/A添加至从被测试α-BoNT/A中和抗体是否存在的哺乳动物获得的试验样品中；(b)用所述试验样品处理来自已建立细胞系的细胞，其中所述来自已建立细胞系的细胞对BoNT/A中毒是敏感的；(c)从所述处理的细胞分离包含在BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25剪切产物的SNAP-25组分；(d)将所述SNAP-25组分与α-SNAP-25抗体相接触，该抗体可以结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位；(e)检测包含所述α-SNAP-25抗体和所述SNAP-25剪切产物的抗体-抗原复合体的存在情况；(f)以阴性对照样品代替试验样品重复步骤a-e；和(g)将步骤(e)中检测到的抗体-抗原复合体的量与步骤(f)中检测到的抗体-抗原复合体的量对比，其中与步骤(f)中检测到的抗体-抗原复合体的量相比，步骤(e)中检测到的抗体-抗原复合体的较低量的检测结果指示α-ΒοΝΤ/Α中和抗体的存在。步骤d的α-SNAP-25抗体可任选地连结于固相支持物。除了阴性对照样品之外，步骤f中的对照样品还可包括阳性对照样品。由肉毒杆菌(Clostridiumbotulinum)、破伤风杆菌(Clostridiumtetani)、巴氏梭菌(Clostridiumbaratii)和丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)产生的梭菌毒素非常广泛地用于人和其他哺乳动物的治疗性和美容性治疗中。肉毒梭菌(C.botulinum)菌株产生七种具有不同抗原性的肉毒毒素(BoNT)血清型，它们通过研究人中(BoNT/A、BoNT/B、BoNT/E和BoNT/F)和动物中(BoNT/Cl和BoNT/D)的肉毒菌中毒的发生而被识别；或从土壤中分离得到(BoNT/G)。虽然全部七种肉毒毒素血清型都具有相似的结构和生物学性质，但每一种也表现出不同特征，例如不同的药理学性质。与之相反，破伤风毒素(TeNT)由唯一的破伤风梭菌(C.tetani)群产生。其他两种梭菌——巴氏梭菌(C.baratii)和丁酸梭7菌(C.butyricum)——还产生分别与BoNT/F和BoNT/E类似的毒素。每种梭菌毒素都被翻译成大约150kDa的单链多肽，该单链多肽随后通过以下方式被剪切由天然蛋白酶例如内源性梭菌毒素蛋白酶或环境中产生的天然蛋白酶在二硫环内进行蛋白酶解切断。该翻译后加工产生双链分子，该分子包含通过单个二硫键和非共价相互作用而连在一起的大约50kDa的轻链(LC)和大约IOOkDa的重链(HC)。每种成熟的双链分子均包括三个功能上不同的结构域1)酶促结构域，位于LC上，含有具有锌依赖性的内肽酶活性的金属蛋白酶区域，可特异性地靶向于神经递质释放机构的核心组件；2)易位结构域，位于HC的氨基端一侧(),它促进LC从细胞内的囊泡中释放至靶细胞的胞质中；和3)结合结构域，位于HC的羧基端一侧(Hc),它决定毒素与位于靶细胞表面的受体复合体的结合活性和结合特异性。这三个功能性结构域的结合活性、易位活性和酶促活性都是对毒性所必需的。虽然尚未精确地获知这一过程中的所有细节，但不管是何种血清型或亚型，梭菌毒素进入神经元并抑制神经递质释放的总的细胞中毒机制是类似的。虽然本申请并不希望被下列描述所限制，但是该中毒机制可被描述为包括至少四个步骤1)受体结合；幻复合体内化；3)轻链易位；和4)酶促靶向修饰(见图1)。这一过程开始于梭菌毒素的Hc结构域与位于靶细胞的质膜表面的毒素特异性受体系统的结合。受体复合体的结合特异性部分地来自于似乎独特地构成每种梭菌毒素受体复合体的蛋白受体和神经节苷脂的特定组合。一旦结合，所述毒素/受体复合体通过胞吞作用内化，内化的囊泡被分派至特定胞内途径。易位步骤似乎是通过囊泡区室的酸化而被引发的。这一过程似乎可以启动重要的依赖于PH的结构重排，所述结构重排增加疏水性、促进孔隙形成并有利于毒素的重链和轻链分开。一旦分开，毒素的轻链内肽酶从胞内的囊泡释放至胞质溶胶中，在此它似乎能特异性地靶向神经递质释放机构的核心组件。这些核心蛋白为囊泡相关膜蛋白(VAMP)/突触小泡蛋白、25kDa的突触体相关蛋白(SNAP-2Q和突触融合蛋白，它们是突触囊泡在神经末梢上停靠和融合所必需的蛋白，并且它们都属于可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体(SNARE)家族的成员。BoNT/A和BoNT/E剪切SNAP-25的羧基端区域，分别释放九个氨基酸或二十六个氨基酸的片段，BoNT/Cl也剪切SNAP-25靠近羧基端的区域，释放八个氨基酸的片段。肉毒毒素血清型BoNT/B、BoNT/D、BoNT/F和BoNT/G以及破伤风毒素作用于VAMP的保守中心部分，并使得VAMP的氨基端部分释放至胞质溶胶中。BoNT/Cl剪切突触融合蛋白中接近细胞质膜表面的单个位点。突触SNARE蛋白被选择性地蛋白酶解使得梭菌毒素可以在体内阻断神经递质释放。对于在多种非神经元类型细胞中的胞吐作用，梭菌毒素的SNARE蛋白靶标是相同的；和在神经元中一样，在这些细胞中，轻链的肽酶活性抑制胞吐作用，参见例如，YannHumeauetal.，HowBotulinumandTetanusNeurotoxinsBlockNeurotransmitterRelease,82(5)Biochimie.427-446(2000)；KathrynTurtonetal.，BotulinumandTetanusNeurotoxins:Structure，FunctionandTherapeuticUtility,27(11)TrendsBiochem.Sci.552-558.(2002)；GiovannaLallietal.，TheJourneyofTetanusandBotulinumNeurotoxinsinNeurons，11(9)TrendsMicrobiol.431-437，(2003)ο本公幵的一些方面部分地包括一种用于产生α-SNAP-25抗体的组合物，该抗体可以结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位。本公开的另一些方面部分地包括一种用于产生α-SNAP-25抗体的诱导免疫反应的组合物，该抗体可以结合在SNAP-25剪切产物的ΒοΝΤ/Α剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位。本文中使用的“诱导免疫反应的组合物”是指一种包含SNAP-25抗原的组合物，当所述组合物被给予动物时可刺激对所述SNAP-25抗原的免疫反应，从而产生α-SNAP-25抗体——该抗体可以结合在SNAP-25剪切产物的ΒοΝΤ/Α剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位。术语“免疫反应”是指动物免疫系统对诱导免疫反应的组合物的任何应答。示例性免疫反应包括但不限于局部的和全身的以及细胞的体液免疫，例如CTL应答，包括CD8+CTL的抗原特异性诱导；辅助T细胞应答，包括T细胞增殖应答和细胞因子释放；以及B细胞应答，包括例如抗体产生应答。术语“诱导免疫反应”是指给予诱导免疫反应的组合物或者编码所述诱导免疫反应的组合物的多核苷酸，这时免疫反应被影响，即被刺激、被启动或者被诱导。组合物包含SNAP-25抗原。本文使用的术语“抗原”是指诱发免疫反应的分子，非限制地包括肽、多糖和脂质缀合物例如脂蛋白和糖脂。本文使用的术语“SNAP-25抗原”是指可诱发免疫反应的在所述ΒοΝΤ/Α剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的任意抗原。在诱导免疫反应的组合物中使用的SNAP-25抗原必须大至足以在序列上基本是独特的，从而降低产生与SNAP-25之外的抗原交叉反应的抗体的可能性。另外，在诱导免疫反应的组合物中使用的SNAP-25抗原必须小至足以基本上仅触发对在所述ΒοΝΤ/Α剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25的免疫反应，从而增加产生将在所述ΒοΝΤ/Α剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25与在所述ΒοΝΤ/Α剪切位点易切断键的P1残基处不含羧基端的SNAP-25区分开的α-SNAP-25抗体的可能性。再者，还非常希望以高产率生成单一氨基酸序列的α-SNAP-25抗体，所述抗体的选择性是可以再现的，并且以满足要求的亲合力结合，以使得可设计高度灵敏的测定。存在于SNAP-25中的ΒοΝΤ/Α剪切位点周围的序列表示为P5-P4-P3-P2-P1-P1’_P2’_P3'-P/-P5’，以P1-P1'代表所述易切断键。在被ΒοΝΤ/Α剪切时，所形成的剪切产物包括包含P5-P4-P3-P2-P1序列的片段和包含P1'-P2，-P3'-P4，-P5'的片段。因此，本文使用的术语“在所述ΒοΝΤ/Α剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25”是指将所述P1残基作为其羧基端氨基酸的任意SNAP-25。例如，人SNAP-25(SEQIDNO5)Q197-R198代表所述ΒοΝΤ/Α剪切位点的P1-P/易切断键。照此，“具有所述ΒοΝΤ/Α剪切位点易切断键的羧基端谷氨酰胺的SNAP-25”将为在其羧基端氨基酸位置上具有谷氨酰胺的任意SNAP-25剪切产物，这里所述谷氨酰胺代表所述易切断键的0197。又例如，石纹电鳐(Torpedomarmorata)SNAP-25(SEQIDNO:16)的K2tl4-H2tl5代表所述BoNT/A剪切位点的P1-P1'易切断键。照此，“具有所述ΒοΝΤ/Α剪切位点易切断键的羧基端赖氨酸的SNAP-25”将为在其羧基端氨基酸位置上具有赖氨酸的任意SNAP-25剪切产物，这里所述赖氨酸代表所述易切断键的K2(14。可以将在所述ΒοΝΤ/Α剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25抗原进行修饰，以增强如下物质的免疫原性SNAP-25抗原、半抗原或者当未修饰时有免疫原性、无免疫原性或有弱免疫原性的任何其他抗原性化合物。在该实施方案的一个方面中，SNAP-25抗原的易切断键的羧基端P1残基可以被羧化。羧化可以在两方面增加需要的SNAP-25抗原的免疫原性质。第一，因为带电荷的氨基酸可增强免疫原性，所以将COO—基团添加至所述羧基端残基将会增加SNAP-25抗原的总体免疫原性。第二，因为所述ΒοΝΤ/Α剪切位点易切断键的P1残基在剪切时处于带电荷状态，所以将COO—基团添加至所述羧基端残基将会更好地模拟这样的实际抗原，即该抗原是本说明书中公开的α"SNAP-25抗体被设计以结合的。在该实施方案的一个方面中，SNAP-25抗原的氨基端残基可通过添加适于将所述SNAP-25抗原连接于载体蛋白的氨基酸进行修饰，所述载体蛋白例如钥孔慽血蓝蛋白(KLH)、卵白蛋白(OVA)、甲状腺球蛋白(THY)、牛血清白蛋白(BSA)、大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)或多附着肽(multipleattachmentpeptide,MAP)0例如，可以将半胱氨酸残基放置在氨基端，以缀合所述载体蛋白KLH。因此，在一个实施方案中，在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1S基处含有羧基端的SNAP-25抗原的长度可以为例如至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少25或至少30个氨基酸。在另一实施方案中，在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25抗原的长度可以为例如至多5、至多6、至多7、至多8、至多9、至多10、至多11、至多12、至多13、至多14、至多15、至多16、至多17、至多18、至多19、至多20、至多25或至多30个氨基酸。在又一实施方案中，在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25抗原可以为例如7-12个氨基酸、10-15个氨基酸或13-18个氨基酸。在另一实施方案中，在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25抗原包括SEQIDNO:32。在该实施方案的一些方面中，在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的所述SNAP-25抗原包括SEQIDNO33、SEQIDNO:34、SEQIDNO35,SEQIDNO36、SEQIDNO37、SEQIDNO:147或SEQIDN0:148。在又一实施方案中，在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25抗原包括SEQIDNO:38ο仍在另一实施方案中，在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25抗原包括SEQIDNO:39。在该实施方案的一些方面中，在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25抗原包括SEQIDNO:40、SEQIDNO:41、SEQIDNO42,SEQIDNO43或SEQIDNO:44。在又一实施方案中，在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25抗原包括SEQIDNO:45。可想象的是，触发产生α-SNAP-25抗体——该抗体可结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位——的免疫反应的任一和所有SNAP-25抗原都可以用作SNAP-25抗原。因此，包括SEQIDNO32、SEQIDNO33、SEQIDNO34,SEQIDNO35、SEQIDNO36、SEQIDNO37、SEQIDNO39、SEQIDNO40、SEQIDNO41,SEQIDNO42,SEQIDNO43,SEQIDN0:44、SEQIDNO:147或SEQIDNO:148的氨基酸序列变体可用作触发产生α-SNAP-25抗体——该抗体可结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位——的免疫反应的SNAP-25抗原。因此，在一个实施方案中，SNAP-25抗原可相对包括SEQIDNO32、SEQIDNO33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:39、SEQIDNO:40、SEQIDNO:41、SEQIDNO42,SEQIDNO43,SEQIDNO:44、SEQIDNO:147或SEQIDNO148的SNAP-25抗原具有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个氨基酸的置换、缺失或添加。在又一实施方案中，SNAP-25抗原与包括SEQIDNO32、SEQIDNO:33、SEQIDNO34,SEQIDNO35、SEQIDNO36、SEQIDNO37、SEQIDNO39、SEQIDNO:40、SEQIDNO:41、SEQIDNO:42、SEQIDNO:43、SEQIDNO:44、SEQIDNO:147或SEQIDNO148的SNAP-25抗原可以有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的氨基酸同一性。可想象的是，一种或多种载体可连接于SNAP-25抗原，目的是增强当未与所述载体缔合时有免疫原性、无免疫原性或有弱免疫原性的SNAP-25抗原的免疫原性。非限制性实例包括，例如钥孔慽血蓝蛋白(KLH)、卵白蛋白(OVA)、甲状腺球蛋白(THY)、牛血清白蛋白(BSA)、大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)或多附着肽(MAP)。如本领域中公知的，可以通过将无抗原性或弱抗原性的抗原偶联于载体而使所述抗原有抗原性。用于将抗原偶联于载体的多种其他载体和方法是本领域中公知的。参见，例如Harlow和Lane，见上文，1998a；Harlow禾口Lane，见上文，1998b；以及DavidW.Waggoner,Jr.等人，Immunogenicity-enhancingcarriersandcompositionsthereofandmethodsofusingthesame，美国专禾公开文本No.20040057958Q004年3月25日)。表位还可以通过将所述表位作为融合蛋白表达而生成。用于表达多肽融合物的方法是本领域技术人员公知的，例如记载于Ausubeletal·,CurrentProtocolsinMolecularBiology(Supplement47),JohnWiley&Sons,NewYork(1999)中。由于所述SNAP-25抗原的羧基末端必须是所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基，因此载体必须连接于所述SNAP-25抗原的氨基端。可想象的是，一个或多个柔性间隔物可连接于SNAP-25抗原，目的是增强当未与所述柔性连接体缔合时有免疫原性、无免疫原性或有弱免疫原性的SNAP-25抗原的免疫原性。柔性间隔物可增加所述SNAP-25抗原的总肽长度并提供柔性，从而有利于所述SNAP-25抗原正确地呈递于所述免疫细胞。一个非限制性实例是，组合物可包含这样的SNAP-25抗原，即该抗原连接于串联的一个或多个柔性间隔物以将SNAP-25抗原更好地呈递于免疫细胞，从而有利于所述免疫反应。由肽构成的柔性间隔物的长度为至少1个氨基酸，并且包含具有小侧链R基团的不带电荷氨基酸，例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸或丝氨酸。因此，在一个实施方案中，柔性间隔物的长度可以为例如至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个氨基酸。在另一个实施方案中，柔性间隔物的长度可以为例如至少1个、至多2个、至多3个、至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个或至多10个氨基酸。在又一个实施方案中，柔性间隔物的长度可以为例如1-3个氨基酸、2-4个氨基酸、3-5个氨基酸、4-6个氨基酸或5_7个氨基酸。柔性间隔物的非限制性实例包括例如G间隔物如GGG、GGGG(SEQIDNO55)和GGGGS(SEQIDNO56)或者A间隔物如AAA、AAAA(SEQIDNO:57)和AAAAV(SEQIDNO:58)。柔性间隔物在阅读框内连接于所述SNAP-25抗原成为融合蛋白。如上文详述的，柔性间隔物部分地用于增加所述SNAP-25抗原的总体肽长度。例如，5-10个氨基酸的SNAP-25抗原可以通过在其氨基端连接3_5个氨基酸的柔性间隔物而增加其总长度。再例如，5-10个氨基酸的SNAP-25抗原可以通过在其氨基端连接4_6个氨基酸的柔性间隔物而增加其总长度。再例如，5-10个氨基酸的SNAP-25抗原可以通过在其氨基端连接7-10个氨基酸的柔性间隔物而增加其总长度。再例如，7-12个氨基酸的SNAP-25抗原可以通过在其氨基端连接1-3个氨基酸的柔性间隔物而增加其总长度。再例如，7-12个氨基酸的SNAP-25抗原可以通过在其氨基端连接4-个6氨基酸的柔性间隔物而增加其总长度。由所述柔性间隔物提供的长度增加使得可选择较小大小的SNAP-25抗原，从而增加所述SNAP-25抗原基本上仅触发对在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25的免疫反应的可能性，因此增加产生将在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25与在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处不含羧基端的SNAP-25区分开的α-SNAP-25抗体的可能性。可想象的是，本说明书中公开的组合物可任选地包含本说明书中公开的SNAP-25抗原和一种或多种佐剂。本文使用的术语“佐剂”在述及SNAP-25组合物时是指可增加或改变对SNAP-25抗原的免疫反应的任何物质或物质混合物。佐剂可以例如用于减少免疫次数或者保护性免疫需要的抗原量。佐剂在诱导免疫反应的组合物中的用途是公知的。使用这些佐剂的主要目的是使得所述免疫反应增加。非限制性佐剂包括例如脂质体、油相，非限制性地包括弗氏类型的佐剂，例如弗氏完全佐剂(FCA)；弗氏不完全佐剂(FIA)；皂苷元糖苷如皂苷；聚羧乙烯；N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(通常称为胞壁酰二肽或“MDP”)；以及脂多糖(LPQ。这类佐剂通常以与水相形成的乳剂的形式使用，或者更通常地可由不溶于水的无机盐组成。这些无机盐可包括例如氢氧化铝、硫酸锌、氢氧化铁胶体、磷酸钙或氯化钙。氢氧化铝(Al(OH)3)是一种常用的佐剂。当前，FDA批准在人中使用的佐剂只有铝盐(Alum)，所述铝盐用于通过沉淀所述抗原而“贮藏”抗原。上面提供的佐剂仅仅是示例性的。事实上，任何佐剂都可以用于本说明书中公开的SNAP-25组合物中，条件是所述佐剂满足诱导免疫反应的必要特征。本说明书中公开的载体也可以作为佐剂。具体的佐剂以及制备和使用方法公布于例如Guptaetal.Vaccine,11:993-306,1993；Arnon,R.(Ed.)SyntheticVaccines1:83-92,CRCPress,Inc.,BocaRaton,Fla.,1987；禾口DavidW.Waggoner,Jr.etal.,Immunogenicity-EnhancingCarriersandcompositionsThereofandMethodsofUsingtheSame，美国专利公开文本No.20040057958(Mar.25，2004)中。另外的佐剂包括"VaccineDesign,TheSubunitandAdjuvantApproach"(eds.Powell,M.F.andNewman,M.J.)PharmaceuticalBiotechnology,Volume6,PlenumPress(NewYork)第7章(第141-227页)中描述的任意化合物。来自该概论的实例包括胞壁酰二肽(MDP)和Montanide720。分子例如聚肌苷胞嘧啶(PolyI:C)或包含CpG基序的质粒DNA也可作为佐剂与封装在微粒中的抗原组合给药。再例如，所述佐剂是一种有利于所述抗原性化合物进入细胞胞质中的试剂，例如李斯特菌素、链球菌溶血素或它们的混合物。因此，在一个实施方案中，SNAP-25组合物包含连接于载体肽的具有羧化羧基端谷氨酰胺的SNAP-25抗原。在该实施方案的一些方面中，具有羧化羧基端谷氨酰胺的SNAP-25抗原包括SEQIDNO32,SEQIDNO33,SEQIDNO34,SEQIDNO35,SEQIDNO36,SEQIDNO37,SEQIDNO:147或SEQIDNO:148。在该实施方案的另一方面中，SNAP-25抗原包括SEQIDNO:38。在该实施方案的一些方面中，所述载体肽为钥孔慽血蓝蛋白(KLH)JP白蛋白(0VA)、甲状腺球蛋白(THY)、牛血清白蛋白(BSA)、大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)或多附着肽(MAP)。在另一实施方案中，SNAP-25组合物包含连接于载体肽的具有羧化羧基端赖氨酸的SNAP-25抗原。在该实施方案的一些方面中，具有羧化羧基端赖氨酸的SNAP-25抗原包括SEQIDNO39,SEQIDNO40,SEQIDN0:41、SEQIDNO42,SEQIDNO43或SEQIDN0:44。在该实施方案的另一方面中，SNAP-25抗原包括SEQIDNO:45。在该实施方案的一些方面中，所述载体肽为钥孔慽血蓝蛋白(KLH)、卵白蛋白(OVA)、甲状腺球蛋白(THY)、牛血清白蛋白(BSA)、大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)或多附着肽(MAP)。仍在另一实施方案中，SNAP-25组合物包含连接于一个或多个柔性连接体和载体肽的具有羧化C端谷氨酰胺的SNAP-25抗原，其中所述柔性连接体介于所述SNAP-25抗原和所述载体肽之间。在该实施方案的一些方面中，具有羧化羧基端谷氨酰胺的SNAP-25抗原包括SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO37,SEQIDNO:147或SEQIDN0:148。在另一实施方案中，SNAP-25抗原包括SEQIDN0:46。在该实施方案的一些方面中，所述载体肽为钥孔慽血蓝蛋白(KLH)、卵白蛋白(OVA)、甲状腺球蛋白(THY)、牛血清白蛋白(BSA)、大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)或多附着肽(MAP)。在该实施方案的一些方面中，所述柔性连接体为G间隔物或A间隔物。在又一实施方案中，SNAP-25组合物包含连接于柔性连接体和载体肽的具有羧化C端谷氨酰胺的SNAP-25抗原，其中所述柔性连接体介于所述SNAP-25抗原和所述载体肽之间。在该实施方案的一些方面中，具有羧化羧基端赖氨酸的SNAP-25抗原包括SEQIDNO39、SEQIDNO:40,SEQIDN0:41、SEQIDNO:42、SEQIDNO:43或SEQIDNO:44。在该实施方案的另一方面中，SNAP-25抗原包括SEQIDNO:47。在该实施方案的一些方面中，所述载体肽为钥孔慽血蓝蛋白(KLH)、卵白蛋白(0VA)、甲状腺球蛋白(THY)、牛血清白蛋白(BSA)、大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)或多附着肽(MAP)。在该实施方案的一些方面中，所述柔性连接体为G间隔物或A间隔物。本公开的一些方面部分地包括用于生产α-SNAP-25抗体的方法，所述抗体可结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位。α-SNAP-25抗体——该抗体可结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位——可通过本领域中熟知的多种方法制备。检测和测量抗体结合特异性、结合亲和性及结合亲合力，以及制备和使用抗体的具体方案是本领域中已知的。参见，例如Antibodies:ALaboeatoeyManual(EdwardHarlow&DavidLane,eds.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,2nded.1998a)；禾口UsingAntibodies:ALaboeatoeyManual:PottablePkotocolNo.I(EdwardHarlow&DavidLane,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1998b)；MolecularCloning,ALaboratoryManual,2001Lii1^CurrentProtocolsinMolecularBiology,2004；DavidAndersonetal.,TherapeuticPolypeptides,NucleicAcidsEncodingSame,andMethodsofUse，美国专利7，034，132(2005年4月25日)；以及BeatrizM.Carrenoetal.,AntibodiesAgainstCTLA4，美国专利7，034，121(2006年4月25日)。作为非限制性实例，α-SNAP-25多克隆抗体——该抗体可结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位——可通过用本说明书中公开组合物的一种或多种注射剂注射动物如兔、山羊、小鼠或另一种哺乳动物而制备。作为另一非限制性实例，α-SNAP-25多克隆抗体——该抗体可结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位——可通过用本说明书中公开组合物的一种或多种注射剂注射卵如鸡的卵而制备。免疫动物中的抗体效价可通过标准技术随时间监测，例如通过使用固定抗原的酶联免疫吸附测定(ELISA)或基于细胞的活性测定。根据需要，可以将α-SNAP-25抗体——该抗体可结合在SNAP-25剪切产物的ΒοΝΤ/Α剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位——的多克隆抗体从所述哺乳动物中(例如从血液中)分离并通过公知的技术例如为获得IgG部分的蛋白A亲和色谱法，或者通过对用于产生所述抗体的肽的亲和纯化进行进一步纯化。作为另一个非限制性实例，a-SNAP-25单克隆抗体——该抗体可结合在来自SNAP-25剪切产物的ΒοΝΤ/Α剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位——可使用杂交瘤方法产生。参见，例如MonoclonalAntibodies，pp.196-244,Harlow&Lane，见上文，1998a的第6章；和GrowingHybridomas,pp.245-282，Harlow&Lane，见上文，1998a的第7章；以及Goding,pp.59-103,MonoclonalAntibodiesPrinciplesandPractice,AcademicPress,(1986)。在该方法中，一般将宿主动物如小鼠、仓鼠或其他合适宿主动物暴露于本说明书中公开SNAP-25抗原的一种或多种注射剂，以诱发产生或者能够产生α-SNAP-25抗体——该抗体会特异性地结合于在所述ΒοΝΤ/Α剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25——的淋巴细胞。免疫动物中的抗体效价可通过标准技术随时间监测，例如通过使用固定抗原的酶联免疫吸附测定(ELISA)或基于细胞的活性测定。或者，可以使用合适的培养细胞系在体外免疫所述淋巴细胞。在免疫后合适的时间，例如当抗体效价最高时，从所述动物分离产生抗体的细胞。一般而言，如果需要人源的细胞则可使用外周血淋巴细胞，如果需要非人哺乳动物来源则可使用脾细胞或淋巴结细胞。使用合适的融合试剂如聚乙二醇将所分离的产生抗体的细胞与一种永生化细胞系融合，以形成杂交瘤细胞。永生化细胞系通常是转化的哺乳动物细胞，特别是啮齿类动物、牛和人源的骨髓瘤细胞。一般将鼠科动物骨髓瘤细胞系与从恰当免疫的小鼠中采集的脾细胞融合，以产生所述杂交瘤。优选的永生化细胞系是对含次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT)的培养基敏感的小鼠骨髓瘤细胞系。多种骨髓瘤细胞系的每一种均可根据标准技术用作融合伴侣，例如P3-NSl/l-Ag4-l、P3-x63-Ag8.653或Sp2/0_Agl4骨髓瘤细胞系。然后使用HAT培养基——其杀死未融合的和非增殖性融合的骨髓瘤细胞(未融合的脾细胞在培养数日后死亡，因为它们是未转化的)——来选择融合形成的杂交瘤细胞。然后，可以对培养所述杂交瘤细胞的培养基检测α-SNAP-25单克隆抗体——该抗体可结合在SNAP-25剪切产物的ΒοΝΤ/Α剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位——的存在情况。例如，可以在免疫沉淀测定、体外结合测定例如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)中，或者在基于细胞的活性测定中，使用α-SNAP-25阳性培养基筛查杂交瘤上清液。这类技术和测定是本领域中已知的。参见，例如Harlow&Lane，见上文，1998a的第11章Immunoprecipitation，第421-470页；Harlow&Lane，见上文，1998a的第12章Immunoblotting，第471-510页；Harlow&Lane，见上文，1998a的第14章Immunoassays，第553-612页。然后可进行另外的研究，以确定所述抗体是否还对在所述ΒοΝΤ/Α剪切位点易切断键的P1残基处不含羧基端的SNAP-25无反应性。还可例如通过katchard分析确定α-SNAP-25单克隆抗体的结合亲和性。参见，例如PeterJ.MunsonandDavidRodbard,Ligand:AVersatileComputerizedApproachForCharacterizationofLigand-BindingSystems,107(1)Anal.Biochem.220-239(1980)。在鉴定出需要的杂交瘤细胞后，使用有限稀释步骤来分离源自单个细胞的克隆，直至获得表达需要的单克隆抗体的克隆细胞系。选择那些对在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25有足够的选择性并以足够高的亲合力结合的抗体，用于进一步表征和研究。用于制备α-SNAP-25单克隆抗体——该抗体可结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位——的另一可选方法是通过用SNAP-25肽和分离的免疫球蛋白文库成员——该成员可结合在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25——筛查重组组合免疫球蛋白文库如抗体噬菌体展示文库。用于生成和筛查噬菌体展示文库的试剂盒可市购，例如RecombinantPhageAntibodySystem(AmershamGEHealthcare,Piscataway,NJ)；禾口SurfZAPPhageDisplayKit(Stratagene,LaJolla,CA)。另外，用于生成和筛查抗体展示文库的方法和试剂的实例可以见于例如Ladner等人，美国专利5，223，409；Borrebaeck等人，美国专利5，712,089；Griffiths等人，美国专利5，885，793；Griffiths等人，美国专利5，962，255；McCafferty等人，美国专利5，969，108；Griffiths等人，美国专利6，010，884Jespers等人，美国专利6，017，732；Borrebaeck等人，美国专利6，027，930Johnson等人，美国专利6，140，471；McCafferty等人，美国专利6，172，197，上述每一篇均通过援引的方式全文纳入本文。本公开的一些方面部分地包括，采集包含α-SNAP-25抗体或产生α-SNAP-25抗体的细胞的样品。本文使用的术语“包含α-SNAP-25抗体或产生α-SNAP-25抗体的细胞的样品”是指包含或者可能包含至少一种α-SNAP-25抗体——该抗体可结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位——的任何生物物质。可想象的是，可包含α-SNAP-25抗体——该抗体可结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位——的任一和所有样品都可用于该方法中，非限制地包括血液、血浆、血清和淋巴液。还可想象的是，能够产生α-SNAP-25抗体——该抗体可结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位——的任何细胞都可用于该方法中，所述细胞非限制地包括CD8细胞、CTL细胞、辅助T细胞和B细胞。多种公知的方法可用于从个体中采集包含所述α-SNAP-25抗体或产生α-SNAP-25抗体的细胞的样品，参见，例如Harlow&Lane，见上文，1998a；和Harlow&Lane，见上文，199汕。类似地，多种公知的方法可用于加工样品，以分离α-SNAP-25抗体——该抗体可结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位。可基于待分离的抗体的类型选择用于采集样品的方法。作为一个非限制性实例，当分离α-SNAP-25多克隆抗体——该抗体可结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位——时，合适的样品可以是包含这类α"SNAP-25抗体的血液样品，而当分离α-SNAP-25单克隆抗体——该抗体可结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位——时，合适的样品可以是产生α-SNAP-25抗体的细胞，例如脾细胞或杂交瘤细胞。本公开的一些方面部分地包括从所述样品中分离α-SNAP-25抗体——该抗体可结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位。分离这类α-SNAP-25抗体例如α-SNAP-25多克隆抗体或α-SNAP-25单克隆抗体的方法是本领域技术人员公知的，所述α-SNAP-25多克隆抗体和α-SNAP-25单克隆抗体均可结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位。参见，例如HarlowandLane，见上文，1998a；和HarlowandLane，见上文，1998b。例如，可通过公知的技术从所述样品中分离这类α"SNAP-25多克隆抗体，所述技术例如使用蛋白A或蛋白G的亲和色谱法，该方法主要提供免疫血清的IgG部分。随后或者另外，可以将特异性SNAP-25抗原固定于柱上或磁珠上，以通过免疫亲和色谱法来纯化α-SNAP-25多克隆抗体——该抗体可结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位。可通过常规的免疫球蛋白纯化方法从培养基或腹水液中分离α-SNAP-25单克隆抗体——该抗体可结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位，所述常规免疫球蛋白纯化方法例如蛋白A-琼脂糖凝胶、羟磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析或亲和色谱法。因此，在一个实施方案中，一种生产α-SNAP-25抗体——该抗体可结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位——的方法包括步骤(a)给予动物包含连接于载体肽的具有羧化C端谷氨酰胺的SNAP-25抗原的组合物；(b)从所述动物中采集包含α-SNAP-25抗体或产生α-SNAP-25抗体的细胞的样品；和(c)从所述样品分离所述α-SNAP-25抗体组分。在该实施方案的一个方面中，所述α-SNAP-25抗体——该抗体可结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位——是多克隆抗体。在该实施方案的另一方面中，α-SNAP-25抗体——该抗体可结会在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位——是单克隆抗体。在该实施方案的又一方面中，产生的α-SNAP-25单克隆抗体——该抗体可结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位——是IgG亚型。在该实施方案的其他方面中，SNAP-25组合物还包含佐剂，例如聚乙二醇(PEG)、单甲氧基聚乙二醇(mPEG)或聚乙烯醇(PVA)。在另一实施方案中，一种生产α-SNAP-25抗体——该抗体可结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位——的方法包括步骤(a)给予动物包含连接于柔性连接体和载体肽的具有羧化C端谷氨酰胺的SNAP-25抗原的组合物，其中所述柔性连接体介于所述SNAP-25肽和所述载体肽之间；(b)从所述动物采集包含α-SNAP-25抗体或产α-SNAP-25抗体的细胞的样品；和(c)从所述样品分离所述α-SNAP-25抗体。在该实施方案的一个方面中，所述α-SNAP-25抗体——该抗体可结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位——是多克隆抗体。在该实施方案的另一方面中，α-SNAP-25抗体——该抗体可结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位——是单克隆抗体。在该实施方案的又一方面中，产生的α-SNAP-25单克隆抗体——该抗体可结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位——是IgG亚型。在该实施方案的其他方面中，SNAP-25组合物还包含佐剂，例如聚乙二醇(PEG)、单甲氧基聚乙二醇(mPEG)或聚乙烯醇(PVA)。本公开的一些方面部分地包括一种分离的α-SNAP-25抗体，该抗体可选择性地结合于在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25表位。本文中使用的术语“分离的”是指通过人的介入从分子的天然环境中分离分子。本文使用的“抗体”是指由免疫系统生成的分子，该分子通过应答特定抗原而产生并可特异性地结合于该抗原，抗体包括天然抗体和非天然抗体。本文使用的术语“α-SNAP-25”与“SNAP-25抗体”同义，是指可结合于SNAP-25抗原的抗体。例如，抗体可以是多克隆抗体、单克隆抗体、二聚体、多聚体、多特异性抗体、人源化抗体、嵌合抗体、双功能抗体、细胞相关抗体如Ig受体、线式抗体、双链抗体或微抗体——只要所述片段表现出需要的生物活性——以及它们的单链衍生物。抗体可以是包含Vh和\区以及轻链恒定区(Q)和重链恒定区CH1、Ch2和Ch3的全长免疫球蛋白分子，或者全长免疫球蛋白分子的免疫活性片段，例如Fab片段、F(ab')2片段、Fc片段、Fd片段或Fv片段。抗体可源自于任何脊椎动物物种(例如人、山羊、马、驴、鼠科动物、大鼠、兔或鸡)，并且可以是任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)、类别(例如IgA,IgD,IgE,IgG和IgM)或亚类(IgGUIgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2)。对天然抗体、非天然抗体和它们的抗原性化合物结合片段的结构的一般性公开，参见例如PluckthiminThePharmacologyofMonoclonalAntibodies,vol.113,RosenburgandMooreeds.,Springer-Verlag,NewYork,pp.269-315(1994);Borrabeck,AntibodyEnRineerinR,Wi2版(OxfordUniversityPress1995)，以上每一篇均通过援引的方式全文纳入本文。天然抗体通常是约150，000道尔顿的异四体糖蛋白，由两条相同轻(L)链和两条相同重(H)链组成。每条轻链通过一个共价二硫键连接于重链，而不同免疫球蛋白同种型的重链中的二硫键的数目不同。每条重链和轻链还具有规则间隔的链内二硫键。每条重链在一端具有一个可变区(Vh)，随后是多个恒定区。每条轻链在一端具有一个可变区(\)，在其另一端具有一个恒定区。所述轻链的恒定区与所述重链的第一个恒定区对齐，所述轻链的可变区与所述重链的可变区对齐。特定的氨基酸残基被认为形成了所述轻链和重链可变区之间的界面。完整的抗原识别和抗原结合位点位于抗体可变区内，即Fv片段。该片段包括紧密非共价缔合的一个重链可变区(Vh)和一个轻链可变区的二聚体。每个区包含4个主要采取β片层构型的骨架区(FR)，这些框架区由3个超变区连接，所述超变区形成连接所述β片层结构的环，并且在一些情形下形成所述β片层结构的一部分。每个超变区包含对应于互补决定区(CDR)的氨基酸序列。总之，是所述6个CDR区的三维构型界定了所述Vh-Vl二聚体表面上的赋予抗原结合特异性的抗原结合位点。参见，例如CyrusChothia,etal.,ConformationsofImmunoglobulinHypervariableRegions,Nature342(6252)877-883(1989)；ElvinA.Kabat,etalSequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD.(1991)，以上每一篇通过援引的方式全文纳入本文。抗体恒定区并不直接参与抗体抗原结合，但呈现多种效应物功能，例如使抗体参与抗体依赖的细胞毒性。靶抗原通常具有一个或多个结合位点，也称为表位，它们可被CDR形成的抗原结合位点识别。本文中使用的“表位”与“抗原决定簇”同义，是指能够特异性地结合于免疫球蛋白或T细胞受体或者以另外的方式与一个分子相互作用的靶抗原上的位点，所述靶抗原例如肽、多糖或包含脂质的分子。特异性地结合于不同表位的每种抗体均具有不同结构。因此，一种抗原可以具有多于一种对应的抗体。多克隆抗体是指异质的抗体分子群，包含至少2种能够结合于特定抗原的抗体。根据定义，多克隆抗体包括结合至少两种不同表位的两种不同抗体。本文使用的术语“单克隆抗体”或“多个单克隆抗体”是指基本同质的抗体分子群，仅包含一种能够结合特定抗原的抗体，即除了可能微量存在的可能的天然突变之外，该群包含的各个抗体是相同的。根据定义，单克隆抗体结合于单一表位。单克隆抗体是高度特异的，针对单一抗原性位点。再者，与多克隆抗体不同，每种单克隆抗体均针对抗原上的单一决定簇。除了它们的特异性之外，单克隆抗体的优点还在于，它们可不被其他抗体污染地合成。修饰语“单克隆的”是指从基本同质的抗体群获得的抗体特征，而不可解释为需要以任何具体方法生产所述抗体。例如，可根据本公开使用的单克隆抗体可通过杂交瘤方法制备，该方法首先被Kohleretal(1975)Nature256:495记载，或者可通过重组DNA方法制备(参见，例如美国专利No.4，816，567；美国专利No.5，807，715)。还可使用例如Clacksonetal(1991)Nature,352:624-628；Marksetal(1991)J.Mol.Biol.，222:581-597中记载的技术从噬菌体抗体文库分离所述单克隆抗体。因此，在一个实施方案中，α-SNAP-25抗体包含重链可变区(Vh)和轻链可变区(Vl)，该抗体可选择性地结合于在所述ΒοΝΤ/Α剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25。在该实施方案的一个方面中，所述重链可变区(Vh)为SEQIDNO72、SEQIDNO74,SEQIDNO76,SEQIDNO80或SEQIDNO:82。在该实施方案的另一方面中，所述轻链可变区(Vl)为SEQIDNO84,SEQIDNO:86、SEQIDNO:88、SEQIDNO:90或SEQIDNO92。在另一实施方案中，α-SNAP-25抗体包含重链可变区(Vh)⑶Rl区、⑶R2区、⑶R3区或它们的任意组合，该抗体可选择性地结合于在所述ΒοΝΤ/Α剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25。在该实施方案的一个方面中，所述重链可变区(Vh)CDRI为SEQIDNO93,SEQIDNO94、SEQIDNO95、SEQIDN0:118、SEQIDNO:119或SEQIDNO:120。在该实施方案的另一方面中，所述重链可变区(Vh)⑶R2区是SEQIDNO96、SEQIDNO97,SEQIDNO98,SEQIDNO99,SEQIDNO121,SEQIDNO:122或SEQIDNO:123。仍在该实施方案的另一方面中，所述重链可变区(VHKDR3区是SEQIDNO100,SEQIDNO:101、SEQIDNO:102或SEQIDNO124。在另一实施方案中，α-SNAP-25抗体包含轻链可变区(Vl)⑶Rl区、⑶R2区、⑶R3区或它们的任意组合，该抗体可选择性地结合于在所述ΒοΝΤ/Α剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25。在该实施方案的一个方面中，所述轻链可变区(VJCDR1区是SEQIDNO:103,SEQIDNO:104、SEQIDNO:105、SEQIDNO:106、SEQIDNO:107、SEQIDNO:125,SEQIDNO126、SEQIDN0:127、SEQIDNO:128或SEQIDN0:129。在该实施方案的另一方面中，所述轻链可变区(VJCDR2区是SEQIDNO:108、SEQIDNO:109、SEQIDNO:110,SEQIDNO:111或SEQIDNO:112。仍在该实施方案的另一方面中，所述轻链可变区(VJCDR3区是SEQIDN0:113、SEQIDNO:114、SEQIDNO:115、SEQIDNO:116或SEQIDNO:117。仍在另一实施方案中，α-SNAP-25抗体特异性地结合在所述ΒοΝΤ/Α剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25的表位。在该实施方案的一个方面中，所述表位包括SEQIDNO32,SEQIDNO33,SEQIDNO34,SEQIDNO35,SEQIDNO36,SEQIDNO37,SEQIDNO:147或SEQIDNO:148。在该实施方案的一个方面中，所述表位包括SEQIDNO39,SEQIDNO:40、SEQIDNO:41、SEQIDNO42,SEQIDNO:43或SEQIDNO:44。如上文详述的，存在于SNAP-25中的ΒοΝΤ/Α剪切位点周围的序列表示为P5-P4-PS-P2-P1-P/-P2'-P/-P4'-P5'，以P1-P/代表所述易切断键。在被ΒοΝΤ/Α剪切时，所形成的剪切产物包括包含P5-P4-P3-P2-P1序列的片段和包含P1'-P2'-P3'-P/-P5'的片段。本文使用的术语“α-SNAP-25抗体——该抗体可结合在SNAP-25剪切产物的所述ΒοΝΤ/Α剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端”是指这样的α-SNAP-25抗体，即该抗体可选择性地结合于包含所述P5-P4-P3-P2-P1序列的任何SNAP-25剪切产物片段，但不结合于包含所述P1'-P2'-P3'-P/-P5'序列的任何SNAP-25剪切产物片段或者具有ΒοΝΤ/Α剪切位点的完整P1-P1'易切断键的任何SNAP-25。本文使用的术语“a-SNAP-25197抗体”是指这样的抗体，即该抗体可选择性地结合于具有对应于SEQIDNO:5的谷氨酰胺197的羧基端P1残基的SNAP-25。本文使用的术语“a-SNAP-252(I4抗体”是指这样的抗体，即该抗体可选择性地结合于具有对应于SEQIDNO16的赖氨酸204的羧基端P1残基的SNAP-25。本文使用的术语“选择性地”是指具有独特的效应或影响，或者仅以一种方式或者仅与一种物质反应。本文使用的术语“选择性地结合”在述及抗体时是指所述抗体与指定靶表位的区分性结合，结果是所述抗体基本不与非靶表位交叉反应。本文定义的肽表位的最小大小是约5个氨基酸，肽表位一般包含至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少15或至少20个氨基酸。肽表位可以是不连续的，即它包含在肽一级结构上不相邻、但通过所述肽的二级、三级或四级结构集合成表位的氨基酸残基。再者，还应指出，表位可能包含氨基酸序列之外的分子部分，例如碳水化合物部分、脂质部分如脂蛋白或糖脂，或者化学修饰的氨基酸部分如磷酸化的氨基酸。在该实施方案的一些方面中，α-SNAP-25抗体——该抗体可选择性地结合于在所述ΒοΝΤ/Α剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25表位——可选择性地结合包含至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少15或至少20个氨基酸的在所述ΒοΝΤ/Α剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25表位。在该实施方案的另一些方面中，α-SNAP-25抗体——该抗体可选择性地结合于在所述ΒοΝΤ/Α剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25表位——可选择性地结合包含至多5、至多6、至多7、至多8、至多9、至多10、至多15或至多20个氨基酸的在所述ΒοΝΤ/Α剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25表位。选择性结合包括诸如结合亲和性、结合特异性和结合亲合力的结合性质。参见DavidJ.King,ApplicationsandEngineeringofMonoclonalAntibodies,PP.240(1998)。结合亲和性是指抗体停留在其表位结合位点的时长，可以看作是抗体结合其表位的强度。结合亲和性可以描述为抗体的平衡解离常数(KD)，该常数定义为平衡时的Kd/Ka比。其中Ka是抗体的缔合速率常数，kd是抗体的解离速率常数。结合亲和性由缔合和解离共同决定，仅高缔合或低解离都不能确保高亲和性。所述缔合速率常数(Ka)或结合速率常数(Kon)测量每单位时间结合事件的数目，或者抗体和抗原可逆地缔合成其抗体-抗原复合体的倾向性。缔合速率常数以Μ"、—1表示，用符号表示如下[Ab]X[Ag]XKon。缔合速率常数越大，抗体结合于其抗体越快，或者抗体和抗原之间的结合亲和性越大。解离速率常数(Kd)或分离速率常数(Koff)测量每单位时间解离事件的数目，或者抗体-抗原复合体可逆地分离(解离)成其组分分子(即抗体和抗原)的倾向性。解离速率常数以s—1表示，用符号表示如下[Ab+Ag]XKofT。解离速率常数越小，抗体越牢固地结合于其抗原，或者抗体和抗原之间的结合亲和性越大。平衡解离常数(KD)测量平衡时形成的新抗体-抗原复合体的与抗体-抗原复合体解离速率相等的速率。平衡解离常数以M表示，定义为Koff/Kon=[Ab]X[Ag]/[Ab+Ag]，其中[Ab]是抗体的摩尔浓度，[Ag]是抗原的摩尔浓度，[Ab+Ag]是抗体-抗原复合体的摩尔浓度，其中所有浓度都是这些组分在体系平衡时的浓度。平衡解离常数越小，抗体越牢固地结合于其抗原，或者抗体和抗原之间的结合亲和性越大。因此，在一个实施方案中，α-SNAP-25抗体——该抗体可选择性地结合于在所述ΒοΝΤ/Α剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25表位——的结合亲和性可以具有例如小于IXIO5IT1s人小于IXIO6IT1s入小于IXio7Ir1S-1或者小于IXIO8JrY1的缔合速率常数。在另一实施方案中，a-SNAP-25抗体——该抗体可选择性地结合于在所述ΒοΝΤ/Α剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25表位——的结合亲和性可以具有例如大于IXIO5M-1S—1、大于IXlO6M-1S-1,大于IXIO7M"1s"1或者大于1XIO8M^1s"1的缔合速率常数。在另一些方面中，α-SNAP-25抗体——该抗体可选择性地结合于在所述ΒοΝΤ/Α剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25表位——的结合亲和性可以具有1XIO5M-1S^1-IXIO8IT1S人1XIO6M-1S^1-IXIO8IT1S人1XIO5M-1S^1-IXIO7MY1或1XIO6M"1S^1-IXΙΟΙ、—1的缔合速率常数。在另一实施方案中，α-SNAP-25抗体——该抗体可选择性地结合于在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25表位——的结合亲和性可以具有小于1XΙΟ、—1、小于1XIO-4S-1或小于1XIO-5S-1的解离速率常数。在该实施方案的另一些方面中，α-SNAP-25抗体——该抗体可选择性地结合于在所述ΒοΝΤ/Α剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25表位——的结合亲和性可以具有例如小于1.OX10_48人小于2.OXKT4S入小于3.OXKT4S入小于4.ΟΧΙΟΛΓ1、小于5.ΟΧΙΟΛΓ1、小于6.OXlO-V1,小于7.OXΙΟΛΓ1、小于8.OXΙΟΛΓ1或小于9.OXKT4s-1的解离速率常数。在另一实施方案中，α-SNAP-25抗体——该抗体可选择性地结合于在所述ΒοΝΤ/Α剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25表位——的结合亲和性可以具有例如大于1XΙΟ、—1、大于IXKT4iT1或大于IXKT5iT1的解离速率常数。在该实施方案的另一些方面中，α-SNAP-25抗体——该抗体可选择性地结合于在所述ΒοΝΤ/Α剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25表位——的结合亲和性可以具有例如大于1.OXΙΟΛΓ1、大于2.0XΙΟΛΓ1、大于3.OXl(T4s入大于4.OXl(T4s入大于5.OXΙΟΛΓ1、大于6.OXΙΟΛΓ1、大于7.OXlO-V1,大于8.OXKT4iT1或大于9.OXKT4iT1的解离速率常数。在另一实施方案中，α-SNAP-25抗体——该抗体可选择性地结合于在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25表位——的结合亲和性可以具有小于0.500nM的平衡解离常数。在该实施方案的一些方面中，α-SNAP-25抗体——该抗体可选择性地结合于在所述ΒοΝΤ/Α剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25表位——的结合亲和性可以具有例如小于0.500nM、小于0.450nM、小于0.400nM、小于0.350nM、小于0.300nM、小于0.250nM、小于0.200nM、小于0.150nM、小于0.IOOnM或小于0.050nM的平衡解离常数。在另一实施方案中，α-SNAP-25抗体——该抗体可选择性地结合于在所述ΒοΝΤ/Α剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25表位——的结合亲和性可以具有大于0.500nM的平衡解离常数。在该实施方案的一些方面中，α-SNAP-25抗体——该抗体可选择性地结合于在所述ΒοΝΤ/Α剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25表位——的结合亲和性可以具有例如大于0.500nM、大于0.450nM、大于0.400nM、大于0.350nM,大于0.300nM、大于0.250nM、大于0.200nM、大于0.150nM、大于0.IOOnM或大于0.050nM的平衡解离常数。仍在另一实施方案中，a-SNAP-25抗体——该抗体可选择性地结合于在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25表位——对完整SNAP-25的结合亲和性可以具有例如小于IXIOtlMW小于IXIO1M-1S-1A小于IXIO2M.1s—1、小于IXlO3M-1S-1或小于IXlO4M-1S-1的缔合速率常数。在另一实施方案中，α-SNAP-25抗体——该抗体可选择性地结合于在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25表位——对完整SNAP-25的结合亲和性可以具有例如至多1XΚΛ^Γ1、至多IXIO1M-1S—1、至多IXIO2IT1s人至多1XIO3M-1S-1或至多1XIO4M-1S-1的缔合速率常数。结合特异性是抗体区分包含其表位的分子和不包含该表位的分子的能力。一种测量结合特异性的方式是比较抗体对于包含其表位的分子的Kon缔合速率与抗体对于不包含该表位的分子的Kon缔合速率。例如，比较α-SNAP-25抗体对在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25表位与对不含该表位的SNAP-25的缔合速率常数(Ka)，所述不含该表位的SNAP-25例如在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处不含羧基端的SNAP-25表位，或者具有BoNT/A剪切位点的完整P1-P1'易切断键的SNAP-25表位。在该实施方案的一些方面中，α-SNAP-25抗体——该抗体可选择性地结合于在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25表位——对不包含其表位的SNAP-25具有例如小于1XIO0M1S<、小于IXIO1IT1S人小于IXio2Ir1s\小于IXIO3M1S1或小于IXIO4M-1S-1的缔合速率常数(Ka)。在该实施方案的其他方面中，α-SNAP-25抗体——该抗体可选择性地结合于在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25表位——对不包含其表位的SNAP-25具有例如至多IXKAf1s—1、至多1XIO1MW至多1XΙΟΙ、—1、至多1XΙΟΙ、—1或至多1XlOVs"1的缔合速率常数(Ka)。在该实施方案的再一些方面中，α-SNAP-25抗体——该抗体可选择性地结合于在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25表位——对其表位具有相对于对不包含该表位的SNAP-25例如至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍或至少9倍的缔合速率常数(Ka)。在该实施方案的又一些方面中，α-SNAP-25抗体一一该抗体可选择性地结合于在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25表位——对其表位具有相对于对不包含该表位的SNAP-25例如至少10倍、至少100倍、至少1，000倍或至少10，000倍的缔合速率常数(Ka)。仍在该实施方案的另一些方面中，α-SNAP-25抗体——该抗体可选择性地结合于在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25表位——对其表位具有相对于对不包含该表位的SNAP-25例如至多1倍、至多2倍、至多3倍、至多4倍、至多5倍、至多6倍、至多7倍、至多8倍或至多9倍的缔合速率常数(Ka)。仍在该实施方案的另一些方面中，α-SNAP-25抗体——该抗体可选择性地结合于在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25表位——对其表位具有相对于对不包含该表位的SNAP-25例如至多10倍、至多100倍、至多1，000倍或至多10，000倍的缔合速率常数(Ka)。α-SNAP-25抗体——该抗体可选择性地结合于在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25表位——的结合特异性还可表征为α-SNAP-25抗体可以区分其SNAP-25表位与不包含该表位的SNAP-25的这样一个比值，所述不含该表位的SNAP-25例如在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处不含羧基端的SNAP-25表位或者具有BoNT/A剪切位点的完整P1-P/易切断键的SNAP-25表位。在该实施方案的一些方面中，α-SNAP-25抗体——该抗体可选择性地结合于在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25表位——对其SNAP-25表位与对不包含该表位的SNAP-25具有例如至少21、至少31、至少41、至少51、至少641、至少71、至少81、至少91、至少101、至少151、至少201、至少251、至少301、至少351或至少401的结合特异性比。仍在该实施方案的另一些方面中，α-SNAP-25抗体——该抗体可选择性地结合于在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25表位——对其SNAP-25表位与对在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处不含羧基端的SNAP-25具有例如至少21、至少31、至少41、至少51、至少61、至少71、至少81、至少91、至少101、至少151、至少201、至少251、至少301、至少351或至少401的结合特异性比。又在该实施方案的另一些方面中，α-SNAP-25抗体——该抗体可选择性地结合于在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25表位——对其SNAP-25表位与对具有BoNT/A剪切位点的完整？工寸/易切断键的SNAP-25具有例如至少21、至少31、至少41、至少51、至少641、至少71、至少81、至少91、至少101、至少151、至少201、至少251、至少301、至少351或至少401的结合特异性比。结合亲合力(也称为功能性亲和性)是指多价抗体和其抗原之间的功能性结合强度的总和。抗体分子可以具有不止一个结合位点(例如IgG有2个，IgM有10个)，并且许多抗原包含不止一个抗原性位点。虽然抗体的结合亲合力取决于各个抗体结合位点的结合亲和性，但结合亲合力大于结合亲和性，因为要完全解离抗体必须使所有抗体-抗原相互作用同时断裂。可想象的是，α-SNAP-25抗体一一该抗体可选择性地结合于在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25表位——可选择性地结合于该抗体相应的任一和所有表位。因此，在一个实施方案中，α-SNAP-25抗体是这样的α-SNAP-25抗体，即该抗体可选择性地结合于在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25表位。在该实施方案的一些方面中，α-SNAP-25抗体是这样的α-SNAP-25抗体，即该抗体可选择性地结合于具有羧基端谷氨酰胺的SNAP-25表位，或者可选择性地结合于具有羧基端赖氨酸的SNAP-25表位。在该实施方案的另一些方面中，α-SNAP-25抗体是这样的α-SNAP-25抗体，即该抗体可选择性地结合于具有对应于SEQIDNO5的谷氨酰胺197的羧基端P1残基的SNAP-25表位，或者可选择性地结合于具有对应于SEQIDN0:16的赖氨酸204的羧基端P1残基的SNAP-25表位。又在该实施方案的另一些方面中，α-SNAP-25抗体是这样的α-SNAP-25抗体，即该抗体可选择性地结合于具有SEQIDNO32、SEQIDNO:33、SEQIDNO34,SEQIDN0:35、SEQIDNO36,SEQIDNO37、SEQIDNO39,SEQIDN0:40、SEQIDNO:41、SEQIDNO:42、SEQIDNO:43、SEQIDNO:44、SEQIDNO:147或SEQIDNO148的羧基端氨基酸序列的SNAP-25表位。本公开的一些方面部分地包括一种基于免疫的检测BoNT/A活性的方法。本说明书中公开的基于免疫的方法可通过数个参数进行评估，所述参数包括例如准确度、精度、检出限(LOD)、定量限(LOQ)、范围、特异性、选择性、线性、耐用性和系统适用性。方法的准确度是分析方法的正确性的度量，或者测量值与通常公认的真实值或公认参考值之间相符的22接近度。方法的精度是当将方法重复地应用于同质样品的多次采样时，各个试验结果之间相符的程度。照此，精度可评估1)测定内变异性；2)日内变异性(重复性)；和幻日间变异性(中间精度)；以及4)实验室间精度(再现性)。变异系数(CV%)是相对于观测或理论平均值表达的精度的定量量度。本说明书中公开的一种基于免疫的方法必须能够检测包含具有在BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25的α-SNAP-25抗体-抗原复合体相对于背景的存在情况。方法的检出限(LOD)是指开始给出明显不同于阴性对照或空白对照的信号的分析物的浓度，代表可以与背景区分开的分析物的最低浓度。因此，在一个实施方案中，本说明书中公开的基于免疫的方法可以检测其量明显不同于阴性对照或空白对照的BoNT/A的L0D。在该实施方案的一个方面中，本说明书中公开的基于免疫的方法具有例如IOng或更少、9ng或更少、8ng或更少、7ng或更少、6ng或更少、5ng或更少、4ng或更少、3ng或更少、2ng或更少、Ing或更少的BoNT/A的LOD。又在该实施方案的另一些方面中，本说明书中公开的基于免疫的方法具有例如900pg或更少、SOOpg或更少、700pg或更少、600pg或更少、500pg或更少、400pg或更少、300pg或更少、200pg或更少、IOOpg或更少的BoNT/A的LOD。在该实施方案的又一些方面中，本说明书中公开的基于免疫的方法具有例如90pg或更少、80pg或更少、70pg或更少、60pg或更少、50pg或更少、40pg或更少、30pg或更少、20pg或更少、IOpg或更少的BoNT/A的L0D。在该实施方案的另一些方面中，本说明书中公开的基于免疫的方法具有例如9pg或更少、8pg或更少、7pg或更少、6pg或更少、5pg或更少、4pg或更少、3pg或更少、2pg或更少、Ipg或更少的BoNT/A的L0D。仍在该实施方案的另一些方面中，本说明书中公开的基于免疫的方法具有例如0.9pg或更少、0.8pg或更少、0.7pg或更少、0.6pg或更少、0.5pg或更少、0.4pg或更少、0.3pg或更少、0.2pg或更少、0.Ipg或更少的BoNT/A的LOD。在该实施方案的另一方面中，本说明书中公开的基于免疫的方法具有例如IOnM或更少、9nM或更少、8nM或更少、7nM或更少、6nM或更少、5nM或更少、4nM或更少、3nM或更少、2nM或更少或者InM或更少的BoNT/A的L0D。在该实施方案的另一些方面中，本说明书中公开的基于免疫的方法具有例如900pM或更少、800pM或更少、700pM或更少、600pM或更少、500pM或更少、400pM或更少、300pM或更少、200pM或更少或者IOOpM或更少的BoNT/A的L0D。在该实施方案的另一些方面中，本说明书中公开的基于免疫的方法具有例如IOOpM或更少、90pM或更少、80pM或更少、70pM或更少、60pM或更少、50pM或更少、40pM或更少、30pM或更少、20pM或更少或者IOpM或更少的BoNT/A的LOD。仍在该实施方案的另一些方面中，本说明书中公开的基于免疫的方法具有例如IOpM或更少的BoNT/A，9pM或更少、8pM或更少、7pM或更少、6pM或更少、5pM或更少、4pM或更少、3pM或更少、2pM或更少或者IpM或更少的BoNT/A的L0D。又在该实施方案的另一些方面中，本说明书中公开的基于免疫的方法具有例如IOOOfM或更少、900fM或更少、800fM或更少、700fM或更少、600fM或更少、500fM或更少、400fM或更少、300fM或更少、200fM或更少或者IOOfM或更少的BoNT/A的LOD。又在该实施方案的另一些方面中，本说明书中公开的基于免疫的方法具有例如IOOfM或更少、90fM或更少、80fM或更少、70fM或更少、60fM或更少、50fM或更少、40fM或更少、30fM或更少、20fM或更少或者IOfM或更少的BoNT/A的L0D。又在该实施方案的另一些方面中，本说明书中公开的基于免疫的方法具有例如IOfM或更少、9fM或更少、8fM或更少、7fM或更少、6fM或更少、5fM或更少、4fM或更少、3fM或更少、2fM或更少或者IfM或更少的肉毒神经毒素A的L0D。定量限(LOQ)是可以以可接受的准确度和精度水平测量的样品或样本中的分析物的最低和最高浓度。定量下限是指检测方法始终可以从背景中测量出的最低剂量。定量上限是指检测方法在信号饱和之前始终可以测量出的最高剂量。所述方法的线性范围是定量上限和下限之间的区域。线性范围通过定量上限减去定量下限计算。本文使用的术语“下限的信噪比”是指所述方法在检测下限检出的信号除以背景信号。本文使用的术语“上限的信噪比”是指所述方法在检测上限检出的信号除以背景信号。因此，在一个实施方案中，本说明书中公开的基于免疫的方法可以检测其量明显不同于阴性对照或空白对照的BoNT/A的L0Q。在该实施方案的方面中，本说明书中公开的基于免疫的方法具有例如IOng或更少、9ng或更少、8ng或更少、7ng或更少、6ng或更少、5ng或更少、4ng或更少、3ng或更少、2ng或更少、Ing或更少的BoNT/A的L0Q。又在该实施方案的另一些方面中，本说明书中公开的基于免疫的方法具有例如900pg或更少、SOOpg或更少、700pg或更少、600pg或更少、500pg或更少、400pg或更少、300pg或更少、200pg或更少、IOOpg或更少的BoNT/A的L0Q。在该实施方案的又一些方面中，本说明书中公开的基于免疫的方法具有例如90pg或更少、80pg或更少、70pg或更少、60pg或更少、50pg或更少、40pg或更少、30pg或更少、20pg或更少、IOpg或更少的BoNT/A的L0Q。在该实施方案的另一些方面中，本说明书中公开的基于免疫的方法具有例如9pg或更少、Spg或更少、7pg或更少、6pg或更少、5pg或更少、4pg或更少、3pg或更少、2pg或更少、Ipg或更少的BoNT/A的LOQ0仍在该实施方案的另一些方面中，本说明书中公开的基于免疫的方法具有例如0.9pg或更少、0.8pg或更少、0.7pg或更少、0.6pg或更少、0.5pg或更少、0.4pg或更少、0.3pg或更少、0.2pg或更少、0.Ipg或更少的BoNT/A的LOQ。在该实施方案的另一方面中，本说明书中公开的基于免疫的方法具有例如IOnM或更少、9nM或更少、8nM或更少、7nM或更少、6nM或更少、5nM或更少、4nM或更少、3nM或更少、2nM或更少或者InM或更少的BoNT/A的L0Q。在该实施方案的另一些方面中，本说明书中公开的基于免疫的方法具有例如900pM或更少、800pM或更少、700pM或更少、600pM或更少、500pM或更少、400pM或更少、300pM或更少、200pM或更少或者IOOpM或更少的BoNT/A的LOQ0在该实施方案的另一些方面中，本说明书中公开的基于免疫的方法具有例如IOOpM或更少、90pM或更少、80pM或更少、70pM或更少、60pM或更少、50pM或更少、40pM或更少、30pM或更少、20pM或更少或者IOpM或更少的BoNT/A的L0Q。仍在该实施方案的另一些方面中，本说明书中公开的基于免疫的方法具有例如IOpM或更少的BoNT/A，9pM或更少、8pM或更少、7pM或更少、6pM或更少、5pM或更少、4pM或更少、3pM或更少、2pM或更少或者IpM或更少的BoNT/A的L0Q。又在该实施方案的另一些方面中，本说明书中公开的基于免疫的方法具有例如IOOOfM或更少、900fM或更少、800fM或更少、700fM或更少、600fM或更少、500fM或更少、400fM或更少、300fM或更少、200fM或更少或者IOOfM或更少的BoNT/A的L0Q。又在该实施方案的另一些方面中，本说明书中公开的基于免疫的方法具有例如IOOfM或更少、90fM或更少、80fM或更少、70fM或更少、60fM或更少、50fM或更少、40fM或更少、30fM或更少、20fM或更少或者IOfM或更少的BoNT/A的L0Q。又在该实施方案的另一些方面中，本说明书中公开的基于免疫的方法具有例如IOfM或更少、9fM或更少、8fM或更少、7fM或更少、6fM或更少、5fM或更少、4fM或更少、3fM或更少、2fM或更少或者IfM或更少的BoNT/A的LOQ。可用于实施本公开的方法的一个方面的基于免疫的测定必须具有不超过50%的精度。在该实施方案的一些方面中，基于免疫的测定有不超过50%、不超过40%、不超过30%或者不超过20%的精度。在该实施方案的另一些方面中，基于免疫的测定有不超过15%、不超过10%或者不超过5%的精度。在该实施方案的另一些方面中，基于免疫的测定有不超过4%、不超过3%、不超过2%或者不超过的精度。可用于实施本公开的方法的一个方面的基于免疫的测定必须具有至少50%的准确度。在该实施方案的一些方面中，基于免疫的测定有至少50%、至少60%、至少70%或至少80%的准确度。在该实施方案的另一些方面中，基于免疫的测定有至少85%、至少90%或至少95%的准确度。在该实施方案的另一些方面中，基于免疫的测定有至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的准确度。本说明书中公开的基于免疫的方法必须具有统计上显著的下限信噪比，和具有统计上显著的上限信噪比。在该实施方案的一些方面中，本说明书中公开的基于免疫的方法具有例如至少31、至少41、至少51、至少61、至少71、至少81、至少91、至少101、至少151或至少201的下限信噪比。在该实施方案的另一些方面中，基于免疫的方法具有例如至少101、至少151、至少201、至少251、至少301、至少351、至少401、至少451、至少501、至少601、至少701、至少801、至少901、至少1001、至少1501、至少2001、至少2501、至少3001、至少；3501、至少4001、至少4501、至少5001、至少5501或至少6001的上限信噪比。方法的特异性定义了所述方法为排除其他相关组分例如部分活性的分析物或无活性的分析物而测量目的分析物的能力。方法的选择性描述了分析方法区分样品中不同物质的能力。方法的线性是所述方法得出与所述样品中分析物浓度成正比或者通过定义明确的数学变换而成比例的结果的能力。因此，在一个实施方案中，本说明书中公开的基于免疫的方法可以区分部分活化的BoNT/A与完全活化的BoNT/A，所述部分活化的BoNT/A具有例如70%或更少、60%或更少、50%或更少、40%或更少、30%或更少、20%或更少或者10%或更少的完全活化BoNT/A的活性。所述方法的耐用性是在正常(但可变的)试验条件下对相同样品获得的测试结果的再现性。方法的鲁棒性是对所述方法不受方法参数的小而有意的改变影响的能力的量度，并提供了所述方法在正常使用中的可靠性的指示。因此，耐用性可评估不可避免的变化，而鲁棒性可评估有意的改变。用耐用性和鲁棒性评价的一般参数包括冻/融的影响、孵育时间、孵育温度、试剂寿命、样品制备、样品保存、细胞传代数、毒素批次、纯化间变异和切刻(nicking)反应间变异。基于细胞的测定的鲁棒性参数包括细胞库(冷冻的开始、中期和终末)、细胞传代水平、细胞接种密度、细胞原种密度(培养天数)、烧瓶中的细胞年龄(接种的等待时间)、孵育时间、不同的板、过量的血清和试剂来源。方法的系统适用性是通过分析参比标准确定随时间的测定性能(包括试剂性能和仪器性能)。系统适用性在FDA指导中就以下事实进行了强调设备、电子器件、测定性能和待分析的样品组成一个整合的系统。系统适用性可以通过平行性测试进行评估，也就是在将对数剂量相对于反应作图时，参照的连续稀释和样品的连续稀释应给出平行的曲线。本公开的一些方面部分地包括来自已建立细胞系的细胞。本文使用的术语“细胞”是指对由BoNT/A引起的BoNT/A中毒敏感的任何真核生物细胞，或者可以摄取BoNT/A的任何真核生物细胞。术语细胞涵盖来自多种生物的细胞，例如鼠科动物细胞、大鼠细胞、猪细胞、牛细胞、马细胞、灵长类细胞和人细胞；来自多种细胞类型的细胞，例如神经细胞和非神经细胞；并且可从异质细胞群、组织或生物体分离或者为它们的一部分。本文使用的术语“已建立细胞系”与“永生化细胞系”或“转化细胞系”同义，是指从源自生物体、组织或器官来源的细胞群中选择用于无限增殖的细胞的细胞培养物。根据定义，已建立细胞系排除了原代细胞的细胞培养物。本文使用的术语“原代细胞”是直接从新鲜组织或器官采集的细胞，不具备无限增殖的能力。已建立细胞系可以包括异质细胞群或均质细胞群。源自单细胞的已建立细胞系被称为克隆细胞系。已建立细胞系可以是这样的细胞系，即其细胞内源性地表达细胞进行全部细胞机制——藉此机制，BoNT/A可蛋白酶解剪切SNAP-25底物，并且该机制涵盖BoNT/A与BoNT/A受体的结合、神经毒素/受体复合体的内化、BoNT/A轻链从细胞内囊泡至细胞质的易位以及SNAP-25的蛋白酶解剪切——必需的所有组分。或者，已建立细胞系可以是这样的细胞系，即其细胞已从外源导入至少一种对所述细胞进行全部细胞机制——藉此机制，BoNT/A可蛋白酶解剪切SNAP-25底物，并且该机制涵盖BoNT/A与BoNT/A受体的结合、神经毒素/受体复合体的内化、BoNT/A轻链从细胞内囊泡至细胞质的易位以及SNAP-25的蛋白酶解剪切一一必需的组分。还要提及的是通过遗传工程建立的细胞系，来自这种已建立细胞系的细胞可以表达例如外源性FGFR2、外源性FGFR3、外源性SV2、外源性SNAP-25或者它们的任意组合。本公开的一些方面部分地包括一种来自对BoNT/A中毒敏感的已建立细胞系的细胞。本文使用的术语“对BoNT/A中毒敏感的细胞”、“对由BoNT/A引起的BoNT/A中毒敏感的细胞”或“来自对由BoNT/A引起的BoNT/A中毒敏感的已建立细胞系的细胞”是指可以进行全部细胞机制一一藉此机制，BoNT/A可蛋白酶解剪切SNAP-25底物，并且该机制涵盖BoNT/A与BoNT/A受体的结合、神经毒素/受体复合体的内化、BoNT/A轻链从细胞内囊泡至细胞质的易位以及SNAP-25的蛋白酶解剪切——的细胞。根据定义，对BoNT/A中毒敏感的细胞必须表达或者被工程化以表达至少一种BoNT/A受体和至少一种SNAP-25底物。本文使用的术语“可以摄取BoNT/A的细胞”或“可以摄取BoNT/A的已建立细胞系包含的细胞”是指可以进行全部细胞机制——藉此机制，BoNT/A可蛋白酶解剪切SNAP-25底物，并且该机制涵盖BoNT/A与BoNT/A受体的结合、神经毒素/受体复合体的内化、BoNT/A轻链从细胞内囊泡至细胞质的易位以及SNAP-25的蛋白酶解剪切——的细胞。根据定义，可以摄取BoNT/A的细胞必须表达或者被工程化以表达至少一种BoNT/A受体和至少一种SNAP-25底物。因此，在一个实施方案中，来自已建立细胞系的细胞对BoNT/A中毒是敏感的。在该实施方案的一些方面中，来自已建立细胞系的细胞对由例如约500pM或更少、约400pM或更少、约300pM或更少、约200pM或更少或者约IOOpM或更少的BoNT/A引起的BoNT/A中毒是敏感的。在该实施方案的另一些方面中，来自已建立细胞系的细胞对由例如约90pM或更少、约80pM或更少、约70pM或更少、约60pM或更少、约50pM或更少、约40pM或更少、约30pM或更少、约20pM或更少或者约IOpM或更少的BoNT/A引起的BoNT/A中毒是敏感的。26又在另一些方面中，来自已建立细胞系的细胞对由例如约9pM或更少、约8pM或更少、约7pM或更少、约6pM或更少、约5pM或更少、约4pM或更少、约3pM或更少、约2pM或更少或者约IpM或更少的BoNT/A引起的BoNT/A中毒是敏感的。仍在另一些方面中，来自已建立细胞系的细胞对由例如约0.9pM或更少、约0.8pM或更少、约0.7pM或更少、约0.6pM或更少、约0.5pM或更少、约0.4pM或更少、约0.3pM或更少、约0.2pM或者约0.IpM或更少的BoNT/A引起的BoNT/A中毒是敏感的。本文使用的术语“约”在修饰陈述项目、数目、百分数或条件的值时，是指所陈述项目、数目、百分数或条件的值加减百分之十的范围。在另一实施方案中，已建立细胞系包含的细胞可以摄取BoNT/A。在该实施方案的一些方面中，已建立细胞系包含的细胞可以摄取例如约500pM或更少、约400pM或更少、约300pM或更少、约200pM或更少或者约IOOpM或更少的BoNT/A。在该实施方案的另一些方面中，已建立细胞系包含的细胞具有摄取约90pM或更少、约80pM或更少、约70pM或更少、约60pM或更少、约50pM或更少、约40pM或更少、约30pM或更少、约20pM或更少或者约IOpM或更少的BoNT/A的能力。还在另一些方面中，已建立细胞系包含的细胞具有摄取约9pM或更少、约8pM或更少、约7pM或更少、约6pM或更少、约5pM或更少、约4pM或更少、约3pM或更少、约2pM或更少或者约IpM或更少的BoNT/A的能力。仍在另一些方面中，已建立细胞系包含的细胞具有摄取约0.9pM或更少、约0.8pM或更少、约0.7pM或更少、约0.6pM或更少、约0.5pM或更少、约0.4pM或更少、约0.3pM或更少、约0.2pM或更少或者约0.IpM或更少的BoNT/A的能力。本公开的一些方面部分地包括BoNT/A。本文使用的术语“BoNT/A”与“血清型A肉毒神经毒素”或“A型肉毒杆菌神经毒素”同义，是指天然BoNT/A和非天然BoNT/A，除了包括约150kDa的BoNT/A神经毒素自身之外，还包括包含约150kDa的BoNT/A神经毒素和关联的非毒素相关蛋白(NAP)的BoNT/A复合体。BoNT/A复合体的非限制性实例包括例如900-kDa的BoNT/A复合体、500_kDa的BoNT/A复合体、300_kDa的BoNT/A复合体。约150kDa的BoNT/A神经毒素的非限制性实例包括例如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4。本文使用的术语“天然BoNT/A”是指通过天然过程产生的任何BoNT/A，非限制地包括从翻译后修饰、可变剪接转录或自发突变产生的BoNT/A异型体(isoform)；以及BoNT/A亚型，例如BoNT/A1亚型、BoNT/A2亚型、BoNT/A3亚型、BoNT/A4亚型和BoNT/A5亚型。天然BoNT/A非限制地包括SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO4，或者从SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3或SEQIDNO4置换、缺失或添加例如1个或更多、2个或更多、3个或更多、4个或更多、5个或更多、6个或更多、7个或更多、8个或更多、9个或更多、10个或更多、20个或更多、30个或更多、40个或更多、50个或更多或者100个氨基酸而得到的序列。可市购的天然BoNT/A的药物组合物非限制地包括BOTOX(Allergan,Inc.，Irvine,CA),DYSPORT/RELOXIN(IpsenLtd.，Slough,England)、PURTOX(MentorCorp.，SantaBarbara,CA)、XEOMIN(MerzPharmaceuticals,GmbH.,Frankfurt,Germany)、NEURONOX(Medy-Tox,Inc.,Ochang-myeon,SouthKorea)或BTX-A。本文使用的术语“非天然BoNT/A”是指其结构借助人的操作被修饰的任何BoNT/A，非限制地包括通过使用随机诱变或合理设计的遗传工程产生的氨基酸序列27被改变的BoNT/A；或者通过体外化学合成产生的BoNT/A。非天然BoNT/A的非限制性实例记载于例如Steward,L.Ε.etal.,Post-translationalModificationsandClostridialNeurotoxins,__#^lJ7,223,577；Dolly,J.0.etal.,ActivatableClostridialToxins,美国专禾丨JNo.7,419,676；Steward,L.Ε.etal.,ClostridialNeurotoxincompositionsandModifiedClostridialNeurotoxins,US2004/0220386；Steward,L.E.etal.,ModifiedClostridialToxinsWithEnhancedTargetingCapabilitiesForEndogenousClostridialToxinReceptorSystems,美国专利公开文^No.2008/0096248；Steward,L.Ε.etal.,ModifiedClostridialToxinsWithAlteredTargetingCapabilitiesForClostridialToxinTargetCells，美m禾公开文*No.2008/0161543；Steward,L.Ε.etal.,ModifiedClostridialToxinsWithEnhancedTranslocationCapabilitiesandAlteredTargetingActivityForClostridialToxinTargetCells，美国专利公开文本Να2008/0M1881中，以上每一篇均通过援引的方式全文纳入本文。因此，在一个实施方案中，所要检测的BoNT/A活性来自天然BoNT/A。在该实施方案的一些方面中，所要检测的BoNT/A活性来自BoNT/A异型体或BoNT/A亚型。在该实施方案的一些方面中，所要检测的BoNT/A活性来自SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO3或SEQIDNO:4的BoNT/A。在该实施方案的另一些方面中，所要检测的BoNT/A活性来自与SEQIDN0:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3或SEQIDNO:4具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸同一性的BoNT/A。在该实施方案的另一些方面中，所要检测的BoNT/A活性来自BOTOX,DYSPORT/RELOXIN、PURTOX’、XEOMIN、NEURONOX或btxA。在另一实施方案中，所要检测的BoNT/A活性来自非天然BoNT/A。在该实施方案的另一些方面中，所要检测的BoNT/A活性来自与SEQIDNO=USEQIDNO:2、SEQIDNO:3或SEQIDNO:4具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸同一性的非天然BoNT/A变体。在该实施方案的另一些方面中，所要检测的BoNT/A活性来自相对于SEQIDNO=USEQIDNO:2、SEQIDNO3或SEQIDNO4具有例如1个或更多、2个或更多、3个或更多、4个或更多、5个或更多、6个或更多、7个或更多、8个或更多、9个或更多、10个或更多、20个或更多、30个或更多、40个或更多、50个或更多或者100个或更多非连续氨基酸置换、缺失或添加的非天然BoNT/A变体。仍在该实施方案的另一些方面中，所要检测的BoNT/A活性来自相对于SEQIDN0:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3或SEQIDNO:4具有例如1个或更多、2个或更多、3个或更多、4个或更多、5个或更多、6个或更多、7个或更多、8个或更多、9个或更多、10个或更多、20个或更多、30个或更多、40个或更多、50个或更多或者100个或更多连续氨基酸置换、缺失或添加的非天然BoNT/A变体。本公开的一些方面部分地包括SNAP-25。本文使用的术语“SNAP-25”是指优先被BoNT/A剪切的天然SNAP-25或非天然SNAP-25。本文使用的术语“优先被......剪切”是指，BoNT/A对BoNT/A底物的剪切速率比BoNT/A对任何其他底物的剪切速率高至少1个数量级。在该实施方案的一些方面中，BoNT/A对BoNT/A底物的剪切速率比BoNT/A对任何其他底物的剪切速率高至少2个数量级、高至少3个数量级、高至少4个数量级或者高至少5个数量级。本文使用的术语“天然SNAP-25”是指通过天然过程产生的任何SNAP-25，非限制地包括从翻译后修饰、可变剪接转录或自发突变产生的SNAP-25异型体，以及SNAP-25亚型。天然SNAP-25非限制地包括SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO8、SEQIDNO9,SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20,SEQIDNO:21、SEQIDNO:22,SEQIDNO:23或SEQIDN0:24，或者从SEQIDNO:5、SEQIDNO:6,SEQIDN0:7、SEQIDN0:8、SEQIDN0:9、SEQIDNO:10,SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO23或SEQIDNO24置换、缺失或添加例如1个或更多、2个或更多、3个或更多、4个或更多、5个或更多、6个或更多、7个或更多、8个或更多、9个或更多、10个或更多、20个或更多、30个或更多、40个或更多、50个或更多或者100个或更多氨基酸而得到的序列。本文使用的术语“非天然SNAP-25”是指其结构借助人的操作被修饰的任何SNAP-25，非限制地包括通过使用随机诱变或合理设计的遗传工程产生的SNAP-25；或者通过体外化学合成产生的SNAP-25。非天然SNAP-25的非限制性实例记载于例如Meward，L.Ε.etal.,FRETProteaseAssaysforClostridialToxins,美国专利7,332,567；Fernandez-Salasetal.,LipohilicDye-basedFRETAssaysforClostridialToxinActivity，美国专利公开文本2008/0160561，以上每一篇均通过援引的方式全文纳入本文。非天然SNAP-25可以从SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO9,SEQIDNO10,SEQIDNO:1USEQIDNO12,SEQIDNO13,SEQIDNO14,SEQIDNO15,SEQIDNO16,SEQIDNO17,SEQIDNO18,SEQIDNO19,SEQIDNO20、SEQIDN0:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23或SEQIDNOJ4置换、缺失或添加例如1个或更多、2个或更多、3个或更多、4个或更多、5个或更多、6个或更多、7个或更多、8个或更多、9个或更多、10个或更多、20个或更多、30个或更多、40个或更多、50个或更多或者100个或更多氨基酸。因此，在一个实施方案中，SNAP-25是天然SNAP-25。在该实施方案的一些方面中，所述SNAP-25是SNAP-25异型体或SNAP-25亚型。在该实施方案的一些方面中，所述天然SNAP-25是SEQIDNO5,SEQIDN0:6、SEQIDN0:7、SEQIDN0:8、SEQIDN0:9、SEQIDNO:10,SEQIDN0:11、SEQIDNO:12,SEQIDNO:13,SEQIDNO:14、SEQIDNO:15,SEQIDNO:16,SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22,SEQIDNO:23或SEQIDNO:24的天然SNAP-25。在该实施方案的另一些方面中，所述SNAP-25是与SEQIDN0:5、SEQIDN0:6、SEQIDN0:7、SEQIDN0:8、SEQIDNO:9,SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15,SEQIDNO:16,SEQIDNO:17,SEQIDNO:18,SEQIDNO:19,SEQIDNO:20、SEQIDNO:21,SEQIDNO:22、SEQIDNO:23或SEQIDNO:具有例如至少70%氨基酸同一性、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸同一性的天然SNAP-25。在另一实施方案中，SNAP-25是非天然SNAP-25。在该实施方案的另一些方面中，所述SNAP-25是与SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO3或SEQIDNO4具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸同一性的非天然SNAP-25。在该实施方案的另一些方面中，所述SNAP-25是相对于SEQIDNO:5、SEQIDNO:6,SEQIDNO:7,SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10,SEQIDNO=IUSEQIDNO:12,SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19,SEQIDNO:20,SEQIDN0:21、SEQIDNO:22,SEQIDNO:23或SEQIDNO24具有例如1个或更多、2个或更多、3个或更多、4个或更多、5个或更多、6个或更多、7个或更多、8个或更多、9个或更多、10个或更多、20个或更多、30个或更多、40个或更多、50个或更多或者100个或更多非连续氨基酸置换、缺失或添加的非天然SNAP-25。仍在该实施方案的另一些方面中，所述SNAP-25是相对于SEQIDNO:5、SEQIDN0:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8,SEQIDN0:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO=IUSEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20,SEQIDNO:21、SEQIDNO:22,SEQIDNO:23或SEQIDNO:24具有例如1个或更多、2个或更多、3个或更多、4个或更多、5个或更多、6个或更多、7个或更多、8个或更多、9个或更多、10个或更多、20个或更多、30个或更多、40个或更多、50个或更多或者100个或更多连续氨基酸置换、缺失或添加的非天然SNAP-25。SNAP-25可以是内源性SNAP-25或外源性SNAP-25。本文使用的术语“内源性SNAP-25”是指天然存在于细胞中的SNAP-25，因为它天然地在所述细胞的基因组中被编码，使得所述细胞固有地表达所述SNAP-25，而不需要外源SNAP-25或者编码SNAP-25的外源遗传物质。内源性SNAP-25的表达可以需要也可以不需要环境刺激例如细胞分化。根据定义，内源性SNAP-25只能是天然SNAP-25或其变体。例如，如下已建立细胞系表达内源性SNAP-25:BE(2)-M17、Kelly、LAl_55n、N1E-115、N4TG3、N18、Neuro_2a、NG108-15、PC12、SH-SY5Y、SiMa和SK-N-BE(2)-C。本文使用的术语“外源性SNAP-25”是指通过人的操作导入外源性SNAP-25或编码SNAP-25的外源性遗传物质而在细胞中表达的SNAP-25。外源性SNAP-25的表达可以需要也可以不需要环境刺激，例如细胞分化。作为一个非限制性实例，来自已建立细胞系的细胞可以通过SNAP-25的瞬时或稳定转染而表达外源性SNAP-25。作为另一个非限制性实例，来自已建立细胞系的细胞可以通过SNAP-25的蛋白转染而表达外源性SNAP-25。外源性SNAP-25可以是天然SNAP-25或其变体，或者非天然SNAP-2或其变体。因此，在一个实施方案中，来自已建立细胞系的细胞可表达内源性SNAP-25。在该实施方案的一些方面中，由来自已建立细胞系的细胞表达的内源性SNAP-25是天然SNAP-25。在该实施方案的另一些方面中，由来自已建立细胞系的细胞表达的内源性SNAP-25是SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO10,SEQIDNO=IUSEQIDNO12,SEQIDNO13,SEQIDNO14、SEQIDNO15,SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO22,SEQIDNO23或SEQIDNO:24。在该实施方案的再一些方面中，由来自已建立细胞系的细胞表达的内源性SNAP-25是天然SNAP-25，例如SNAP-25异型体或SNAP-25亚型。在该实施方案的另一些方面中，由来自已建立细胞系的细胞表达的内源性SNAP-25是与SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO10、SEQIDNO11,SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO22,SEQIDNO23或SEQIDNO:具有例如至少70%氨基酸同一性、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸同一性的天然SNAP-25。在另一实施方案中，来自已建立细胞系的细胞被瞬时或稳定地工程化以表达外源性SNAP-25。在该实施方案的一个方面中，来自已建立细胞系的细胞被瞬时或稳定地工程化以表达天然SNAP-25。在该实施方案的另一些方面中，来自已建立细胞系的细胞被瞬时或稳定地工程化以表达SEQIDNO5,SEQIDN0:6、SEQIDN0:7、SEQIDN0:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21,SEQIDNO:22、SEQIDNO:23或SEQIDNO:24的天然SNAP-25。仍在该实施方案的另一些方面中，来自已建立细胞系的细胞被瞬时或稳定地工程化以表达天然SNAP-25，例如SNAP-25异型体或SNAP-25亚型。又在该实施方案的另一些方面中，来自已建立细胞系的细胞被瞬时或稳定地工程化以表达与SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO8,SEQIDNO9,SEQIDNO10、SEQIDNO=IUSEQIDNO12,SEQIDNO13、SEQIDN0:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO20,SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO23或SEQIDNO24具有例如至少70%氨基酸同一性、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸同一性的天然SNAP-250在该实施方案的另一方面中，来自已建立细胞系的细胞被瞬时或稳定地工程化以表达非天然SNAP-25。在该实施方案的另一些方面中，来自已建立细胞系的细胞被瞬时或稳定地工程化以表达与SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO9,SEQIDNO10、SEQIDN0:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15,SEQIDNO:16,SEQIDNO:17,SEQIDNO:18,SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23或SEQIDNO:24具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸同一性的非天然SNAP-25。在该实施方案的另一些方面中，来自已建立细胞系的细胞被瞬时或稳定地工程化以表达相对于SEQIDNO5,SEQIDN0:6、SEQIDNO7,SEQIDN0:8、SEQIDN0:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12,SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17,SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23或SEQIDNO:具有例如1个或更多、2个或更多、3个或更多、4个或更多、5个或更多、6个或更多、7个或更多、8个或更多、9个或更多、10个或更多、20个或更多、30个或更多、40个或更多、50个或更多或者100个或更多非连续氨基酸置换、缺失或添加的非天然SNAP-25。仍在该实施方案的另一些方面中，来自已建立细胞系的细胞被瞬时或稳定地工程化以表达相对于SEQIDNO5,SEQIDN0:6、SEQIDN0:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21,SEQIDNO:22、SEQIDNO:23或SEQIDNO:24具有例如1个或更多、2个或更多、3个或更多、4个或更多、5个或更多、6个或更多、7个或更多、8个或更多、9个或更多、10个或更多、20个或更多、30个或更多、40个或更多、50个或更多或者100个或更多连续氨基酸置换、缺失或添加的非天然SNAP-25。31检测BoNT/A底物在暴露于BoNT/A后的剪切的测定可用于评估细胞是否表达内源性或外源性SNAP-25。在这些测定中，SNAP-25剪切产物的生成会在BoNT/A处理后的表达SNAP-25的细胞中检测到。成熟的试剂、条件和方案以及具体蛋白质印迹分析的非限制性实例可容易地获自商业的供应商，非限制地包括AmershamBiosciences,Piscataway,NJ；Bio-RadLaboratories,Hercules,CA；PierceBiotechnology,Inc.,Rockford,IL；PromegaCorporation,Madison,WI,andStratagene,Inc.,LaJolla，GA0/Si角￠1:，胃SNAP-25剪切的这些测定和类似测定可用于鉴定表达内源性或外源性SNAP-25的细胞。作为非限制性实例，使用可识别BoNT/ASNAP-25剪切产物或者可识别剪切和非剪切两种形式SNAP-25的抗体的蛋白质印迹分析可用于测定BoNT/A的摄取。可用于这些测定中的α-SNAP-25抗体实例非限制地包括α-SNAP-25小鼠单克隆抗体SMI-81(SternbergerMonoclonalsInc.，Lutherville,MD)、小鼠α-SNAP-25单克隆抗体CI71.1(SynapticSystems,Goettingen,Germany)、α-SNAP-25小鼠单克隆抗体CI71.2(SynapticSystems,Goettingen,Germany)、α-SNAP-25/Mt(Abeam,Cambridge,MA)、α-SNAP-25^,^^Hiilifiiyf(SynapticSystems,Goettingen,Germany)、α-SNAP-25兔多克隆抗血清(Abcam，Cambridge,MA)和α-SNAP-25兔多克隆抗血清S9684(Sigma,StLouis,MO)。本公开的一些方面部分地包括一种BoNT/A受体。本文使用的术语“BoNT/A受体”是指以诱发BoNT/A中毒反应的方式优先与BoNT/A相互作用的天然BoNT/A受体或非天然BoNT/A受体。本文使用的术语“优选与......相互作用”是指BoNT/A对BoNT/A受体的平衡解离常数(KD)比BoNT/A对细胞表面的任何其他受体的平衡解离常数低至少一个数量级。所述平衡解离常数是一种测量BoNT/A-BoNT/A受体复合体可逆地分离(解离)成其组分分子(即BoNT/A和BoNT/A受体)的具体平衡常数类型，定义为KD=Ka/Kd(平衡时)。所述缔合常数(Ka)定义为Ka=[C]/[L][R]，所述解离常数(KD)定义为Kd=[L][R]/[C]，其中[L]等于BoNT/A的摩尔浓度，[R]是BoNT/A受体的摩尔浓度，[C]是BoNT/A-BoNT/A受体复合体的摩尔浓度，并且所有浓度都是当系统平衡时这些组分的浓度。解离常数越小，BoNT/A与其受体的结合越牢固，或者BoNT/A和BoNT/A受体之间的结合亲和性越大。在该实施方案的一些方面中，BoNT/A对BoNT/A受体的解离常数比BoNT/A对任何其他受体的解离常数低至少2个数量级、低至少3个数量级、低至少4个数量级或者低至少5个数量级。在该实施方案的另一些方面中，优先与BoNT/A受体相互作用的BoNT/A的结合亲和性可以具有例如500nM或更小、400nM或更小、300nM或更小、200nM或更小或者IOOnM或更小的平衡解离常数(KD)。在该实施方案的另一些方面中，优先与BoNT/A受体相互作用的BoNT/A的结合亲和性可以具有例如90nM或更小、80nM或更小、70nM或更小、60nM，50nM或更小、40nM或更小、30nM或更小、20nM或更小或者IOnM或更小的平衡解离常数(KD)。本文使用的术语“诱发BoNT/A中毒反应”是指BoNT/A受体与BoNT/A相互作用以形成神经毒素/受体复合体并随后使该复合体内化至细胞质中的能力。本文使用的术语“天然BoNT/A受体”是指通过天然过程产生的任何BoNT/A受体，非限制地包括通过翻译后修饰、可变剪接转录或自发突变产生的BoNT/A受体异型体，以及BoNT/A受体亚型。天然BoNT/A受体非限制地包括成纤维细胞生长因子2(FGFR2)、成纤维细胞生长因子3(FGFR3)、突触囊泡糖蛋白(SM)和复合神经节苷脂如GTlb，例如以下文献中描述的那些:EsterFernandez-Salas,etal.,BotulinumToxinScreeningAssays,美国专利公开文本2008/0003240；EsterFernandez-Salas,etal.，BotulinumToxinScreeningAssays，美国专利公开文本2008/0182799;MinDongetal.,SV2istheProteinReceptorforBotulinumNeurotoxinA,Science(2006)；S.Mahrholdetal,TheSynapticVesicleProtein2CMediatestheUptakeofBotulinumNeurotoxinAintoPhrenicNerves,580(8)FEBSLett.2011-2014(2006)，以上每一篇均通过援引的方式全文纳入本文。天然FGFR2非限制地包括SEQIDNO:59、SEQIDNO:60、SEQIDNO:61、SEQIDNO:62、SEQIDNO:63、SEQIDNO:64、SEQIDNO:65、SEQIDNO:66、SEQIDNO67、SEQIDNO:68、SEQIDNO69和SEQIDNO:70，或者从SEQIDNO:59、SEQIDNO:60、SEQIDNO:61、SEQIDNO:62、SEQIDNO:63、SEQIDNO:64、SEQIDNO:65、SEQIDNO66、SEQIDNO:67、SEQIDNO:68、SEQIDNO69和SEQIDNO70置换、缺失或添加例如1个或更多、2个或更多、3个或更多、4个或更多、5个或更多、6个或更多、7个或更多、8个或更多、9个或更多、10个或更多、20个或更多、30个或更多、40个或更多、50个或更多或者100个或更多氨基酸而得到的序列。天然FGFR3非限制地包括SEQIDNO25,SEQIDN0:洸和SEQIDN0:27，或者从SEQIDNO25、SEQIDNOJ6和SEQIDN0:27置换、缺失或添加例如1个或更多、2个或更多、3个或更多、4个或更多、5个或更多、6个或更多、7个或更多、8个或更多、9个或更多、10个或更多、20个或更多、30个或更多、40个或更多、50个或更多或者100个或更多氨基酸而得到的序列。天然SV2非限制地包括SEQIDNO:28、SEQIDNO29,SEQIDNO30禾口SEQIDNO:31，或者从SEQIDNO28,SEQIDNO29,SEQIDN0:30和SEQIDNO:31置换、缺失或添加例如1个或更多、2个或更多、3个或更多、4个或更多、5个或更多、6个或更多、7个或更多、8个或更多、9个或更多、10个或更多、20个或更多、30个或更多、40个或更多、50个或更多或者100个或更多氨基酸而得到的序列。本文使用的术语“非天然BoNT/A受体变体”是指借助人的操作或设计产生的任何BoNT/A受体，非限制地包括通过使用随机诱变或合理设计的遗传工程产生的BoNT/A受体以及通过化学合成产生的BoNT/A受体。非天然BoNT/A变体的非限制性实例包括例如保守BoNT/A受体变体、非保守BoNT/A受体变体、BoNT/A受体嵌合变体和活性BoNT/A受体片段。本文使用的术语“非天然BoNT/A受体”是指其结构借助人的操作被改变的任何BoNT/A受体，非限制地包括通过使用随机诱变或理性设计的遗传工程产生的BoNT/A受体以及通过体外化学合成产生的BoNT/A受体。非天然BoNT/A变体的非限制性实例记载于例如EsterFernandez-Salas，etal.,BotulinumToxinScreeningAssays，美国专利公幵文本2008/0003240；EsterFernandez-Salas,etal.，BotulinumToxinScreeningAssays,美国专利公开文本2008/0182799中，以上每一篇均通过援引的方式全文纳入本文。非天然BoNT/A受体可以从SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO29,SEQIDNO30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:59、SEQIDNO:60、SEQIDNO:61、SEQIDNO:62,SEQIDNO:63、SEQIDNO:64、SEQIDNO:65、SEQIDNO:66、SEQIDNO:67、SEQIDNO:68,SEQIDNO:69或SEQIDNO:70置换、缺失或添加例如1个或更多、2个或更多、3个或更多、4个或更多、5个或更多、6个或更多、7个或更多、8个或更多、9个或更多、10个或更多、20个或更多、30个或更多、40个或更多、50个或更多或者100个或更多氨基酸。因此，在一个实施方案中，BoNT/A受体是天然BoNT/A受体，例如FGFR2、FGFR3或SV2。在该实施方案的一些方面中，所述BoNT/A受体是BoNT/A受体异型体或BoNT/A受体亚型。在该实施方案的一些方面中，所述天然BoNT/A受体是SEQIDNO25、SEQIDNO:26、SEQIDNO27,SEQIDNO28、SEQIDNO29、SEQIDNO30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:59、SEQIDNO60,SEQIDN0:61、SEQIDNO62,SEQIDNO63,SEQIDNO64、SEQIDNO:65、SEQIDNO66,SEQIDNO67,SEQIDNO68,SEQIDNO:69或SEQIDNO70的天然BoNT/A受体。在该实施方案的另一些方面中，所述BoNT/A受体是与SEQIDNO25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO59,SEQIDNO60,SEQIDN0:61、SEQIDN0:62、SEQIDNO63,SEQIDNO64,SEQIDNO:65,SEQIDNO:66,SEQIDNO:67,SEQIDNO:68,SEQIDNO:69或SEQIDNO:70具有例如至少70%氨基酸同一性、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸同一性的天然BoNT/A受体。在另一实施方案中，BoNT/A受体是非天然BoNT/A受体，例如通过遗传工程产生的FGFR2、通过遗传工程产生的FGFR3或通过遗传工程产生的SV2。在该实施方案的另一些方面中，所述BoNT/A受体是与SEQIDNO25、SEQIDNO26、SEQIDNO27、SEQIDNO:28、SEQIDNO29,SEQIDNO30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:59、SEQIDNO:60、SEQIDNO:61、SEQIDNO62,SEQIDNO63,SEQIDNO64、SEQIDNO65,SEQIDNO66,SEQIDN0:67、SEQIDNO:68,SEQIDNO:69或SEQIDNO:70具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸同一性的非天然BoNT/A受体。在该实施方案的另一些方面中，所述BoNT/A受体是相对于SEQIDNO25,SEQIDNO26,SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:59、SEQIDNO60、SEQIDNO:61、SEQIDNO:62、SEQIDNO:63、SEQIDNO:64、SEQIDNO:65、SEQIDNO:66、SEQIDNO:67、SEQIDNO:68、SEQIDNO69或SEQIDNO70具有例如1个或更多、2个或更多、3个或更多、4个或更多、5个或更多、6个或更多、7个或更多、8个或更多、9个或更多、10个或更多、20个或更多、30个或更多、40个或更多、50个或更多或者100个或更多非连续氨基酸置换、缺失或添加的非天然BoNT/A受体。仍在该实施方案的另一些方面中，所述BoNT/A受体是相对于SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:59、SEQIDNO:60、SEQIDN0:61、SEQIDNO:62、SEQIDNO:63、SEQIDNO:64、SEQIDNO:65、SEQIDNO:66、SEQIDNO:67,SEQIDNO:68、SEQIDNO:69或SEQIDNO:70具有例如1个或更多、2个或更多、3个或更多、4个或更多、5个或更多、6个或更多、7个或更多、8个或更多、9个或更多、10个或更多、20个或更多、30个或更多、40个或更多、50个或更多或者100个或更多连续氨基酸置换、缺失或添加的非天然BoNT/A受体。BoNT/A受体可以是内源性BoNT/A受体或外源性BoNT/A受体。本文使用的术语“内源性BoNT/A受体”是指在细胞中天然存在的BoNT/A受体，因为它天然地在所述细胞的基因组中被编码，使得所述细胞固有地表达所述BoNT/A受体，而不需要外源的BoNT/A受体或编码BoNT/A受体的外源遗传物质。内源性BoNT/A受体的表达可以需要也可以不需要环境刺激，例如细胞分化或启动子活化。例如，如下已建立细胞系可表达至少一种内源性BoNT/A受体BE(》-M17、Kelly、LAl-55n、NlE-115、N4TG3、N18、Neuro-2a、NG108-15、PC12、SH-SY5Y、SiMa和SK-N-BE(2)-C。内源性BoNT/A受体只能是天然BoNT/A受体或者其天然34变体。本文使用的术语“外源性BoNT/A受体”是指通过经人的操作导入外源BoNT/A受体或编码BoNT/A受体的外源遗传物质在细胞中表达的BoNT/A受体。外源性BoNT/A受体的表达可以需要也可以不需要环境刺激，例如细胞分化或启动子活化。作为非限制性实例，通过编码BoNT/A受体例如FGFR2、FGFR3或SV2的多核苷酸分子的瞬时或稳定转染，来自已建立细胞系的细胞可以表达一种或多种外源性BoNT/A受体。作为非限制性实例，通过所述BoNT/A受体例如FGFR2、FGFR3或SV2的蛋白转染，来自已建立细胞系的细胞可以表达一种或多种外源性BoNT/A受体。外源性BoNT/A受体可以是天然BoNT/A受体或其天然变体，或者非天然BoNT/A受体或其非天然变体。因此，在一个实施方案中，来自已建立细胞系的细胞可表达内源性BoNT/A受体。在该实施方案的一些方面中，由来自已建立细胞系的细胞表达的内源性BoNT/A受体是天然BoNT/A受体。在该实施方案的另一些方面中，由来自已建立细胞系的细胞表达的内源性BoNT/A受体是SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:59、SEQIDNO:60、SEQIDNO:61、SEQIDNO:62、SEQIDNO:63、SEQIDNO:64、SEQIDNO:65、SEQIDNO:66、SEQIDNO:67、SEQIDNO68,SEQIDNO69或SEQIDNO:70。在该实施方案的再一些方面中，由来自已建立细胞系的细胞表达的内源性BoNT/A受体是天然BoNT/A受体，例如BoNT/A受体异型体或BoNT/A受体亚型。在该实施方案的另一些方面中，由来自已建立细胞系的细胞表达的内源性BoNT/A受体是与SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO29,SEQIDNO30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:59、SEQIDNO:60、SEQIDNO:61、SEQIDNO:62,SEQIDNO:63、SEQIDN0:64、SEQIDNO:65,SEQIDNO:66,SEQIDNO:67,SEQIDNO:68,SEQIDNO:69或SEQIDNO:70具有例如至少70%氨基酸同一性、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸同一性的天然BoNT/A受体。在另一实施方案中，来自已建立细胞系的细胞被瞬时或稳定地工程化以表达外源性BoNT/A受体。在该实施方案的一个方面中，来自已建立细胞系的细胞被瞬时或稳定地工程化以表达天然BoNT/A受体。在该实施方案的另一些方面中，来自已建立细胞系的细胞被瞬时或稳定地工程化以表达SEQIDNO25,SEQIDNO26、SEQIDNO27、SEQIDNO:28、SEQIDNO29,SEQIDNO30,SEQIDN0:31、SEQIDNO:59、SEQIDNO60,SEQIDN0:61、SEQIDNO:62、SEQIDNO:63、SEQIDNO:64、SEQIDNO:65、SEQIDNO:66、SEQIDNO:67、SEQIDNO:68、SEQIDNO69或SEQIDNO70的天然BoNT/A受体。仍在该实施方案的另一些方面中，来自已建立细胞系的细胞被瞬时或稳定地工程化以表达天然BoNT/A受体，例如BoNT/A受体异型体或BoNT/A受体亚型。又在该实施方案的另一些方面中，来自已建立细胞系的细胞被瞬时或稳定地工程化以表达与SEQIDNO25,SEQIDNO:26、SEQIDNO:27,SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:59、SEQIDNO:60、SEQIDNO:61、SEQIDNO:62、SEQIDNO:63、SEQIDNO:64、SEQIDNO:65、SEQIDNO:66、SEQIDNO:67、SEQIDNO:68、SEQIDNO69或SEQIDNO70具有例如至少70%氨基酸同一性、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸同一性的天然BoNT/A受体。在该实施方案的另一方面中，来自已建立细胞系的细胞被瞬时或稳定地工程化以表达非天然BoNT/A受体。在该实施方案的另一些方面中，来自已建立细胞系的细胞被瞬时或稳定地工程化以表达与SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:59、SEQIDNO:60、SEQIDNO61、SEQIDNO:62、SEQIDNO:63、SEQIDNO:64、SEQIDNO:65、SEQIDNO:66、SEQIDNO:67、SEQIDNO:68、SEQIDNO69或SEQIDNO70具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸同一性的非天然BoNT/A受体。在该实施方案的另一些方面中，来自已建立细胞系的细胞被瞬时或稳定地工程化以表达相对于SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO31,SEQIDNO59、SEQIDNO60、SEQIDNO:61、SEQIDNO:62、SEQIDNO:63、SEQIDNO64,SEQIDNO65,SEQIDNO66,SEQIDNO67,SEQIDNO68,SEQIDNO:69或SEQIDNO:70具有例如1个或更多、2个或更多、3个或更多、4个或更多、5个或更多、6个或更多、7个或更多、8个或更多、9个或更多、10个或更多、20个或更多、30个或更多、40个或更多、50个或更多或者100个或更多非连续氨基酸置换、缺失或添加的非天然BoNT/A受体。仍在该实施方案的另一些方面中，来自已建立细胞系的细胞被瞬时或稳定地工程化以表达相对于SEQIDNO25,SEQIDNO26,SEQIDNO27,SEQIDNO28,SEQIDNO29、SEQIDNO30,SEQIDN0:31、SEQIDNO:59、SEQIDNO60,SEQIDN0:61、SEQIDNO:62、SEQIDNO:63、SEQIDNO:64、SEQIDNO:65、SEQIDNO:66、SEQIDNO:67、SEQIDNO:68,SEQIDNO:69或SEQIDNO:70具有例如1个或更多、2个或更多、3个或更多、4个或更多、5个或更多、6个或更多、7个或更多、8个或更多、9个或更多、10个或更多、20个或更多、30个或更多、40个或更多、50个或更多或者100个或更多连续氨基酸置换、缺失或添加的非天然BoNT/A受体。在另一实施方案中，来自已建立细胞系的细胞被瞬时或稳定地工程化以表达外源性FGFR2、外源性FGFR3、外源性SV2或它们的组合。在该实施方案的一些方面中，来自已建立细胞系的细胞被瞬时或稳定地工程化以表达天然FGFR2、天然FGFR3、天然SV2或它们的任意组合。仍在该实施方案的另一些方面中，来自已建立细胞系的细胞被瞬时或稳定地工程化以表达非天然FGFR2、非天然FGFR3、非天然SV2或它们的任意组合。又在该实施方案的另一些方面中，来自已建立细胞系的细胞被瞬时或稳定地工程化以表达天然FGFR2或非天然FGFR2、天然FGFR3或非天然FGFR3、天然SV2或非天然SV2或者它们的任意组合。表达一种或多种内源性或外源性BoNT/A受体的细胞可以通过常规的方法包括毒素摄取的直接和间接测定进行鉴定。确定BoNT/A结合或摄取性质的测定可用于评估细胞是否表达BoNT/A受体。这类测定非限制地包括使用标记的BoNT/A例如[125I]BoNT/A、[1251]的交联测定，参见，例如NorikoYokosawaetal.，BindingofClostridiumbotulinumtypeCneurotoxintodifferentneuroblastomacelllines,57(1)Infect.Immun.272-277(1989)；NorikoYokosawaetal.,BindingofbotulinumtypeCl,DandEneurotoxinstoneuronalcelllinesandsynaptosomes,29(2)Toxicon261-264(1991)；andTei-ichiNishikietal.，IdentificationofproteinreceptorforClostridiumbotulinumtypeBneurotoxininratbrainsynaptosomes,269(14)J.Biol.Chem.10498-10503(1994)。其他非限制性测定包括使用标记或非标记抗体检测BoNT/A结合的免疫细胞化学测定，参见例如AtsushiNishikawaetal.,ThereceptorandtransporterforinternalizationofClostridiumbotulinumtypeCprogenitortoxinintoHT-29cells，319(2)Biochem.Biophys.Res.Commun.327-333O004)；以及使用标记或非标记抗体检测结合的毒素的免疫沉淀测定，参见例如YukakoFujinagaetal.，MolecularcharacterizationofbindingsubcomponentsofClostridiumbotulinumtypeCprogenitortoxinforintestinalepithelialcellsanderythrocytes,150(Pt5)Microbiology1529-1538(2004)。可用于这些测定的抗体非限制地包括选择对抗BoNT/A的抗体；选择对抗BoNT/A受体如FGFR2、FGFR3或SV2的抗体；以及/或者选择对抗神经节苷脂如⑶la、⑶lb、⑶3、GQlb或GTlb的抗体。如果抗体被标记，那么分子的结合可以通过多种方式检测，包括蛋白质印迹分析、抗体细胞位置的直接显微镜观察、在洗涤步骤后对细胞或结合有底物的抗体的测量、流式细胞术、电泳或毛细管电泳、本领域技术人员公知的应用技术。如果抗体是未标记的，可应用标记的二级抗体来间接地检测所述结合的分子，检测可同标记的抗体那样进行。应理解的是，确定BoNT/A摄取性质或特征的这些测定和类似测定可用于鉴定表达内源性或外源性BoNT/A受体的细胞。检测暴露于BoNT/A后的分子释放的测定还可用于评估细胞是否表达一种或多种内源性或外源性BoNT/A受体。在这些测定中，对分子释放的抑制将出现于BoNT/A处理后的表达BoNT/A受体的细胞中。公知的测定包括测量对放射标记的儿茶酚胺从神经元释放的抑制，例如[3H]去甲肾上腺素或[3H]多巴胺释放，参见例如AFassioetal.，Evidenceforcalcium—dependentvesiculartransmitterreleaseinsensitivetotetanustoxinandBotulinumToxintypeF，90(3)Neuroscience893-902(1999)；禾口SaraStiglianietal.，ThesensitivityofcatecholaminereleasetoBotulinumToxinClandEsuggestsselectivetargetingofVesiclessetintothereadilyreleasablepool，85(2)J.Neurochem.409-421(2003)；或者使用荧光测定量方法测量儿荼酚胺释放，参见，例如AntondePaivaetal.，ArolefortheinterchaindisulfideoritsparticipatingthiolsintheinternalizationofbotulinumNeurotoxinArevealedbyatoxinderivativethatbindstoecto-acceptorsandinhibitstransmitterreleaseintracellularly，268(28)J.Biol.Chem.20838-20844(1993)；GaryW.Lawrenceetal.，Distinctexocytoticresponsesofintactandpermeabilisedchromaffincellsaftercleavageofthe25—kDasynaptosomal-associatedprotein(SNAP-25)orsynaptobrevinbyBotulinumToxinAorB,236(3)Eur.J.Biochem.877-886(1996)禾口；PatrickForanetal.,BotulinumNeurotoxinClcleavesbothsyntaxinandSNAP—25inintactandpermeabilizedchromaffincells!correlationwithitsblockadeofcatecholaminerelease，35(8)Biochemistry2630-2636(1996)0其他非限制性实例包括测量对激素从内分泌细胞例如垂体前叶细胞或卵巢细胞释放的抑制的测定。应理解的是，对于分子释放的这些测定和类似测定可用于鉴定表达内源性或外源性BoNT/A受体的细胞。检测暴露于BoNT/A后对BoNT/A底物的剪切的测定还可以用于评估细胞是否表达一种或多种内源性或外源性BoNT/A受体。在这些测定中，BoNT/A底物剪切产物的生成或完整BoNT/A底物的消失可在BoNT/A处理后的表达BoNT/A受体的细胞中检测到。成熟的试剂、条件和方案以及具体蛋白质印迹分析的非限制性实例可容易地获自商业的供应商，37非限制地包括AmershamBiosciences,Piscataway,NJ；Bio-RadLaboratories,Hercules,CA；PierceBiotechnology,Inc.,Rockford,IL；PromegaCorporation,Madison,WI,andStratagene,Inc.，LaJolla，CA。应理解的是，用于BoNT/A底物剪切的这些测定或类似测定可用于鉴定表达内源性或外源性BoNT/A受体的细胞。作为非限制性实例，使用识别BoNT/ASNAP-25剪切产物或者剪切和非剪切两种形式的SNAP-25的抗体的蛋白质印迹分析可以用于测定BoNT/A的摄取。用于这些测定的α-SNAP-25抗体的实例非限制地包括α-SNAP-25小鼠单克隆抗体SMI-81(SternbergerMonoclonalsInc.，Lutherville,MD)、小鼠α-SNAP-25单克隆抗体CI71.1(SynapticSystems,Goettingen,Germany)、α-SNAP-25/]、IH克CI71.2(SynapticSystems,Goettingen,Germany)>α-SNAP-25/J^3^δ#SP12(Abeam,Cambridge,ΜΑ)、α-SNAP-25^^3^δ.if(SynapticSystems,Goettingen,Germany)、α-SNAP-25兔多克隆抗血清S9684(Sigma，St.Louis,MO)禾Πα-SNAP-25兔多克隆抗血清(Abcam，Cambridge,ΜΑ)。本公开的方面可提供这样的细胞，即这种细胞通过遗传操作或重组工程化制备以表达外源性SNAP-25和/或一种或多种外源性BoNT/A受体。用于通过遗传操作或重组工程化表达外源性SNAP-25和/或一种或多种外源性BoNT/A受体的细胞包括可以表达或者不表达内源性SNAP-25和/或一种或多种内源性BoNT/A受体的神经元细胞和非神经元细胞。还应理解的是，这类遗传操作的或重组工程化的细胞可在组成型、组织特异性、细胞特异性或诱导型启动子元件和/或增强子元件的控制下表达外源性SNAP-25和一种或多种外源性BoNT/A受体。应理解的是，可以使用任何细胞，条件是所述细胞可被遗传操作或者被重组工程化以表达外源性SNAP-25和/或一种或多种外源性BoNT/A受体，并且能够发生BoNT/A中毒。用于向细胞导入编码对细胞进行全部细胞机制——藉此机制，BoNT/A可蛋白酶解剪切SNAP-25底物如SNAP-25、FGFR2、FGFR3或SV2——所必需的组分的外源性多核苷酸分子的方法非限制地包括化学介导的递送方法，例如磷酸钙介导的递送方法、二乙氨乙基(DEAE)葡聚糖介导的递送方法、脂质介导的递送方法、聚乙烯亚胺(PEI)介导的递送方法、聚赖氨酸介导的递送方法和聚凝胺介导的递送方法；物理介导的递送方法，例如基因枪、显微注射、原生质体融合和电穿孔；以及病毒介导的递送方法，例如反转录病毒介导的转染，参见例如IntroducingClonedGenesintoCulturedMammalianCells,pp.16.1-16.62(Sambrook&Russell,eds.,MolecularCloningALaboratoryManual,Vol.3,3rded.2001)；AlessiaColosimoetal.,TransferandExpressionofForeignGenesinMammalianCells,29(2)Biotechniques314-318，320-322，324(2000)；PhilipWashbourne&A.KimberleyMcAllister,TechniquesforGeneTransfertntoNeurons,12(5)Curr.Opin.Neurobiol.566-573(2002)；禾口CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWileyandSons,pp9.16.4-9.16.11(2000)，它们的每一篇均通过援引的方式全文纳入本文中。本领域技术人员可以理解的是，对将多核苷酸分子导入细胞的具体方法的选择将部分地依赖于所述细胞是否会瞬时或稳定地包含对所述细胞进行全部细胞机制——藉此机制，BoNT/A可蛋白酶解剪切SNAP-25底物——所必需的组分。编码对细胞进行全部细胞机制——藉此机制，BoNT/A可蛋白酶解剪切SNAP-25底物——所必需的组分的多核苷酸分子的非限制性实例如下SEQIDNO:130,SEQIDNO131,SEQIDNO132,SEQIDNO:133,SEQIDNO:134、SEQIDNO:135、SEQIDNO:136、SEQIDNO:137或SEQIDNO:138的FGFR2多核苷酸分子；SEQIDNO139,SEQIDNO:140或SEQIDN0:141&FGFR3多核苷酸分子；SEQIDNO:142,SEQIDNO:143或SEQIDNO:144的SV2多核苷酸分子；以及SEQIDNO145或SEQIDNO:146的SNAP-25多核苷酸分子。化学介导的递送方法是本领域普通技术人员公知的，并且记载于例如MartinJordan&FlorianWorm,TransfectionofAdherentandSuspendedCellsbyCalciumPhosphate,33(2)Methods136-143(2004)；ChunZhangetal.,PolyethylenimineStrategiesforPlasmidDeliverytoBrain—DerivedCells,33(2)Methods144-15(^2004)中，以上每一篇均通过援引的方式全文纳入本文。这类化学介导的递送方法可以通过标准步骤进行并且有市售，参见例如CellPhectTransfectionKit(AmershamBiosciences，Piscataway,NJ)；MammalianTransfectionKit，CalciumphosphateandDEAEDextran,(Stratagene，Inc.，LaJolla，CA)；LipofectamineTransfectionReagent(Invitrogen,Inc.,Carlsbad，CA)；ExGen500Transfectionkit(Fermentas，Inc.，Hanover,MD)，以及SuperFectandEffecteneTransfectionKits(Qiagen,Inc.，Valencia,CA)0物理介导的递送方法是本领域普通技术人员公知的，并且记载于例如JeikeE.Biewengaetal.，Plasmid-MediatedGeneTransferinNeuronsusingtheBiolisticsTechnique,71(1)J.Neurosci.Methods.67-75(1997)；JohnO'Brien&SarahC.R.Lummis,BiolisticandDiolisticTransfection:UsingtheGeneGuntoDeliverDNAandLipophilicDyesintoMammalianCells,33(2)Methods121-125(2004)；Μ.Golzioetal.，InVitroandInVivoElectricField-MediatedPermeabilization,GeneTransfer，andExpression,33(2)Methods126-135(2004)；禾口OliverGreschetal.，NewNon-ViralMethodforGeneTransferintoPrimaryCells，33(2)Methods151-163(2004)中，以上每一篇均通过援引的方式全文纳入本文。病毒介导的递送方法是本领域普通技术人员公知的，并且记载于例如ChooiM.Laietal.，AdenovirusandAdeno-AssociatedVirusVectors,21(12)DNACellBiol.895-913(2002)；IlyaFrolovetal.，Alphavirus-BasedExpressionVectorsStrategiesandApplications,93(21)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.11371-11377(1996)；RolandWolkowiczetal.，LentiviralVectorsfortheDeliveryofDNAintoMammalianCells,246MethodsMol.Biol.391-411(2004)；A.Huser&C.Hofmann,BaculovirusVectorsNoνe1MammaIianCellGene-DeliveryVehiclesandTheirApplications，3(1)Am.J.Pharmacogenomics53-63(2003)；TizianaToninietal.，TransientProductionofRetroviral-andLentiviral-BasedVectorsfortheTransductionofMammalianCells,285MethodsMol.Biol.141-148(2004)；ManfredGossen&HermannBujard，TightControlofGeneExpressioninEukaryoticCellsbyTetracycline-ResponsivePromoters，美国专利No·5，464，758；HermannBujard&ManfredGossen，MethodsforRegulatingGeneExpression，美国专禾丨JNo.5，814，618;DavidS.Hogness,PolynucleotidesEncodingInsectSteroidHormoneReceptorPolypeptidesandCellsTransformedWithSame，美国专利No.5，514，578；DavidS.Hogness，PolynucleotideEncodingInsectEcdysoneReceptor，美国专利6，245，531;ElisabettaVegetoetal.，ProgesteroneReceptorHavingC.TerminalHormoneBindingDomainTruncations，美国专利No.5，364，791；ElisabettaVegetoetal.，MutatedSteroidHormoneReceptors,MethodsforTheirUseandMolecularSwitchforGeneiTherapy,美国专利No.5，874，534，以上每一篇均通过援引的方式全文纳入本文。这类病毒介导的递送方法可以通过标准步骤进行并且有市售，参见例如ViraP0WerTMAden0ViralExpressionSystem(Invitrogen,Inc.，Carlsbad，CA)禾口ViraPowerAdenoviralExpressionSystemInstructionManual25_0543versionA，Invitrogen，Inc.，(Jul.15，2002)；以及AdEasyAdenoviralVectorSystem(Stratagene，Inc.,LaJolla，CA)禾口AdEasyAdenoviralVectorSystemInstructionManual064004f，Stratagene，Inc0再者，这类病毒介导的递送方法可以通过标准方法进行并且有市售，参见例如BDTet-0ffandTet-OnGeneExpressionSystems(BDBiosciences-Clonetech,PaloAlto,CA)、BDTet-OffandTet-OnGeneExpressionSystemsUserManual,PT3001-1，BDBiosciencesClonetech,(Mar.14,2003)>GeneSwitchSystem(Invitrogen,Inc.,Carlsbad,CA)>GeneSwitchSystemAMifepristone-RegulatedExpressionSystemforMammalianCellsversionD,25-0313,Invitrogen,Inc.,(Nov.4,2002)；ViraPowerLentiviralExpressionSystem(Invitrogen,Inc.,Carlsbad,CA)andViraPowerLentiviralExpressionSystemInstructionManual25_0501versionE,Invitrogen,Inc.,(Dec.8,2003)；以及CompleteControlRetroviralInducibleMammalianExpressionSystem(Stratagene,LaJolla,CA)禾口CompleteControlRetroviralInducibleMammalianExpressionSystemInstructionManual,064005eo因此，在一个实施方案中，来自对BoNT/A中毒敏感的已建立细胞系的细胞瞬时包含编码对细胞进行全部细胞机制——藉此机制，BoNT/A可蛋白酶解剪切SNAP-25底物——所必需的一种组分的多核苷酸分子。在另一实施方案中，来自对BoNT/A中毒敏感的已建立细胞系的细胞瞬时包含编码对细胞进行全部细胞机制——藉此机制，BoNT/A可蛋白酶解剪切SNAP-25底物——所必需的多种组分的多核苷酸分子。在该实施方案的一些方面中，来自对BoNT/A中毒敏感的已建立细胞系的细胞瞬时包含编码FGFR2、FGFR3、SV2或SNAP-25的多核苷酸分子。在该实施方案的一些方面中，来自对BoNT/A中毒敏感的已建立细胞系的细胞瞬时包含编码SEQIDNO:130、SEQIDNO:131、SEQIDNO:132、SEQIDNO:133、SEQIDNO:134,SEQIDNO:135,SEQIDNO:136,SEQIDNO:137或SEQIDNO:138的FGFR2的多核苷酸分子。在该实施方案的另一些方面中，来自对BoNT/A中毒敏感的已建立细胞系的细胞瞬时包含编码SEQIDNO:139,SEQIDNO:140或SEQIDNO:141的FGFR3的多核苷酸分子。仍在该实施方案的另一些方面中，来自对BoNT/A中毒敏感的已建立细胞系的细胞瞬时包含编码SEQIDNO:142,SEQIDNO:143或SEQIDNO:144的SV2的多核苷酸分子。仍在该实施方案的另一些方面中，来自对BoNT/A中毒敏感的已建立细胞系的细胞瞬时包含编码SEQIDNO145或SEQIDNO:146的SNAP-25的多核苷酸分子。在另一实施方案中，来自对BoNT/A中毒敏感的已建立细胞系的细胞稳定地包含编码对细胞进行全部细胞机制——藉此BoNT/A可蛋白酶解剪切SNAP-25底物——所必40需的一种组分的多核苷酸分子。在另一实施方案中，来自对BoNT/A中毒敏感的已建立细胞系的细胞稳定地包含编码对细胞进行全部细胞机制——藉此BoNT/A可蛋白酶解剪切SNAP-25底物——所必需的多种组分的多核苷酸分子。在该实施方案的一些方面中，来自对BoNT/A中毒敏感的已建立细胞系的细胞稳定地包含编码FGFR2、FGFR3、SV2或SNAP-25的多核苷酸分子。在该实施方案的一些方面中，来自对BoNT/A中毒敏感的已建立细胞系的细胞稳定地包含编码SEQIDNO:130、SEQIDNO:131、SEQIDNO:132、SEQIDNO:133、SEQIDNO:134、SEQIDNO:135、SEQIDNO:136、SEQIDNO:137或SEQIDNO:138的FGFR2的多核苷酸分子。在该实施方案的另一些方面中，来自对BoNT/A中毒敏感的已建立细胞系的细胞稳定地包含编码SEQIDNO:139,SEQIDNO:140或SEQIDNO:141的FGFR3的多核苷酸分子。仍在该实施方案的另一些方面中，来自对BoNT/A中毒敏感的已建立细胞系的细胞稳定地包含编码SEQIDNO:142,SEQIDNO:143或SEQIDNO:144的SV2的多核苷酸分子。仍在该实施方案的另一些方面中，来自对BoNT/A中毒敏感的已建立细胞系的细胞稳定地包含编码SEQIDNO145或SEQIDNO:146的SNAP-25的多核苷酸分子。如上述，可以将对于细胞进行全部细胞机制——藉此BoNT/A可蛋白酶解剪切SNAP-25底物，例如本说明书中公开的SNAP-25、FGFR2、FGFR3或SV2——所必需的组分导入细胞。可用于用递送试剂将这类外源性组分导入细胞群的任一和所有方法都可使用，条件是该方法可将本说明书中公开的外源性组分瞬时导入给定细胞群的至少50%的细胞中。因此，该实施方案的一些方面可包括这样的细胞群，即其中该给定细胞群的至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%瞬时包含对于细胞进行全部细胞机制——藉此BoNT/A可蛋白酶解剪切SNAP-25底物，例如本说明书中公开的SNAP-25、FGFR2、FGFR3或SV2——所必需的外源性组分。本文使用的术语“递送试剂”是指能够实现或者增强共价连接、非共价连接或者以任意其他方式关联的多肽至细胞中的内化的任何分子。因此，术语“递送试剂”非限制地涵盖非限制地将共价或非共价连接的分子转运至细胞膜、细胞质或核的蛋白、肽、拟肽、小分子、多核苷酸分子、脂质体、脂质、病毒、反转录病毒和细胞。还应理解的是，术语“递送试剂”涵盖通过任何机制内化的分子，包括经受体介导的胞吞作用发挥功能的递送试剂，以及不依赖于受体介导的胞吞作用的递送试剂。递送试剂还可以是例如通过化学轭合或者借助遗传产生的融合蛋白实现或者增强共价连接的组分如FGFR2、FGFR3、SV2或SNAP-25的细胞摄取的试剂。共价连接递送试剂的方法以及使用这类试剂的方法记载于例如MevenF.Dowdy,ProteinTransductionSystemandMethodsofUseThereof，国际公开文本NoWO00/34308；GerardChassaing&AlainProchiantz,PeptideswhichcanbeUsedasVectorsfortheIntracellularAddressingofActiveMolecules,美国专禾丨JNo.6，080，724；AlanFrankeletal.,FusionProteinComprisingTAT-derivedTransportMoiert,美国专利No.5,674,980；AlanFrankeletal.,TAT-derivedTransportPolypeptideConjugates,美国专利No.5，747，641;AlanFrankeletal.,TAT-derivedTransportPolypeptidesandFusionProteins,^H#^lJNo.5,804,604；PeterF.J.0'Hareetal.,UseofTransportProteins,美国专利No.6，734，167；Yao-ZhongLin&JackJ.Hawiger,MethodforImportingBiologicallyActiveMoleculesintoCells,美国专利No.5，807，746;Yao-ZhongLin&JackJ.Hawiger,MethodforImportingBiologicalIyActiveMoleculesintoCells，美国专利No.6，043，339；Yao-ZhongLinetal.，SequenceandMethodforGeneticEngineeringofProteinswithCellMembraneTranslocatingActivity,美国专利No.6，248，558；Yao-ZhongLinetal.，SequenceandMethodforGeneticEngineeringofProteinswithCellMembraneTranslocatingActivity,美国专利No.6，432，680；JackJ.Hawigeretal.，MethodforImportingBiologicallyActiveMoleculesintoCells，美国专利No.6，495，518;Yao_ZhongLinetal.,SequenceandMethodforGeneticEngineeringofProteinswithCellMembraneTranslocatingActivity,美国专禾IjNo.6，780，843JonathanB.Rothbard&PanlAWender,MethodandcompositionforEnhancingTransportAcrossBiologicalMembranes，美国专利No.6，306，993；JonathanB.Rothbard&PaulAWender,MethodandcompositionforEnhancingTransportAcrossBiologicalMembranes，美国专利No.6，495，663；andPamelaB.Davisetal.,FusionProteinsforProteinDelivery，美国专利No·6，287，817中，它们的每一篇均通过援弓ι的方式全文纳入本文。递送试剂还可以是实现或者增强非共价连接的组分如FGFR2、FGFR3、SV2c或SNAP-25的细胞摄取的试剂。在无共价连接的情况下发挥功能的方法以及使用这类试剂的方法记载于例如GillesDivitaetal，Peptide-MediatedTransfectionAgentsandMethodsofUse，美国专利No.6，841，535;PhilipLFeignerandOlivierZelphati，IntracellularProteinDeliverycompositionsandMethodsofUse，美国专利公幵文本iNo.2003/0008813；禾口MichaelKaras,IntracellularDeliveryofSmallMolecules，ProteinsandNucleicAcids，美国专利公幵文本2004/0209797中，它们的每一篇均通过援引的方式全文纳入本文。这类肽递送试剂可以通过标准方法制备和使用并且有示售，参见例如CHARIOTReagent(ActiveMotif,Carlsbad,CA)；BIO-PORTERReagent(GeneTherapySystems,Inc.,SanDiego,CA)、BIOTREKProteinDeliveryReagent(Stratagene，LaJolla，CA)禾口PRO-JECTProteinTransfectionReagent(PierceBiotechnologyInc.，Rockford，IL)0本公开的一些方面部分地包括一种包含BoNT/A的样品。本文使用的术语“包含BoNT/A的样品”是指包含或可能包含活性BoNT/A的任何生物物质。多种样品可依照本说明书中公开的方法测定，所述样品非限制地包括纯化的、部分纯化的或未纯化的BoNT/A;天然或非天然序列的重组单链或双链毒素；具有改良蛋白酶特异性的重组BoNT/A；细胞特异性改变的重组BoNT/A；大体积BoNT/A；制成制剂的BoNT/A产品，包括例如BOTOX、DYSPORT/RELOXIN>XEOMIN,PURTOX、NEURONOX、BTX-A；以及来自例如细菌、酵母、昆虫或哺乳动物来源的细胞或者粗的、分离的或部分纯化的细胞裂解液；血液、血浆或血清；生、半熟、熟或经加工的食物；饮料；动物饲料；土壤样品；水样；池塘底泥；洗剂；化妆品；以及临床制剂。应理解的是，术语样品涵盖组织样品，非限制地包括哺乳动物组织样品；家畜组织样品如绵羊、牛和猪组织样品；灵长类组织样品；以及人组织样品。这类样品非限制地包括肠样品如婴儿肠样品以及获自伤口的组织样品。作为非限制性实例，检测皮摩尔量的BoNT/A活性的方法可用于确定BoNT/A在血液或饮料样品中的存在情况或活性；可用于测定来自例如暴露于BoNT/A或者42具有一种或多种肉毒中毒症状的人或动物的样品；可用于在大体积BoNT/A的产生和纯化中跟踪活性；可用于测定在药物或化妆品应用中使用的制成制剂的BoNT/A产品；或者可用于测定受试者血清中是否存在中和α-BoNT/A抗体。因此，在一个实施方案中，包含BoNT/A的样品是包含任意量BoNT/A的样品。在该实施方案的一些方面中，包含BoNT/A的样品包含约IOOng或更少、约IOng或更少、约Ing或更少、约IOOpg或更少、约IOpg或更少或者约Ipg或更少的BoNT/A。在该实施方案的另一些方面中，包含BoNT/a的样品包含约1μM或更少、约IOOnM或更少、约IOnM或更少、约InM或更少、约IOOpM或更少、约IOpM或更少、约IpM或更少、约IOOfM或更少、约IOfM或更少或者约IfM或更少的BoNT/A。本公开的一些方面部分地包括从处理细胞中分离包含在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25的SNAP-25组分。本文使用的术语“包含在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25的SNAP-25组分”是指包含所述SNAP-25剪切产物的细胞组分。可想象的是，可以使用适合用于富集或分离SNAP-25组分的任何方法，非限制地包括细胞裂解方案、离心柱(spin-column)纯化方案、免疫沉淀、亲和纯化和蛋白质色谱。本公开的一些方面部分地包括连接于固相支持物的α-SNAP-25抗体。本文使用的术语“固相支持物”与“固相”同义，是指可以用于固定化本说明书中公开的α-SNAP-25抗体的任何基质。固相支持物的非限制性实例包括例如管；盘；柱；针或“插棒”；磁性颗粒、小珠或其他球状或纤维状色谱介质，例如琼脂糖(agarose)、琼脂糖凝胶(sepharose)、二氧化硅和塑料；以及片或膜，例如硝酸纤维素和二氟化树脂聚偏氟乙稀(PVDF)。所述固相支持物可以使用很多材料例如玻璃、炭、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、重氮纤维素或淀粉构建。所选的固相支持物可以具有这样的物理性质，即该物理性质使得它易于与可溶性或未结合的物质分离，并且通常可使得未结合的物质如过量试剂、反应副产物或者溶剂从与固相支持物结合的测定组分中分离或者除去(通过例如洗涤、过滤、离心等)。如何制备以及使用固相支持物的非限制性实例记载于例如MolecularCloning,ALaboratoryManual，见上文，(2001)；禾口CurrentProtocolsinMolecularBiology,JAL上文，Q004)中，以上每一篇均通过援引的方式全文纳入本文。本公开的一些方面部分地包括检测一种包含α-SNAP-25抗体和SNAP-25剪切产物的抗体-抗原复合体的存在情况，所述α"SNAP-25抗体可选择性地结合于在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25表位，所述SNAP-25剪切产物在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端。可想象的是，任何检测体系均可以用于实施这种公开的基于免疫的方法的一些方面，条件是信噪比可以以统计显著的程度将来自所述抗体-抗原复合体的信号与背景信号区分开。基于免疫的检测体系的非限制性实例包括免疫印迹分析如蛋白质印迹和斑点印迹、免疫沉淀分析、酶联免疫吸附分析(ELISA)和夹心ELISA。所述信号的检测可以借助如下技术使用放射自显影实现成像或磷光成像(AU)、化学发光(CL)、电化学发光(ECL)、生物发光(BL)、荧光、共振能转移、平面极化、比色法或流式细胞术(FC)。基于免疫的检测系统的描述公开于例如MichaelΜ.Rauhut,Chemiluminescence,InKirk-OthmerConciseEncyclopediaofChemicalTechnology(Ed.Grayson,3rded，JohnWileyandSons，1985)；A.W.Knight，AReviewofRecentTrendsinAnalyticalApplicationsofElectrogeneratedChemiluminescence,TrendsAnal.Chem.18(1):47-62(1999)；K.A.Fahnrich,etal.,RecentApplicationsofElectrogeneratedChemiluminescenceinChemicalAnalysis,Talanta54(4):531-559(2001)；CommonIyUsedTechniquesinMolecularCloning,pp.A8.1-A8-55(Sambrook&Russell,eds.,MolecularCloningALaboratoryManual,Vol.3,3rded.2001)；DetectionSystems,pp.A9.1-A9-49(Sambrook&Russell,eds.,MolecularCloningALaboratoryManual,Vol.3,3rded.2001)；ElectrogeneratedChemiluminescence,(Ed.AllenJ.Bard,MarcelDekker,Inc.,2004)中，以^过援引的方式全文纳入本文。夹心ELISA(或夹心免疫测定)是基于结合所述抗原上不同表位的两种抗体的方法。将对目的抗原具有高度结合特异性的捕获抗体结合于固体表面。然后加入所述抗原，并随后添加被称为检测抗体的二抗。所述检测抗体结合不同于针对捕获抗体的抗原表位。所述抗原因此“被夹在”所述两种抗体之间。所述抗体对所述抗原的结合亲和性通常是免疫测定灵敏度的主要决定因素。随着所述抗原浓度的增加，检测抗体的量也增加，导致测量到更高的反应。为了定量结合的程度，可以使用不同的报告体系，例如连接于二抗的酶和报告底物，这里酶促反应可形成作为检测信号的读数。所形成的信号与样品中存在的靶抗原的量成比例。用于测量所述结合事件的报告底物决定所述检测模式。分光光度计板式酶标仪用于比色法检测。已经开发出了化学发光和电化学发光底物，所述底物可进一步放大信号并且可以在发光酶标仪上读取。所述报告值还可以是荧光读数，这里以荧光团代替所述测定的酶步骤，然后使用荧光酶标仪测量所述读数。对进行ECL夹心ELISA所必需的试剂和方案有市售，非排他地包括MSD夹心ELISA-ECL检测平台(MesoScaleDiscovery,Gaithersburg,MD)。因此，在一个实施方案中，可以使用免疫印迹分析、免疫沉淀分析、ELISA或夹心ELISA检测包含α-SNAP-25抗体和SNAP-25剪切产物的抗体-抗原复合体的存在情况，所述α-SNAP-25抗体可选择性地结合于在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25表位，所述SNAP-25剪切产物在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端。在该实施方案的一些方面中，使用AU、CL、ECL或BL免疫印迹分析；AU、CL、ECL、BL或FC免疫沉淀分析；AU、CL、ECL、BL或FCELISA；或者AU、CL、ECL、BL或FC夹心ELISA进行所述检测。本公开的一些方面可以以单路或多路的方式实施。以单路方式实施的基于免疫的检测BoNT/A活性的方法仅检测包含α-SNAP-25抗体和SNAP-25剪切产物的抗体-抗原复合体的存在情况，所述SNAP-25剪切产物在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端。以多路方式实施的基于免疫的检测BoNT/A活性的方法同时检测两种或多种抗体-抗原复合体的存在情况；其中一种是包含α-SNAP-25抗体和SNAP-25剪切产物的抗体-抗原复合体，所述SNAP-25剪切产物在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端；其他的是针对第二、第三、第四等不同蛋白的抗体-抗原复合体。例如可以使用第二蛋白作为内部对照物，以通过将检出的α-SNAP-25/SNAP-25抗体-抗原复合体的量相对于对所述第二蛋白检出的抗体-抗原复合体的量标准化而最小化样品与样品之间的变异性。照此，所述第二蛋白通常是由所述细胞恒定表达的蛋白，例如管家蛋白。可用的第二蛋白的非限制性实例包括例如甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、突触融合蛋白、细胞因子。以多路方式进行基于免疫的测定的方法记载于例如U.B.NielsenandB.H.Geierstanger,MultiplexedSandwichAssaysinMicroarrayFormat,J.Immunol.Methods.290(1-2)107-1202004)；R.BarryandM,Soloviev,QuantitativeProteinProfilingusingAntibodyArrays,Proteomics,4(12):3717-3726(2004)；Μ.Μ.Lingetal.,MultiplexingMolecularDiagnosticsandImmunoassaysusingEmergingMicroarrayTechnologies,ExpertRevMolDiagn.7(1):87-98(2007)；S.X.Lengetal.,ELISAandMultiplexTechnologiesforCytokineMeasurementinInflammationandAgingResearch,JGerontolABiolSciMedSci.63(8):879-884Q008)中，以上每一篇均通过援引的方式全文纳入本文。因此，在一个实施方案中，基于免疫的检测BoNT/A活性的方法通过以下方式以单路的方式实施仅检测包含a-SNAP-25抗体和SNAP-25剪切产物的抗体-抗原复合体的存在情况，所述SNAP-25剪切产物在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端。在另一实施方案中，基于免疫的检测BoNT/A活性的方法通过以下方式以多路的方式实施同时检测包含a-SNAP-25抗体和SNAP-25剪切产物的抗体-抗原复合体以及针对SNAP-25之外的其他蛋白例如GAPDH或突触融合蛋白的至少一种其他抗体-抗原复合体的存在情况，所述SNAP-25剪切产物在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端。本公开的一些方面部分地提供了一种测定BoNT/A免疫抗性的方法。本文使用的术语“BoNT/A免疫抗性”是指哺乳动物对于BoNT/A治疗不完全反应，或者由于以下原因显示出降低的BoNT/A治疗的有利效应所述哺乳动物的免疫反应直接或间接地降低所述治疗的有效性。有效性降低的非限制性实例可以是在哺乳动物中存在至少一种中和a"BoNT/A抗体，所述中和a-BoNT/A抗体可以以降低或阻断所述毒素特异性或活性的方式结合于BoNT/A毒素。本文使用的术语“BoNT/A治疗”是指使用BoNT/A毒素或者给予哺乳动物具有医学、治疗、治愈、美容、矫正或任何其他有利效应的一个或多个受控剂量的BoNT/A毒素的药剂、制剂或混合物，抵消需要神经调制的哺乳动物中的不利事物的治疗、矫正、治愈、愈合、康复或者任何其他方式。BoNT/A治疗非限制地涵盖与任何载体或活性成分组合并通过任何给药途径给药的任何制剂形式的其任何天然或修饰片段的使用。例如，公知的BoNT/A治疗是BOTOX治疗。本公开的一些方面部分地提供了一种从被测试是否存在a-BoNT/A中和抗体的哺乳动物中获得的试验样品。本文使用的术语“试验样品”是指包含或可能包含至少一种a-BoNT/A抗体的任何生物物质。a-BoNT/A抗体可以是中和抗BoNT/A抗体或非中和抗BoNT/A抗体。本文使用的术语“中和BoNT/A抗体”是指任何这样的a-BoNT/A抗体，即该a-BoNT/A抗体在生理条件下会以减少或阻止所述毒素在BoNT/A治疗中发挥其效应的方式结合于BoNT/A毒素的一个区域。本文使用的术语“非中和a-BoNT/A抗体”是指任何这样的a-BoNT/A抗体，即该a-BoNT/A抗体在生理条件下会结合于BoNT/A毒素的一个区域，但不阻止所述毒素在BoNT/A治疗中发挥其效应。可想象的是，可包含a-BoNT/A抗体的任一和所有样品均可用于该方法中，所述样品非限制地包括血液、血浆、血清和淋巴液。另外，能够产生抗BoNT/A毒素的a-BoNT/A抗体的任一和所有生物均可用作样品来源，所述生物非限制地包括鸟和哺乳动物，所述哺乳动物包括小鼠、大鼠、山羊、绵羊、马、驴、牛、灵长类和人。用于血液采集和血清制备的具体方案的非限制性实例记载于例如MarjorieSchaubDiLorenzo&SusanKingStrasinger,BloodCollectioninHealthcaee(F.A.DavisCompany,2001)；禾口DianaGarza&KathleenBecan-McBride,PhlebotomyHandbookBloodCollectionEssentials(PrenticeHall,6thed.,2002)中。这些方案是本领域技术人员公知并且在本文中有教导的常规方法。试验样品可在如下时间从生物体获得暴露于BoNT/A毒素之前、单次BoNT/A处理后、多次BoNT/A毒素处理后、对BoNT/A治疗的抗性发生之前或对BoNT/A治疗的抗性发生之后。本公开的一些方面部分地提供了一种对照样品。本文使用的术语“对照样品”是指已知其中是否存在试验样品的任何样品，包括阴性和阳性对照样品。对于中和α-BoNT/A抗体，阴性对照样品可以获自未曾暴露于BoNT/A的个体，并且可非限制地包括来自提供所述试验样品的相同个体、但在进行BoNT/A治疗前采集的样品；从未曾暴露于BoNT/A的不同个体中采集的样品；从多个未曾暴露于BoNT/A的不同个体中采集的混合样品。对于中和α-BoNT/A抗体，阳性对照样品可以获自表现出BoNT/A免疫抗性的个体，所述个体非限制地包括在基于患者的测试中测试为阳性的个体；在体内生物测定中测试为阳性的个体；以及显示高免疫性的抗体，例如已接种BoNT/A的个体。还可预知的是，α-ΒοΝΤ/Α抗体可以从样品中纯化。BoNT/A抗体可以通过多种方法从样品中纯化，所述方法非限制地包括蛋白A/G色谱法和亲和色谱法。从样品中纯化抗体的具体方案的非限制性实例记载于例如Antitodies:ALaboeatoeyManual(EdwardHarlow&DavidLane,eds.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,2nded.1998)；UsingAntibodies:ALaboratoryManual:PoetablePkotocolNO.I(EdwardHarlow&DavidLane,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1998)；禾口MolecularCloning，ALaboeatoeyManual,见上文，O001)中，它们通过援引的方式纳入本文。另外，成熟的试剂、条件和方案以及抗体纯化方法的非限制性实例可容易地获自商业的供应商，非限制地包括PierceBiotechnology,Inc.,Rockford，IL；和ZymedLaboratories,Inc.，SouthSanFrancisco,CA。这些方案是本领域技术人员熟知的常规方法。因此，在一个实施方案中，样品包括血液。在该实施方案的一个方面中，所述样品包括小鼠血、大鼠血、山羊血、绵羊血、马血、驴血、牛血、灵长类血或人血。在另一实施方案中，样品包括血浆。在该实施方案的一个方面中，试验样品包括小鼠血浆、大鼠血浆、山羊血浆、绵羊血浆、马血浆、驴血浆、牛血浆、灵长类血浆或人血浆。在另一实施方案中，样品包括血清。在该实施方案的一个方面中，所述样品包括小鼠血清、大鼠血清、山羊血清、绵羊血清、马血清、驴血清、牛血清、灵长类血清和人血清。在另一实施方案中，样品包括淋巴液。在该实施方案的一个方面中，样品包括小鼠淋巴液、大鼠淋巴液、山羊淋巴液、绵羊淋巴液、马淋巴液、驴淋巴液、牛淋巴液、灵长类淋巴液或人淋巴液。仍在另一实施方案中，样品是试验样品。仍在另一实施方案中，样品是对照样品。在该实施方案的一些方面中，对照样品是阴性对照样品或阳性对照样品。本公开的一些方面部分地提供了，对在步骤(d)中检出的在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25的量与在步骤(e)中检出的在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25的量进行比较。在一个实施方案中，所述试验样品中SNAP-25剪切产物的量高于所述对照样品中SNAP-25剪切产物的量。在46该实施方案的一个方面中，所述试验样品中SNAP-25剪切产物的量比阳性对照样品中的高指示所述哺乳动物中BoNT/A免疫抗性降低或者无BoNT/A免疫抗性。在该实施方案的另一方面中，所述试验样品中SNAP-25剪切产物的量与阴性对照样品中的相当指示所述哺乳动物中BoNT/A免疫抗性降低或者无BoNT/A免疫抗性。在另一实施方案中，所述试验样品中SNAP-25剪切产物的量比对照样品中的低。在该实施方案的一个方面中，所述试验样品中SNAP-25剪切产物的量比阳性对照样品中的低或与之相当指示所述哺乳动物中BoNT/A免疫抗性增大或者存在BoNT/A免疫抗性。在该实施方案的另一方面中，所述试验样品中SNAP-25剪切产物的量比阴性对照样品中的低指示所述哺乳动物中BoNT/A免疫抗性增大或者存在BoNT/A免疫抗性。可想象的是，适合用于检测样品中的中和α-BoNT/A抗体存在情况的任一和所有测定条件均可用于本说明书中公开的方法中，例如线性测定条件或非线性测定条件。在一个实施方案中，所述测定条件是线性的。在该实施方案的一个方面中，BoNT/A的测定量是过量的。在该实施方案的另一方面中，BoNT/A的测定量是限速的。在该实施方案的另一方面中，试验样品的测定量是限速的。本公开的一些方面还可以描述如下1.一种组合物，包含与连接于SNAP-25抗原的柔性连接体连接的载体，所述SNAP-25抗原在BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端。2.1的组合物，其中所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基是谷氨酰胺或赖氨酸。3.1的组合物，其中所述SNAP-25抗原包括SEQIDNO:147。4.1的组合物，其中所述柔性连接体和所述SNAP-25抗原的氨基酸序列是SEQIDNO38或SEQIDNO:46。5.一种分离的α-SNAP-25抗体，其中所述分离的α-SNAP-25抗体结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位。6.5的分离的α-SNAP-25抗体，其中所述α-SNAP-25抗体对不包含SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的羧基端谷氨酰胺的表位具小于1XIO1M-1S-1的缔合速率常数；其中所述α-SNAP-25抗体对于所述表位具有小于0.450nM的平衡解离常数。7.5的分离的α-SNAP-25抗体，其中所述分离的α-SNAP-25抗体具有包含选自如下序列的氨基酸序列的重链可变区:SEQIDNO:72、SEQIDNO:74、SEQIDNO:76、SEQIDNO:80和SEQIDNO82；并具有包含选自如下序列的氨基酸序列的轻链可变区SEQIDNO:84,SEQIDNO86,SEQIDNO88,SEQIDNO90禾口SEQIDNO:92。8.5的分离的α_SNAP_25抗体，其中所述分离的α-SNAP-25抗体至少包含SEQIDNO93的VhCDRl、SEQIDNO94的VhCDRl、SEQIDNO95的VhCDRl、SEQIDNO:118的VhCDRl、SEQIDNO:119的VhCDRl或SEQIDNO:120的VhCDRl。9.5的分离的α_SNAP_25抗体，其中所述分离的α-SNAP-25抗体至少包含SEQIDNO96的VhCDR2、SEQIDNO:97的VhCDR2、SEQIDNO98的VhCDR2、SEQIDNO:99的VhCDR2、SEQIDNO:121的VhCDR2、SEQIDNO:122的VhCDR2或SEQIDNO:123的VHCDR2。10.5的分离的α-SNAP-25抗体，其中所述分离的α-SNAP-25抗体至少包含SEQIDNO100的VhCDR3、SEQIDNO:101的VhCDR3、SEQIDNO:102的VhCDR3或SEQIDNO124的VhCDR3。11.5的分离的α-SNAP-25抗体，其中所述分离的α-SNAP-25抗体至少包含SEQIDNO103的VlCDRl、SEQIDNO:104的\CDRl、SEQIDNO:105的\CDRl、SEQIDNO106的\CDRl、SEQIDNO:107的\CDRl、SEQIDNO:125的\CDRl、SEQIDNO126的VlCDRI、SEQIDNO:127的\CDRl、SEQIDNO128的\CDRl或SEQIDNO129的\CDRl。12.5的分离的α-SNAP-25抗体，其中所述分离的α-SNAP-25抗体至少包含SEQIDNO108的VlCDR2、SEQIDNO:109的\CDR2、SEQIDNO:110的\CDR2、SEQIDNO111的VlCDR2或SEQIDNO:112的\CDR2。13.5的分离的α-SNAP-25抗体，其中所述分离的α-SNAP-25抗体至少包含SEQIDNO113的VlCDR3、SEQIDNO:114的VlCDR3、SEQIDNO:115的VlCDR3、SEQIDNO116的\CDR3或SEQIDNO:117的\CDR3。14.5的分离的α-SNAP-25抗体，其中所述分离的α-SNAP-25抗体包含包括SEQIDNO93,SEQIDN0:121禾口SEQIDNO100的重链可变区；以及包括SEQIDNO:105、SEQIDNO110和SEQIDNO:115的轻链可变区。15.5的分离的α-SNAP-25抗体，其中所述分离的α-SNAP-25抗体可选择性地结合于SEQIDNO32,SEQIDNO33,SEQIDNO34,SEQIDNO35,SEQIDNO36,SEQIDNO37,SEQIDNO:147或SEQIDNO:148的SNAP-25表位。16.5的分离的α-SNAP-25抗体，其中所述分离的α-SNAP-25抗体可选择性地结合SEQIDNO:39、SEQIDNO:40、SEQIDNO:41、SEQIDNO:42、SEQIDNO43或SEQIDNO44的SNAP-25表位。17.一种检测BoNT/A活性的方法，所述方法包括步骤a)用包含BoNT/A的样品处理来自已建立细胞系的细胞，其中所述来自已建立细胞系的细胞对BoNT/A引起的BoNT/A中毒是敏感的；b)从所处理的细胞中分离这样的SNAP-25组分，即该SNAP-25组分包含在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25剪切产物；c)将所述SNAP-25组分与α-SNAP-25抗体相接触，其中所述α-SNAP-25抗体可结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位；以及d)检测包含所述α-SNAP-25抗体和所述SNAP-25剪切产物的抗体-抗原复合体的存在情况；其中所述抗体-抗原复合体的检测结果指示BoNT/A的活性。18.一种检测BoNT/A活性的方法，所述方法包括步骤a)用包含BoNT/A的样品处理来自已建立细胞系的细胞，其中所述来自已建立细胞系的细胞对BoNT/A引起的BoNT/A中毒是敏感的；b)从所处理的细胞中分离这样的SNAP-25组分，即该SNAP-25组分包含在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25剪切产物；c)将所述SNAP-25组分与连接于固相支持物的α-SNAP-25抗体相接触，其中所述α-SNAP-25抗体可结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位；以及d)检测包含所述α-SNAP-25抗体和所述SNAP-25剪切产物的抗体-抗原复合体的存在情况；其中所述抗体-抗原复合体的检测结果指示BoNT/A的活性。19.一种检测BoNT/A活性方法，所述方法包括步骤a)用包含BoNT/A的样品处理来自已建立细胞系的细胞，其中所述来自已建立细胞系的细胞对BoNT/A引起的BoNT/A中毒是敏感的；b)从所处理的细胞中分离这样的SNAP-25组分，即该SNAP-25组分包含在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25剪切产物；c)将所述SNAP-25组分固定于固相支持物；d)将所述SNAP-25组分与α-SNAP-25抗体相接触，其中所述α-SNAP-25抗体可结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位；以及e)检测包含所述α-SNAP-25抗体和所述SNAP-25剪切产物的抗体-抗原复合体的存在情况；其中所述抗体-抗原复合体的检测结果指示BoNT/A的活性。20.一种检测BoNT/A活性方法，所述方法包括步骤a)用包含BoNT/A的样品处理来自已建立细胞系的细胞，其中所述来自已建立细胞系的细胞可以摄取BoNT/A；b)从所处理的细胞中分离这样的SNAP-25组分，即该SNAP-25组分包含在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25剪切产物；c)将所述SNAP-25组分与α-SNAP-25抗体相接触，其中所述α-SNAP-25抗体可结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位；以及d)检测包含所述α-SNAP-25抗体和所述SNAP-25剪切产物的抗体-抗原复合体的存在情况；其中所述抗体-抗原复合体的检测结果指示BoNT/A的活性。21.一种检测BoNT/A活性方法，所述方法包括步骤a)用包含BoNT/A的样品处理来自已建立细胞系的细胞，其中所述来自已建立细胞系的细胞可以摄取BoNT/A；b)从所处理的细胞中分离这样的SNAP-25组分，即该SNAP-25组分包含在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25剪切产物；c)将所述SNAP-25组分与连接于固相支持物的α-SNAP-25抗体相接触，其中所述α-SNAP-25抗体可结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位；以及d)检测包含所述α-SNAP-25抗体和所述SNAP-25剪切产物的抗体-抗原复合体的存在情况；其中所述抗体-抗原复合体的检测结果指示BoNT/A的活性。22.一种检测BoNT/A活性方法，所述方法包括步骤a)用包含BoNT/A的样品处理来自已建立细胞系的细胞，其中所述来自已建立细胞系的细胞可以摄取BoNT/A；b)从所处理的细胞中分离这样的SNAP-25组分，即该SNAP-25组分包含在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25剪切产物；c)将所述SNAP-25组分固定于固相支持物；d)将所述SNAP-25组分与α-SNAP-25抗体相接触，其中所述α-SNAP-25抗体可结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位；以及e)检测包含所述α-SNAP-25抗体和所述SNAP-25剪切产物的抗体-抗原复合体的存在情况；其中所述抗体-抗原复合体的检测结果指示BoNT/A的活性。23.一种测定哺乳动物中的BoNT/A免疫抗性的方法，包括步骤a)将BoNT/A添加至从被测试α-BoNT/A中和抗体是否存在的哺乳动物中获得的试验样品中；b)用所述试验样品处理来自已建立细胞系的细胞，其中所述来自已建立细胞系的细胞对BoNT/A中毒是敏感的；c)从所述处理的细胞中分离包含在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25剪切产物的SNAP-25组分；d)将所述SNAP-25组分与α-SNAP-25抗体相接触，其中所述α-SNAP-25抗体可以结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位；e)检测包含所述α-SNAP-25抗体和所述SNAP-25剪切产物的抗体-抗原复合体的存在情况；f)以阴性对照样品代替试验样品重复步骤b-e，所述阴性对照样品包含BoNT/A和已知不含α-BoNT/A中和抗体的血清；以及g)将步骤e中检测到的抗体-抗原复合体的量与步骤f中检测到的抗体-抗原复合体的量对比，其中与步骤f中检测到的抗体-抗原复合体的量相比，步骤e中检测到较低量的抗体-抗原复合体的检测结果指示α-ΒοΝΤ/Α中和抗体的存在。24.一种测定哺乳动物中的ΒοΝΤ/Α免疫抗性的方法，包括步骤a)将ΒοΝΤ/Α添加至从被测试α-ΒοΝΤ/Α中和抗体是否存在的哺乳动物中获得的试验样品中；b)用所述试验样品处理来自已建立细胞系的细胞，其中所述来自已建立细胞系的细胞对ΒοΝΤ/Α中毒是敏感的；c)从所述处理的细胞中分离包含在所述ΒοΝΤ/Α剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25剪切产物的SNAP-25组分；d)将所述SNAP-25组分与连接于固相支持物的α-SNAP-25抗体相接触，其中所述α-SNAP-25抗体可以结合在SNAP-25剪切产物的ΒοΝΤ/Α剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位；e)检测包含所述α-SNAP-25抗体和所述SNAP-25剪切产物的抗体-抗原复合体的存在情况；f)以阴性对照样品代替试验样品重复步骤b-e，所述阴性样品对照包含ΒοΝΤ/Α和已知不含α-ΒοΝΤ/Α中和抗体的血清；以及g)将步骤e中检测到的抗体-抗原复合体的量与步骤f中检测到的抗体-抗原复合体的量对比，其中与步骤f中检测到的抗体-抗原复合体的量相比，步骤e中检测到较低量的抗体-抗原复合体的检测结果指示α"ΒοΝΤ/Α中和抗体的存在。25.一种检测哺乳动物中的ΒοΝΤ/Α免疫抗性的方法，包括步骤a)将ΒοΝΤ/Α添加至从被测试α-ΒοΝΤ/Α中和抗体是否存在的哺乳动物中获得的试验样品中；b)用所述试验样品处理来自已建立细胞系的细胞，其中所述来自已建立细胞系的细胞对ΒοΝΤ/Α中毒是敏感的；c)从所述处理的细胞中分离包含在所述ΒοΝΤ/Α剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25剪切产物的SNAP-25组分；d)将所述SNAP-25组分固定于固相支持物；e)将所述SNAP-25组分与α-SNAP-25抗体相接触，其中所述α-SNAP-25抗体可以结合在SNAP-25剪切产物的ΒοΝΤ/Α剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位；f)检测包含所述α-SNAP-25抗体和所述SNAP-25剪切产物的抗体-抗原复合体的存在情况；g)以阴性对照样品代替试验样品重复步骤b-f，所述阴性对照样品包含ΒοΝΤ/Α和已知不含α-BoNT/A中和抗体的血清；以及h)将步骤f中检测到的抗体-抗原复合体的量与步骤g中检测到的抗体-抗原复合体的量对比，其中与步骤g中检测到的抗体-抗原复合体的量相比，步骤f中检测到较低量的抗体-抗原复合体的检测结果指示α"ΒοΝΤ/Α中和抗体的存在。26.一种测定哺乳动物中的ΒοΝΤ/Α免疫抗性的方法，包括步骤a)将ΒοΝΤ/Α添加至从被测试α-ΒοΝΤ/Α中和抗体是否存在的哺乳动物中获得的试验样品中；b)用所述试验样品处理来自已建立细胞系的细胞，其中所述来自已建立细胞系的细胞可以摄取ΒοΝΤ/Α；c)从所述处理的细胞中分离包含在所述ΒοΝΤ/Α剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25剪切产物的SNAP-25组分；d)将所述SNAP-25组分与α-SNAP-25抗体相接触，其中所述α-SNAP-25抗体可以结合在SNAP-25剪切产物的ΒοΝΤ/Α剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位；e)检测包含所述α-SNAP-25抗体和所述SNAP-25剪切产物的抗体-抗原复合体的存在情况；f)以阴性对照样品代替试验样品重复步骤b-e，所述阴性对照样品包含ΒοΝΤ/Α和已知不含α-ΒοΝΤ/Α中和抗体的血清；以及g)将步骤e中检测到的抗体-抗原复合体的量与步骤f中检测到的抗体-抗原复合体的量对比，其中与步骤f中检测到的抗体-抗原复合体的量相比，步骤e中检测到较低量的抗体-抗原复合体的检测结果指示α"ΒοΝΤ/Α中和抗体的存在。5027.一种检测哺乳动物中的BoNT/A免疫抗性的方法，包括步骤a)将BoNT/A添加至从被测试α-BoNT/A中和抗体是否存在的哺乳动物中获得的试验样品中；b)用所述试验样品处理来自已建立细胞系的细胞，其中所述来自已建立细胞系的细胞可以摄取BoNT/A；c)从所述处理的细胞中分离包含在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25剪切产物的SNAP-25组分；d)将所述SNAP-25组分与连接于固相支持物的α-SNAP-25抗体相接触，其中所述α-SNAP-25抗体可以结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位；e)检测包含所述α-SNAP-25抗体和所述SNAP-25剪切产物的抗体-抗原复合体的存在情况；f)以阴性对照样品代替试验样品重复步骤b-e，所述阴性对照样品包含BoNT/A和已知不含α-BoNT/A中和抗体的血清；以及g)将步骤e中检测到的抗体-抗原复合体的量与步骤f中检测到的抗体-抗原复合体的量对比，其中与步骤f中检测到的抗体-抗原复合体的量相比，步骤e中检测到较低量的抗体-抗原复合体的检测结果指示α"BoNT/A中和抗体的存在。28.一种检测哺乳动物中的BoNT/A免疫抗性的方法，包括步骤a)将BoNT/A添加至从被测试α-BoNT/A中和抗体是否存在的哺乳动物中获得的试验样品中；b)用所述试验样品处理来自已建立细胞系的细胞，其中所述来自已建立细胞系的细胞可以摄取BoNT/A；c)从所述处理的细胞中分离包含在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25剪切产物的SNAP-25组分；d)将所述SNAP-25组分固定于固相支持物；e)将所述SNAP-25组分与α-SNAP-25抗体相接触，其中所述α-SNAP-25抗体可以结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位；f)检测包含所述α-SNAP-25抗体和所述SNAP-25剪切产物的抗体-抗原复合体的存在情况；g)以阴性对照样品代替试验样品重复步骤b-f，所述阴性对照样品包含BoNT/A和已知不含α-BoNT/A中和抗体的血清；以及h)将步骤f中检测到的抗体-抗原复合体的量与步骤g中检测到的抗体-抗原复合体的量对比，其中与步骤g中检测到的抗体-抗原复合体的量相比，步骤f中检测到较低量的抗体-抗原复合体的检测结果指示α"BoNT/A中和抗体的存在。29.17-22和23_25的方法，其中所述细胞对于由约500ρΜ或更少、约400ρΜ或更少、约300ρΜ或更少、约200ρΜ或更少、约IOOpM或更少的BoNT/A引起的BoNT/A中毒是敏感的。30.20-22和沈_观的方法，其中所述细胞可以摄取约500ρΜ或更少、约400ρΜ或更少、约300ρΜ或更少、约200ρΜ或更少、约IOOpM或更少的BoNT/A。31.17-22的方法，其中所述样品包含约IOOng或更少、约IOng或更少、约Ing或更少、IOOfg或更少、IOfg或更少或者Ifg或更少的BoNT/A。32.17-22的方法，其中所述样品包含约IOOnM或更少、约IOnM或更少、约InM或更少、约IOOpM或更少、约IOpM或更少、约IpM或更少、约IOOfM或更少、约IOfM或更少或者约IfM或更少的BoNT/A。33.17-28的方法，其中所述α-SNAP-25抗体是5_16的分离的α-SNAP-25抗体。34.17-28的方法，其中抗体-抗原复合体的存在情况通过免疫印迹分析、免疫沉淀分析、ELISA或夹心ELISA检测。35.17-的方法，其中所述基于免疫的方法具有至少31、至少51、至少101、至少201、至少501或至少1001的信噪比下限。5136.17-的方法，其中所述基于免疫的方法具有至少101、至少201、至少501、至少1001、至少2001、至少3001、至少4001、至少5001或至少6001的信噪比上限。37.17-28的方法，其中所述基于免疫的方法可以检测例如至少lOOng、至少50ng、至少10ng、至少5ng、至少lOOpg、至少50pg、至少10pg、至少5pg、至少100fg、至少50fg、至少IOfg或至少5fg的EC50活性。38.17-28的方法，其中所述基于免疫的方法可以检测例如至少ΙΟηΜ、至少5nM、至少100pM、至少50pM、至少10pM、至少5pM、至少100fM、至少50fM、至少10fM、至少5fM或至少IfM的EC50活性。39.17-28的方法，其中所述基于免疫的方法具有例如IOpg或更少、9pg或更少、8pg或更少、7pg或更少、6pg或更少、5pg或更少、4pg或更少、3pg或更少、2pg或更少、Ipg或更少的BoNT/A的LOD。40.17-28的方法，其中所述基于免疫的方法具有例如IOOfM或更少、90fM或更少、80fM或更少、70fM或更少、60fM或更少、50fM或更少、40fM或更少、30fM或更少、20fM或更少或者IOfM或更少的BoNT/A的LOD。41.17-28的方法，其中所述基于免疫的方法具有例如IOpg或更少、9pg或更少、8pg或更少、7pg或更少、6pg或更少、5pg或更少、4pg或更少、3pg或更少、2pg或更少、Ipg或更少的BoNT/A的LOQ。42.17-28的方法，其中所述基于免疫的方法具有例如IOOfM或更少、90fM或更少、80fM或更少、70fM或更少、60fM或更少、50fM或更少、40fM或更少、30fM或更少、20fM或更少或者IOfM或更少的BoNT/A的L0Q。43.17-28的方法，其中所述基于免疫的方法可以将完全活性BoNT/A与具有部分活性BoNT/A区分开所述部分活性为完全活性BoNT/A的活性的70%或更少、60%或更少、50%或更少、40%或更少、30%或更少、20%或更少或者10%或更少。实施例实施例I候选细胞系的筛查下述实施例描述了如何鉴定对本说明书中公开的检测BoNT/A活性的方法所必需的对BoNT/A中毒敏感的或者具有BoNT/A摄取能力的已建立细胞系。1.候选细胞系的原种培养物的生长为了培养所述细胞系，将合适密度的来自要测试细胞系的细胞铺板于含有30mL合适的生长培养基(见表1)的162cm2组织培养瓶中，并且在37°C的培养箱中于5%或10%二氧化碳下孵育，直至细胞达到所需的密度。权利要求1.一种组合物，包含载体、柔性连接体和SNAP-25抗原，其中所述柔性连接体包含至少3个氨基酸，并且所述SNAP-25抗原包括SEQIDNO:148。2.权利要求2的组合物，其中所述柔性连接体和所述SNAP-25抗原氨基酸序列是SEQIDNO:38。3.一种分离的α-SNAP-25抗体，其中所述分离的α-SNAP-25抗体结合含有SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的羧基端谷氨酰胺的表位；其中所述α-SNAP-25抗体对不含SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的羧基端谷氨酰胺的表位具有小于IXlO1M4iT1的缔合速率常数；并且，其中所述α-SNAP-25抗体对所述表位具有小于0.450nM的平衡解离常数。4.权利要求3的分离的α-SNAP-25抗体，其中所述表位是SEQIDNO32。5.一种分离的α-SNAP-25抗体，包含a.包括SEQIDNO72,SEQIDNO74、SEQIDNO76,SEQIDNO80或SEQIDNO82的重链可变区；以及b.包括SEQIDNO84,SEQIDNO86,SEQIDNO88,SEQIDNO90或SEQIDNO92的轻链可变区。6.一种分离的α-SNAP-25抗体，包含a.包括SEQIDNO:93、SEQIDNO:121或SEQIDNO:100的重链可变区；以及b.包括SEQIDNO:105、SEQIDNO:110或SEQIDNO:115的轻链可变区。7.一种分离的α-SNAP-25抗体，包含至少SEQIDNO100的VHCDR3、SEQIDNO:101的VhCDR3或SEQIDNO:102的VhCDR3。8.一种检测BoNT/A活性的方法，所述方法包括步骤a.以包含BoNT/A的样品处理来自已建立细胞系的细胞，其中所述来自已建立细胞系的细胞对由约500pM或更少的BoNT/A引起的BoNT/A中毒是敏感的；b.从所处理的细胞分离包含SNAP-25剪切产物的SNAP-25组分，所述SNAP-25剪切产物具有所述BoNT/A剪切位点易切断键的羧基端谷氨酰胺；c.将所述SNAP-25组分与连接于固相支持物的α-SNAP-25抗体相接触，其中所述α-SNAP-25抗体结合含有SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的羧基端谷氨酰胺的表位，所述α-SNAP-25抗体对不含SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的羧基端谷氨酰胺的SNAP-25的表位具有小于1XIO1M-1S-1的缔合速率常数，并且所述α-SNAP-25抗体对所述表位具有小于0.450nM的平衡解离常数；d.检测抗体-抗原复合体的存在情况，所述抗体-抗原复合体包含所述α-SNAP-25抗体和具有所述BoNT/A剪切位点易切断键的羧基端谷氨酰胺的SNAP-25剪切产物，其中通过所述抗体-抗原复合体的检测结果指示BoNT/A活性。9.权利要求8的方法，其中所述SNAP-25剪切产物是SNAP_25197。10.权利要求8的方法，使用夹心ELISA检测抗体-抗原复合体的存在情况。11.权利要求8的方法，其中所述方法具有至少31的信噪比下限，和至少101的信噪比上限。12.权利要求8的方法，其中所述样品包含至多IOOpM的BoNT/A。13.权利要求8的方法，其中所述来自已建立细胞系的细胞对由约IOOpM或更少的BoNT/A引起的BoNT/A中毒是敏感的。14.权利要求8的方法，其中所述方法以单路方式或多路方式进行。15.一种测定哺乳动物中的BoNT/A免疫抗性的方法，包括步骤a.将BoNT/A添加至从被测试α-BoNT/A中和抗体是否存在的哺乳动物获得的试验样品中；b.以所述试验样品处理来自已建立细胞系的细胞，其中所述来自已建立细胞系的细胞对BoNT/A中毒是敏感的；c.从所述处理的细胞分离包含具有BoNT/A剪切位点易切断键的羧基端谷氨酰胺的SNAP-25剪切产物的SNAP-25组分；d.将所述SNAP-25组分与连接于固相支持物的α-SNAP-25抗体相接触，其中所述α-SNAP-25抗体；其中所述α-SNAP-25抗体结合包含SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的羧基端谷氨酰胺的表位，所述α-SNAP-25抗体对不含SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的羧基端谷氨酰胺的SNAP-25的表位具有小于1XIO1M-1S-1的缔合速率常数，并且所述α-SNAP-25抗体对所述表位具有小于0.450nM的平衡解离常数；e.检测抗体-抗原复合体的存在情况，所述抗体-抗原复合体包含所述α-SNAP-25抗体和具有所述BoNT/A剪切位点易切断键的羧基端谷氨酰胺的SNAP-25剪切产物；f.以阴性对照样品代替试验样品重复步骤b-e，所述阴性对照样品包含BoNT/A和已知不含α-BoNT/A中和抗体的血清；并且g.将步骤e中检测到的抗体-抗原复合体的量与步骤f中检测到的抗体-抗原复合体的量对比，其中与步骤f中检测到的抗体-抗原复合体的量相比，步骤e中检测到较低量的抗体-抗原复合体的检测结果指示α"BoNT/A中和抗体的存在。全文摘要本说明书公开了SNAP-25组合物；制备α-SNAP-25抗体的方法，该抗体结合含有在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处的羧基端的表位；α-SNAP-25抗体——该抗体结合含有在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处的羧基端的表位；检测BoNT/A活性的方法；以及检测中和α-BoNT/A抗体的方法。文档编号G01N33/569GK102356091SQ200980117157公开日2012年2月15日申请日期2009年3月13日优先权日2008年3月14日发明者D·D·霍奇斯,E·费尔南德斯-萨拉斯,J·王,K·R·奥基,L·S·黄,P·E·加里申请人:阿勒根公司