专利名称：检测包含在薄厚度腔室中的薄膜流体样本内的非常少量的分析物的方法
技术领域：
本发明涉及使用诸如在美国专利第6，9 ，953号中公开的成像系统对非常少量 的目标分析物进行检测和定量的方法和设备。
背景技术：
就诸如某些荷尔蒙(例如TSH)之类的一些分析物来说，其含量可能会低至每微升 几万个分子。可以通过使用本发明对分析物的单独的分子进行计数来测量这些极低的含 量。本发明还具有作为初级定量方法的优点，因此不需要标准化。
发明内容
该方法用于对限定目标分析物进行检测和定量，该限定目标分析物被布置为包 含在薄厚度平板腔室中的薄膜生物流体样本，该薄厚度平板腔室的厚度通常为约二微米 (2 μ )到十微米(10 μ )。该目标分析物具有至少两个表位(epitope)。该方法通过将限定 目标分析物的单个分子结合到固定基质进行工作，尽管在检验中可以采用针对多于一个表 位的结合剂(binder)。该基质具有结合到该基质的捕捉抗体或配体。该抗体或配体针对目 标分析物的一个或多个第一表位，并且可用来固定分析物并防止其扩散；即，将目标分析物 结合到基质。然后通过使用标记探针来检测该结合目标分析物。该探针包含一个或更多结 合到该探针表面的抗体或配体，该抗体或配体针对目标分析物的一个或多个第二表位。第一和第二类型的表位必须空间上位于目标分析物上，以使得一种表位的结合不 会防止第二种表位的结合。术语“抗体”和“配体”将指能够牢固地并特定地结合到目标表 位的任何基质，并且将包括免疫球蛋白、适配体、以及任何类似的高亲合力的生物结合剂。该方法适合于对具有至少两个可及表位的任何目标分析物进行检测和识别。这种 目标分析物的一个示例为TSH(促甲状腺激素)。将生物流体样本(优选地为血浆或血清) 引入到腔室中，选择该腔室的表面面积尺寸以允许每单位面积的样本的目标分析物的分子 数目为最大可计数数目，如下所述。该腔室的底部或顶部表面由塑料薄板形成，anti-alpha-TSH抗体结合到该塑料薄 板上，其数量超过捕捉期望测量的最大数量的目标分析物所需要的数量。必须将捕捉抗体 不可逆转地结合到固定基质，以使得在检验期间抗体不会离开其结合的表面。该区域被称 作捕捉区域。将血浆或血清样本添加到该腔室，并且样本中的所有TSH分子将结合到包含捕捉 抗体的固定基质，从而使样本中存在的所有分子固定不动。薄(通常小于十微米(10μ)) 腔室厚度允许迅速的垂直分子扩散，以使得在薄腔室的两层之间的扩散迅速地发生，从而 允许分析物的所有分子接触捕捉抗体表面。理想地，血浆(或被检查的其他生物流体)应当清洁并且不具有诸如在检验中会干扰分析物的结合或者信号的检测的细胞之类的粒子。在培养的同时或者在短暂的初始培养期之后，向样本中添加结合到抗体的荧光纳 米粒子(诸如anti-beta-TSH抗体)，其特定于分析物的第二表位，并且其数量也超过了结 合要计数的最大数量的分子所需要的数量。纳米粒子的直径优选地为10到100纳米(10 到IOOnm)，由铕荧光材料或者任何可检测的纳米粒子构成，诸如那些被称作量子点或其他 荧光纳米粒子(Sigma AldrichAt. Louis,MO, U. S. Α.为提供商)。这些荧光纳米粒子必须 足够小并且具有这样的比重，即，除非其表面结合抗体附着到固定分析物，否则这些荧光纳 米粒子将保持为胶状悬浮体。包含针对TSH分析物的第二表位的抗体/配体的单个荧光纳米粒子将附着到结合 到基质的每个TSH分子。那些没有由于附着到固定分析物而固定的荧光纳米粒子将继续为 胶状悬浮体，并且由于布朗运动而移动。为了将结合纳米粒子与未结合纳米粒子进行区分， 在一段时间的培养之后，在结合粒子的焦平面内，以适当的荧光照明对测试腔室进行成像， 所述一段时间足够长，以给出同移动发光纳米粒子的发光相比由于固定发光纳米粒子引起 的信号的可测量的上升，所述移动发光纳米粒子将会引起由于未结合的信号发生纳米粒子 所导致的背景光。这个曝光时间可以由测量仪器适当地确定但限定在其上限之内，这是因 为该区域有可能不具有结合的纳米粒子。因为被固定到基质而保留在一个位置的那些纳米 粒子将把其全部光子表达为仅仅几个像素，而由于布朗运动而到处“跳”的那些纳米粒子将 使其亮度分布在更大的区域上，从而使得可以检测到固定的粒子。不含捕捉抗体的腔室的 表面区域可以作为控制区域。使用该技术，在成像区域中的纳米粒子的浓度应当足够小，以使其不完全重叠并 且不使传感器区别固定粒子的能力减小。因此，单独的可区别的固定荧光粒子的数量等于 包含在腔室体积中的在捕捉区域中的捕捉抗体之上或之下的目标分析物分子的数量。由于 控制区域之上的流体体积与固定的捕捉抗体或配体之上的体积相比相对较小，因此对计算 腔室或窄通道的总体积来说可以将其忽略，所述固定的捕捉抗体或配体作为将控制区域与 捕捉区域分离的扩散屏障，其可用于获得捕捉区域上的准确的腔室体积。可替换地，可以采 用实际不渗透的屏障来分离捕捉区域和控制区域。在包含的样本中可以测量的分子的最大 数量由腔室的捕捉区域和像素放大率所限定。目标分析物的浓度是检测的分子数量除以捕 捉区域之上的腔室中的样本容量。腔室的体积由腔室的已知高度和样本的面积所限定，样 本的面积可以由样本区域中的像素数量和区域/像素放大率系数所限定。因此，如果腔室 的高度和放大率已知，则样本体积量也可以由执行分析的仪器所确定。必须将结合分子结 合得彼此足够远，以便避免来自捕捉的标记纳米粒子的信号重合。例如，如果能够在3到10 个像素的区域上检测到包含在纳米粒子上的信号的荧光，并且期望的纳米粒子的图像间隔 是具有产生0. 5微米/像素的图像尺寸的放大率的距离的至少两倍或者相隔大约15个像 素，则一个平方厘米的样本区域将包含用于检测每腔室大约一百万到两百万个分子的最大 量的足够的分辨率。理论上，在腔室中检测的分子量的下限为一，当然受计数统计的限制。 本领域技术人员将认识到，腔室越薄则结合标记目标分析物配体和游离标记目标分析物配 体之间的区别越显著，但在腔室中包含的样本的体积则越小。腔室的面积越大，则动态范围 越大，但是为了获得用于进行分析的腔室的图像所需的时间则越长。2cm2、高10微米(10 μ )、在捕捉区域中保持2微升的腔室将能够检测到该体积中的少量分子的存在。这对应于在样本源中大约10渺摩尔(attomolar)浓度的灵敏度。如 果需要，则可以通过这样的方式来线性地增加设备和方法的灵敏度，即，使10微升到1，000 微升的样本缓慢流过薄腔室来增加样本的体积从而捕捉该体积中的大部分或所有分子。流 速将在大约每秒一到几微升的范围内。检验可以预先完成，但分析腔室将被放置在样本储 池与废液池之间，并且直到流动和流过该腔室的每个体积的报告结果完成之前不添加检测 纳米粒子。尽管在收集腔室中使用吸收材料可以使流动自动化，但也可以推动增加体积的 样本通过该腔室。样本将从捕捉区域和控制区域两者上流过。因此，本发明的一个目的在于提供一种对放置在分析腔室中的血浆或血清中的单 分子目标分析物的量进行量化的方法。本发明的一个目的在于提供一种所描述特征的方法，其包括在平板薄膜样本腔室 的表面上捕捉目标分析物分子，所述平板薄膜样本腔室具有至少一个透明表面，并且光学 地加亮所捕捉的分子，以便可以通过光度测量法对这些分子进行计数。
如附图所示，本发明的这个和其他目的、特征和优点根据对其进行的详细描述将 变得更加明显。图1是针对目标分析物(在此情况中为TSH)对血浆或血清样本进行检验时使用 的薄膜样本测试腔室的一部分的示意性平面图。图2是与图1类似的示图，但其示出了填充有血浆或血清样本和多个荧光分析物 存在指示器的测试腔室。图3是与图2类似的示图，但其示出了为了呈现目标分析物而对测试腔室进行成 像时测试腔室的电子图像。图4是薄膜样本测试腔室组件的可替换实施例的示意性平面图，该薄膜样本测试 腔室组件包括更高体积的样本源区域、合成的薄膜测试腔室区域、以及更高体积的样本接 收区域。图5是与图4类似的示意性平面图，但其示出了正在移动通过薄膜测试腔室区域 的样本。图6是与图5类似的示意性平面图，但其示出了样本移动通过之后薄膜测试腔室 区域的成像。
具体实施例方式现在参考图1，示出了薄膜测试采样腔室的一部分，用数字2对其整体地进行表 示。在此情况中进行检验的测试样本为血浆或血清，并且针对TSH(促甲状腺激素)的存在 对其进行检验。腔室2具有表面或壁4，多个配体6附于其上。在此情况中，配体6将特定 于被检验的TSH分子的第一表位。图2示出了填充有被检验血浆和荧光指示器粒子8的混合物的测试腔室2。粒子 8包括特定于目标分析物上的第二表位的配体，以使得一些所述粒子在被放置到测试腔室 2中之前将与目标分析物结合。结合到目标分析物分子12的荧光指示器粒子由数字10标 明。在图2中游离的未结合荧光指示器粒子由数字8标明。在图2中目标分析物(在此情况中为TSH)由数字12标明。图2示出了几个被捕捉的分析物12和一些游离的未结合荧 光指示器粒子8。在样本4中未结合粒子8倾向于如箭头14所示意性表示的那样移动。在 此情况下，如图3所示意性示出的那样对采样腔室2成像时，样本中来自(目标分析物上) 被捕捉指示器粒子的荧光信号将相对明亮(如图3中数字10’所表示的那样)，而来自游离 指示器粒子的荧光信号将相对暗淡或模糊(如图3中数字8，所表示的那样)。因此，可以通过对样本4进行成像而容易地确定样本4中被捕捉的目标分析物的 数量。由于采样腔室2的体积是受控的，因此腔室2中样本4的体积是已知的，并且可以按 照目标分析物/样本体积单位对目标分析物计数进行测量。现在参考图4至图6，示出了本发明的设备的实施例，该设备能够对更大体积的被 检验样本进行采样。该实施例包括样本储池16，将要被检验的更大体积的血浆或血清样本 放置在该储池16中。储池16最多可以保持例如Iml的样本。储池16可以具有易弯曲的上 表面，可以压下该上表面以压缩样本并将样本经由该组件的样本测试腔室部件2泵出。测 试腔室2包括没有捕捉配体6的控制区域20和采样区域2’。该控制区域没有按比例示出 且该控制区域远小于捕捉区域，或者如果需要，则可以将控制区域与来自捕捉区域的扩散 屏障连接，所述捕捉区域包括分析物捕捉配体6。当压缩储池16时，样本将按照箭头A的方 向同时移动通过采样区域2’和控制区域20。在通过区域2’和20之后，样本将沉积在接收 储池18中，如果需要，接收储池18可以包含样本吸收剂。图6示出了样本移动通过样本腔室2’之后，将在样本腔室2’中检测到的图像。该 图像将示出被捕捉的指示器粒子的亮图像10，并且将示出来自游离的或未被捕捉的指示器 粒子的较暗的且较模糊的荧光信号8。如果证明样本测试是有效的，则控制区域20将仅包 括模糊的荧光信号8。包括储池16和18将允许对更大量的样本进行检验，并因此可以提供 更有效的测试结果。图4至图6中的虚线11表示采样区域2’和控制区域20之间的不渗 透屏障，其防止样本在两个区域之间跨越。在本发明描述的范围内，本发明关于其构造的多种修改都是可行的。它们包括范 围从Imm2到400mm2、具有2微米到10微米的高度的检验腔室区域。优选地，按照均勻模式 放置固定的结合抗体，而相邻的控制区域具有对期望的分析物没有亲和力的抗体或者根本 不具有抗体。理想的控制区域用以保证不存在更高强度的点，或者用于控制更高强度的点 的非特定检测，所述更高强度的点不与有标记的分析物相对应。优选地，限制样本从控制区 域扩散到捕捉区域，从而获得暴露于捕捉抗体的样本量的更准确的体积确定。如果需要，还 可以执行为标准曲线，其中在分析腔室中放置已知分析物的多种浓度并且在相似的条件下 进行分析。针对已知的分析物浓度绘制在捕捉区域中成像的每个区域可检测离散信号的数 量减去在控制区域中成像的每个区域可检测离散信号的数量，以获得该标准曲线。可以使 用该结果来计算在与标准曲线相同的条件下进行分析的未知样本中的分析物的浓度。可以使用诸如RCAT (滚动循环扩增技术)之类的探针信号放大代替纳米粒子，这 是因为其具有产生固定的荧光粒子的效果。由于在不脱离本发明的思想的情况下可以对本发明的已公开实施例进行多种改 变和变形，因此除所附权利要求所要求的以外，不对本发明进行限定。
权利要求
1.一种用于执行生物流体样本的免疫测定的方法，用于在薄膜样本腔室中对目标分析 物进行量化，所述方法包括以下步骤提供多个目标分析物特定的、足够结合所有添加的目标分析物的捕捉抗体或配体，其 固定到薄膜样本检验腔室的表面或者分析腔室中固定的结构，所述捕捉抗体或配体特定于 所述生物流体样本中存在的目标分析物分子上的一个或多个第一表位；用所述生物流体样本与荧光纳米粒子的混合物填充所述样本检验腔室，该荧光纳米粒 子耦合到抗体，该抗体选择地结合到所述生物流体样本中存在的目标分析物分子上的一个 或多个第二表位；以及在所述样本检验腔室中对所述静止样本进行成像并且对目标分析物分子进行计数，该 目标分析物分子被所述固定捕捉抗体捕捉并且通过对耦合到抗体的固定荧光纳米粒子进 行成像而变得可检测，该抗体结合到固定的目标分析物上的第二表位。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述纳米粒子为量子点。
3.如权利要求1所述的方法，其中作为由样本中布朗运动现象引起的游离纳米粒子的 运动的结果，由于结合到样本中的被捕捉的目标分析物分子而变得固定的荧光纳米粒子可 以与样本中游离的纳米粒子光度测量地区分开。
4.如权利要求1所述的方法，其中荧光纳米粒子为由于结合到样本中的被捕捉的目标 分析物分子而变得固定的量子点，并且由于样本中布朗运动现象引起的游离纳米粒子的运 动，所述荧光纳米粒子可以与样本中游离的纳米粒子光度测量地区分开。
5.如权利要求1所述的方法，其中通过利用图像分析或扫描分析的电子装置来执行结 合的有标记检测抗体与游离的有标记检测抗体之间的区分。
6.如权利要求1所述的方法，其中被检验的材料为未稀释的。
7.如权利要求1所述的方法，其中在捕捉区域中成像的每个区域可检测离散信号的数 量大于在控制区域中成像的每个区域可检测离散信号的数量，并且每个区域的差值乘以捕 捉区域的面积等于捕捉的目标分析物分子的数量。
8.如权利要求1所述的方法，其中在捕捉区域中成像的每个区域可检测离散信号的数 量大于在控制区域中成像的每个区域可检测离散信号的数量，并且在捕捉区域中成像的每 个区域可检测离散信号的数量与捕捉区域中捕捉的目标分析物分子的数量成比例。
9.如权利要求1所述的方法，其中在捕捉区域中成像的每个区域可检测离散信号的数 量大于在控制区域中成像的每个区域可检测离散信号的数量，并且在捕捉区域中成像的每 个区域可检测离散信号的数量表示样本中目标分析物的存在。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述腔室包含不含捕捉抗体或配体的控制区域。
11.如权利要求1所述的方法，其中所述纳米粒子的直径小于200纳米。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述纳米粒子的直径在10纳米至100纳米的范围内。
13.如权利要求1所述的方法，其中应用的样本体积大于分析腔室的体积。
14.一种用于执行生物流体样本的免疫测定的方法，用于在薄膜样本腔室中对目标分 析物进行量化，所述方法包括以下步骤提供所述生物流体样本与荧光纳米粒子的混合物供给，该荧光纳米粒子耦合到抗体， 该抗体选择地结合到所述生物流体样本中存在的目标分析物分子上的一个或多个第二表位，所述供给的样本容量大于所述薄膜样本腔室的样本容量；提供多个目标分析物特定的、足够结合所述混合物供给中的所有目标分析物的捕捉抗 体或配体，所述抗体或配体固定到薄膜样本检验腔室的表面或者分析腔室中固定的结构， 所述捕捉抗体或配体特定于所述生物流体样本中存在的目标分析物分子上的一个或多个第一表位；移动来自所述混合物供给的所述混合物使其通过所述样本检验腔室并进入样本接收 储池，从而，如果所述样本中存在所述目标分析物，则所述目标分析物将结合到所述样本腔 室中的所述捕捉抗体或配体；以及对所述样本检验腔室进行成像并且对目标分析物分子进行计数，该目标分析物分子被 所述固定捕捉抗体或配体捕捉并且通过对耦合到抗体的固定荧光纳米粒子进行成像而变 得可检测，该抗体结合到固定的目标分析物上的第一表位。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述纳米粒子为量子点。
16.如权利要求14所述的方法，其中作为由样本中布朗运动现象引起的游离纳米粒子 的运动的结果，由于结合到样本中的被捕捉的目标分析物分子而变得固定的荧光纳米粒子 可以与样本中游离的纳米粒子光度测量地区分开。
17.如权利要求14所述的方法，其中荧光纳米粒子为由于结合到样本中的被捕捉的目 标分析物分子而变得固定的量子点，并且由于样本中布朗运动现象引起的游离纳米粒子的 运动，所述荧光纳米粒子可以与样本中游离的纳米粒子光度测量地区分开。
18.如权利要求14所述的方法，其中通过利用图像分析或扫描分析的电子装置来执行 结合的有标记检测抗体与游离的有标记检测抗体之间的区分。
19.如权利要求14所述的方法，其中所述纳米粒子的直径在小于200纳米的范围内。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述纳米粒子的直径在10纳米至100纳米的范围内。
21.如权利要求1所述的方法，其中在捕捉区域中成像的每个区域可检测离散信号的 数量大于在控制区域中成像的每个区域可检测离散信号的数量，与被执行来对检验腔室进 行校准的标准曲线比较以确定样本中分析物的浓度。
全文摘要
本发明提供一种使用成像系统对非常少量的目标分析物进行检测和定量的方法和设备。就诸如某些荷尔蒙(例如TSH)之类的一些分析物来说，其含量可能会低至每微升几万个分子。可以通过使用本发明对分析物的单独的分子进行计数来测量这些极低的含量。本发明还具有作为不需要标准化的初级定量方法的优点。
文档编号G01N33/58GK102047116SQ200980118996
公开日2011年5月4日 申请日期2009年4月2日 优先权日2008年4月9日
发明者斯蒂芬·C·沃德洛, 罗伯特·A·莱文 申请人:艾博特健康公司