专利名称：：棉花次生物质抗盲蝽蟓效果的生物测定方法
技术领域：
：本发明涉及植物保护
技术领域：
，具体地说，涉及一种棉花次生物质抗盲蝽蟓效果的生物测定方法。
背景技术：
：盲蝽蟓是一类重要的农业害虫，在我国主要有绿盲蝽(ApolyguslucorumMeyer-Diir)、中黑盲虫春(AdelphocorissuturalisJakovlev)、苜猜盲虫春(AdelphocorislineolatusGoeze)、三点盲虫春(AdelphocorisfasciaticollisReuter)与牧草盲虫春(LyguspratensisL.)等几种。20世纪后半叶，我国棉田盲蝽蟓的发生数量很低，其一直作为棉铃虫(HelicoverpaarmigeraHiibner)化学防治的兼治对象进行控制。90年代末，我国开始商业化种植转Bt基因棉，棉铃虫得到了有效控制，但是作为棉田次要害虫的盲蝽蟓的发生数量却急剧增加、危害加重，成为当前转Bt棉上的主要害虫。而且不仅是棉田，盲蝽蟓种群暴发还波及到其他农业作物，近年来盲蝽蟓对枣、葡萄、樱桃、茶树等的危害日益严重。由于我国盲蝽蟓的研究基础比较薄弱，其防治技术体系也不太完善，目前，只能以化学防治为主。据统计，近几年在一些虫害严重地区每年为防治盲蝽蟓而施用化学农药20余次，出现了与90年代防治棉铃虫类似的现象。植物抗虫性的利用一直被誉为最有效、最经济的害虫治理策略，其已在多种农业害虫的防控中发挥了重要的作用。目前，对棉花抗虫机制的研究主要集中在生化抗性和物理抗性的研究方面。迄今为止，已发现和较为明确的抗虫活性生化物质有萜烯类化合物(如棉酚)、黄酮类化合物(如芸香苷)和单宁类化合物等3类次生物质。1978年Chan等(Condensedtannin,anantibioticchemicalfromGossypiumhirsutum.JournalofInsectPhysiology,1978,24:113_118)公开了从棉蕾中分离出的缩合单宁对玉米穗螟等害虫具有抗性潜能。但也有研究表明转Bt棉的单宁含量低于常规品种，并且不同品种的棉花、同一品种棉花的不同生育期、不同组织中含有的萜烯类化合物、黄酮类化合物也有所差异，所起的抗虫作用也有所不同。为了选育抗盲蝽蟓棉花品种，需要对棉花抗盲蝽蟓的抗虫性进行评价。然而，一方面盲蝽蟓属于刺吸式害虫，只能够摄食液体状食物，其取食特征与咀嚼式害虫差异很大，导致对其进行生物测定具有一定的难度，需要特殊的生物测定装置；另一方面，大多数棉花抗虫次生物质溶解度比较差，难以和基本饲料混溶，造成盲蝽蟓刺吸时难以有效摄取到棉花次生物质，或者取食不均勻，从而导致生物测定数据出现偏离，不能够准确判定生物测定效果。综上所述，传统的生物测定方法难以真实反映棉花次生物质抗盲蝽蟓效果，因此，建立适用于棉花次生物质抗盲蝽蟓效果生物测定方法，是棉花抗盲蝽蟓的抗虫性评价和选育抗盲蝽蟓棉花品种工作的关键环节之一。为了解决上述问题，本发明人发明了一种适用于刺吸式害虫取食的生物测定方法，并对棉花次生物质抗盲蝽蟓效果进行生物测定。
发明内容本发明的目的在于提供一种针对刺吸式害虫的棉花次生物质抗盲蝽蟓效果的生物测定方法。为了实现本发明的目的，本发明的棉花次生物质抗盲蝽蟓效果的生物测定方法，包括如下步骤1)将供试的棉花次生物质与脱脂奶粉、乳化溶液混合制成乳化次生物，然后与基本饲料混合均勻，制得生物测定饲料；2)将无底透明管竖直放置，用封口膜封住上端管口，在膜上滴加上述生物测定饲料，然后用另一封口膜覆盖并封口，制成饲料囊；3)将盲蝽蟓放入无底透明管中，使其取食饲料，记录盲蝽蟓的致死情况或体重抑制效果。其中，步骤1)中所述棉花次生物质与脱脂奶粉的重量比为0.15112；所述乳化溶液为含有0.3%0.6%(重量)二甲基亚砜(DMS0)和0.0.5%(重量)吐温80的水溶液，其用量可以根据供试棉花次生物质的溶解性等理化性质，以及生物测定时所需浓度确定，例如可以配制成含棉花次生物质510mg/g的乳化次生物。所述棉花次生物质为萜烯类化合物(如棉酚等)、黄酮类化合物(如芸香苷等)或单宁类化合物等3类次生物质。所述基本饲料是将无农药污染、无腐烂的四季豆洗净，粉碎成勻浆，过滤并挤压制得四季豆豆汁，然后加入防腐剂制成。所述防腐剂为山梨酸和对羟基苯甲酸甲酯，其加入量分别为四季豆豆汁重量的0.0.3%。上述制得的基本饲料在48°C的温度下储存，储存时间不超过3天。步骤2)中所述无底透明管为直径35cm，高68cm的玻璃管；所述封口膜为47cmX47cm的正方形Parafilm膜；在膜中央滴加0.20.4mL生物测定饲料。所述步骤3)具体是指，将无底透明管置于直径58cm玻璃平皿上，透明管底部内置12条4mmX3cm滤纸以增加容器内部空间异质性，保障供试昆虫的相对活动空间，将盲蝽蟓置于滤纸上，使其取食饲料，观察盲蝽蟓取食饲料情况，并记录盲蝽蟓的致死情况或体重抑制效果，根据致死情况或体重抑制效果评价棉花次生物质抗盲蝽蟓的效果。本发明中所述盲蝽蟓包括绿盲蝽、苜蓿盲蝽、三点盲蝽、中黑盲蝽或牧草盲蝽。具体地说，本发明的棉花次生物质抗盲蝽蟓效果的生物测定方法，包括如下步骤1)将无农药污染、无腐烂的四季豆洗净，用搅拌机粉碎成勻浆，过滤并挤压制得豆汁，然后加入防腐剂制成基本饲料；2)将DMS0、吐温80溶于水中制成乳化溶液；将供试的棉花次生物质与脱脂奶粉混合均勻后，溶于上述乳化溶液中，制成乳化次生物母液，然后按照试验要求的比例加入到基本饲料中，制得生物测定饲料；生物测定饲料中供试棉花次生物质的浓度(即乳化次生物母液与基本饲料的加入比例)，可以根据不同棉花品种中含有的棉花次生物质的不同含量、浓度选择合适的浓度范围及浓度梯度。3)将无底透明管竖直放置，然后将预先裁剪好的封口膜置于上端管口，拉伸四周使其封在上端管口上，在膜中央滴加0.20.4mL生物测定饲料，然后覆盖同样大小的封口膜并拉伸封口制成饲料囊，使装盛饲料的饲料囊形成薄薄一层的状态，其内部的豆汁饲料保持均勻。4)将上口覆有饲料囊的无底透明管置于直径略大的玻璃平皿上，无底透明管底部内置12条滤纸以增加容器内部空间异质性，保障供试盲蝽蟓的相对活动空间，即可制成生物测定容器。5)将供试盲蝽蟓置于无底透明管内滤纸上，使其取食饲料，观察盲蝽蟓取食饲料的情况，调查记录盲蝽蟓的致死情况或体重抑制效果，评价棉花次生物质对盲蝽蟓的生物测定效果。评价棉花次生物质抗盲蝽蟓效果是选育抗盲蝽蟓棉花品种的关键之一。本发明的生物测定方法，其结果能够真实反映棉花抗虫次生物质的实际抗盲蝽蟓活性，且数据具有规律性，为选育抗盲蝽蟓棉花品种提供依据。本发明的优点在于，本发明的生物测定方法解决了刺吸式害虫难以喂食，以及多数次生物质不易与人工饲料混溶等问题，并且适用广泛，对胃毒、内吸同时作用的药剂均能够进行有效测定，能准确测定出棉花次生物质对于盲蝽蟓等刺吸式害虫的控制效果，具有很强的实用性。具体实施例方式以下实施例用来说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1取无农药污染、无腐烂的新鲜四季豆洗净，用搅拌机粉碎成勻浆，然后过滤并挤压制得新鲜豆汁，每次制备约200mL，然后分别按豆汁重量的0.加入山梨酸及对羟基苯甲酸甲酯，搅拌均勻，制成基本饲料，将其放入冰箱中，在4°C的温度下储存、备用。分别将DMS0、吐温80溶于水中，制得含有0.6%(重量)DMS0、0.(重量)吐温80的乳化溶液，备用。称取2g芸香苷和4g脱脂奶粉充分混勻，然后从中称取1.5g混合物(含有0.5g芸香苷)于100mL容量瓶中，用上述乳化溶液定容至100mL，得到5mg/g的乳化芸香苷溶液。然后把该乳化芸香苷溶液按下述浓度加入到基本饲料中，分别制备0.8mg/g、0.4mg/g、0.2mg/g、0mg/g浓度梯度的含芸香苷的生物测定饲料。取四个相同的无底玻璃管(直径5cm、高8cm)，分成三个芸香苷处理组及一个对照组(CK)。将玻璃管竖直放置，把预先裁剪好的5cmX5cmParafilm封口膜置于玻璃管上口，拉伸四周使其封在上口上；在膜中央分别加入0.3mL各浓度梯度的含芸香苷的生物测定饲料，然后覆盖同样大小的封口膜并拉伸封口制成饲料囊，使装盛饲料的饲料囊形成薄薄一层的状态，内部的豆汁饲料保持均勻。将上口覆有饲料囊的玻璃管置于直径7cm玻璃平皿上，玻璃管底部内置1条4mmX3cm的滤纸条，制成生物测定容器。处理组和对照组(CK)分别接入5头2龄绿盲蝽若虫，每隔一天更换一次豆汁饲料，并记录玻璃管中的绿盲蝽剩余数目，第6天记录剩余虫数并回收剩余若虫，重复9次，评价芸香苷对盲蝽蟓的生物测定效果。结果如表1所示。实施例2取无农药污染、无腐烂的新鲜四季豆洗净，用搅拌机粉碎成勻浆，然后过滤并挤压得到新鲜豆汁，每次制备约200mL，然后分别按豆汁重量的0.3%加入山梨酸及对羟基苯甲酸甲酯，搅拌均勻，制成基本饲料，将其放入冰箱中，在8°C的温度下储存、备用。分别将DMS0、吐温80溶于水中，制得含有0.3%(重量)DMS0、0.5%(重量)吐温80的乳化溶液，备用。称取0.8g棉酚与5.2g脱脂奶粉充分混勻，然后从中称取3.75g混合物(含有0.5g棉酚)于50mL容量瓶中，用上述乳化溶液定容，充分震荡，使其成均勻悬浊液，得到10mg/g的棉酚混合悬浊液。然后把该棉酚混合悬浊液按下述浓度加入到基本饲料中，分别制备4mg/g、2mg/g、0.75mg/g、0mg/g浓度梯度的棉酚生物测定饲料。取四个相同的无底玻璃管(直径5cm、高8cm)，分成三个棉酚处理组及对照组(CK)。将玻璃管竖直放置，把预先裁剪好的5cmX5CmParafilm封口膜置于玻璃指形管上口，然后拉伸四周使其封在上口上，然后在膜中央分别加入0.4mL各浓度梯度的含棉酚的生物测定饲料后，覆盖同样大小的封口膜并拉伸封口制成饲料囊，使装盛饲料的饲料囊形成薄薄一层的状态，内部的豆汁饲料保持均勻。将上口覆有饲料囊的玻璃管置于直径7cm玻璃平皿上，指形管底部内置2条4mmX3cm的滤纸条，制成生物测定容器。处理组和对照组(CK)分别接入15头2龄绿盲蝽若虫，每隔一天更换一次豆汁饲料，并记录玻璃管中的绿盲蝽剩余数目，第6天记录剩余虫数并回收剩余若虫，重复3次，评价棉酚对盲蝽蟓的生物测定效果。结果如表1所示。表1棉花次生物质芸香苷和棉酚对绿盲蝽的生物测定效果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>由表1可以看出，绿盲蝽的死亡率随着次生物质处理浓度的提高而提高，表明两类次生物质具有很好的抗虫效果，数据具有规律性，能够真实反映棉花抗虫次生物的实际抗虫活性。棉花抗虫次生物质对照组(CK)的死亡率在2.5%5.9%之间，符合生物测定要求的对照死亡率控制在20%以内的要求，进一步说明了本方法的可靠性和有效性。下面通过本发明方法与传统生物测定方法的对比试验，进一步说明本发明。试验例1传统生物测定方法通常是采用固体形式混入法进行生物测定，即按照浓度梯度设置称取一定重量的棉花抗虫次生物质，不经过乳化过程直接加入到基本饲料中并搅拌混勻待测。由于多数棉花抗虫次生物质可溶性差，难以和基本饲料混溶，往往很快出现沉淀现象，造成盲蝽蟓刺吸时难以有效摄取到棉花次生物质，或者取食不均勻，从而导致生物测定数据出现偏离。例如，按表2所示浓度梯度将芸香苷加入到基本饲料中，配制成生物测定饲料，然后将上述生物测定饲料投入装有5头2龄绿盲蝽若虫的烧杯中，每隔一天更换一次饲料，并记录烧杯中的绿盲蝽剩余数目，第6天记录剩余虫数并回收剩余若虫，重复9次，评价芸香苷对盲蝽蟓的生物测定效果。将该结果与实施例1方法进行比较，结果如表2所示。表2绿盲蝽在芸香苷不同处理浓度和不同处理方法下的死亡率<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注同列数据后有相同字母表示差异不显著(P>0.05，新复极差法)，不相同字母表示差异显著(P<0.05,新复极差法)。从表2可以看出，本发明方法处理的绿盲蝽的死亡率随着次生物质处理浓度的提高而提高，而固体形式混入法不同处理浓度之间无明显差异，且没有规律性，不能够真实反映棉花抗虫次生物的实际抗虫活性。这是由于盲蝽蟓属于刺吸式口器害虫，只能够摄食液体状食物，不能像棉铃虫等咀嚼式害虫那样用咀嚼式口器直接吞食饲料，因此，不能将抗虫次生物质直接以固体形式均勻混入人工饲料的方法进行生物测定。虽然，上文中已经通过一般性说明、实施例与实验例对本发明作了详尽的描述，但不应理解为对本发明的限制。本领域普通技术人员应能理解，在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明生物测定的饲料组分、生物测定装置与制备方法的步骤或条件所作的修改或替换，均落入本发明的范围之中。权利要求一种棉花次生物质抗盲蝽蟓效果的生物测定方法，其特征在于，包括如下步骤1)将供试的棉花次生物质与脱脂奶粉、乳化溶液混合制成乳化次生物，然后与基本饲料混合均匀，制得生物测定饲料；2)将无底透明管竖直放置，用封口膜封住上端管口，在膜上滴加上述生物测定饲料，然后用另一封口膜覆盖并封口，制成饲料囊；3)将盲蝽蟓放入无底透明管中，使其取食饲料，记录盲蝽蟓的致死情况或体重抑制效果。2.根据权利要求1所述的生物测定方法，其特征在于，步骤1)中棉花次生物质与脱脂奶粉的重量比为0.15112；所述乳化溶液为按重量百分数含有0.3%0.6%二甲基亚砜和0.0.5%吐温80的水溶液。3.根据权利要求1或2所述的生物测定方法，其特征在于，所述棉花次生物质为萜烯类化合物、黄酮类化合物或单宁类化合物。4.根据权利要求1所述的生物测定方法，其特征在于，步骤1)中所述基本饲料是将无农药污染、无腐烂的四季豆洗净，粉碎成勻浆，过滤并挤压制得四季豆豆汁，然后加入防腐剂制成。5.根据权利要求4所述的生物测定方法，其特征在于，所述防腐剂为山梨酸和对羟基苯甲酸甲酯，其加入量分别为四季豆豆汁重量的0.0.3%。6.根据权利要求4所述的生物测定方法，其特征在于，所述基本饲料在48°C的温度下储存，储存时间不超过3天。7.根据权利要求1所述的生物测定方法，其特征在于，步骤2)中所述无底透明管为直径35cm，高68cm的玻璃管；所述封口膜为47cmX47cm的正方形Parafilm膜。8.根据权利要求1所述的生物测定方法，其特征在于，步骤2)中在膜中央滴加0.20.4mL生物测定饲料。9.根据权利要求1所述的生物测定方法，其特征在于，所述步骤3)为将无底透明管置于直径58cm玻璃平皿上，透明管底部内置12条4mmX3cm滤纸，将盲蝽蟓置于滤纸上，使其取食饲料。10.根据权利要求1所述生物测定方法，其特征在于，所述盲蝽蟓包括绿盲蝽、苜蓿盲蝽、三点盲蝽、中黑盲蝽或牧草盲蝽。全文摘要本发明提供了一种棉花次生物质抗盲蝽蟓效果的生物测定方法，其包括如下步骤将供试的棉花次生物质样品与脱脂奶粉、乳化溶液混合制成乳化次生物，然后与基本饲料混合均匀，制得生物测定饲料；将无底透明管竖直放置，用封口膜封住上端管口，在膜上滴加上述生物测定饲料，然后用另一封口膜覆盖并封口，制成饲料囊；将盲蝽蟓放入无底透明管中，使其取食饲料，记录盲蝽蟓的致死情况或体重抑制效果。本发明的生物测定方法解决了多数次生物质不易与人工饲料混溶，以及刺吸式害虫难以喂食等问题，并且适用广泛，对胃毒、内吸同时作用的药剂均能够进行有效测定，能准确测定出棉花次生物质对于盲蝽蟓等害虫的控制效果，具有很强的实用性。文档编号G01N33/00GK101813684SQ20101014534公开日2010年8月25日申请日期2010年4月9日优先权日2010年4月9日发明者吴孔明,张永军,林凤敏,赵秋剑,郭予元,陆宴辉申请人:中国农业科学院植物保护研究所