专利名称：：松材线虫快速分离技术的薄片洗涤法的制作方法松材线虫快速分离技术的薄片洗涤法
技术领域：
：本发明属于病虫防治检疫
技术领域：
，涉及一种松材线虫快速分离技术的薄片洗涤法。
背景技术：
：松材线虫是世界公认的松林头号杀手，是国际性森林检疫病虫，松材线虫通过松墨天牛补充营养的伤口进入木质部，寄生在树脂道中，在大量繁殖的同时移动，逐渐遍及全株，并导致树脂道薄壁细胞和上皮细胞的破坏和死亡。松树一旦感染松材线虫，最快40多天即枯死，松林从发病到毁灭只需3-5年时间。故松材线虫又有松林头号杀手之称，由于目前国内外尚没有有效的防治方法，因此松材线虫病又称“松材癌症。松材线虫在我国的传播、蔓延势头，已引起党中央、国务院领导的高度重视，2002年国务院办公厅为此专门发出《关于进一步加强松材线虫病预防和除治工作的通知》；但是，近十几年来，松材线虫在我国的传播、扩散速度之快，令人担忧！据国家林业局报告，目前松材线虫病已蔓延至12个省123个县，造成直接经济损失近30亿元，间接经济损失近千亿元，严重威胁我国5亿多亩松林的安全。这种状况若继续发展，将对我国的生态安全构成严重威胁，后果不堪设想！大量事实证明，染病的松木及其制品(木包装箱、木托盘等)是传播松材线虫的载体；防止松材线虫远距离传播的措施之一，是事半功倍的检疫工作。我国检验检疫部门、林业检疫部门，现行分离松材线虫的时间，普遍在6-12小时以上，如中国03103072.6所涉及的松材线虫的分离装置及检测方法，虽然能将分离工作得以在2030分钟之内完成，但几十分钟的分离检验时间太长，检疫影响了检验工作的效率及木材产品和木包装货物的通关过卡速度，同时整套设备的价格昂贵而难以普及。由于现有技术分离线虫的速度慢、时间长，检疫部门不能快速得出检验结果，使进口货物不能得到及时处理，影响了货物的转运和使用，增加了企业运作的成本，同时由于进口木包装需长时间停留在口岸等候检疫结果，也会为松材线虫的人为传播提供机会。因此，探索松材线虫的快速分离技术，加强检疫工作，遏制松材线虫远距离传播，十分迫切。
发明内容为了克服现有技术的上述缺点，本发明提供一种使松材线虫的分离时间缩短至l-5min内，具有简单实用、投资少、检验成本低、线虫的检出率高和检疫检验工作的效率高的松材线虫快速分离技术的薄片洗涤法。本发明解决其技术问题所采用的技术方案是一种松材线虫快速分离技术的薄片洗涤法，其步骤是第一步是取样，选取长8-12cm、宽6_8cm、厚2cm、重20_100g的木材样品一块，木块重量最少有20-50克，检测其水分含量；第二步是制取薄木片，用刀具将木块劈成0.I-Icm厚的薄木片，薄木片的最佳厚度为0.1-0.3cm；第三步是泡水和冲洗，在常温下，将薄木片放入容器中，加水盖过薄木片，在泡水的过程中不断地进行搅拌和冲洗，时间控制在l-5min内，然后提取冲洗液；第四步是过滤，将冲洗液倒进两层线虫筛进行过滤，两层线虫筛的上层筛孔为120-300目、下层筛孔为500目，然后将下层筛底液移至培养皿，下层筛底液占培养皿体积的1/3；第五步是用解剖镜观察培养皿中是否有线虫，当观察到培养皿中有线虫时，用移液器将线虫移到载玻片上，盖上盖玻片进行显微形态鉴定；当不能对线虫作出准确鉴定时，则用移液器将线虫吸入塑料指头瓶，送专家鉴定。所述木块在劈成薄木片时，每块薄木片至少有1/4以上的表面没有受到刀具的破坏。所述水温度为25-38°C。本发明的有益效果是利用本发明使松材线虫的分离时间缩短至l-5min，分离速度提高数百倍，本发明简单实用、投资少，其检验成本低，不需专用设备，利用现有分离线虫的工具就能开展工作，提高了线虫的检出率和检疫检验工作的效率，大大加快了木材产品的流通和木包装货物的通关过卡速度。具体实施方式下面结合实施例对本发明进一步说明一种松材线虫快速分离方法，取长8-12cm、宽6_8cm、厚2cm、重30_100g的木材样品一块，用刀具将木块劈成0.1-0.3cm或0.4-0.6cm厚的薄木片；在常温下，将薄木片放入容器中，加水盖过薄木片，最佳水温度为25-38°C，在泡水过程中进行搅拌和冲洗l-5min；将冲洗液倒进两层线虫筛进行过滤，两层线虫筛的上层筛孔为120-300目、下层筛孔为500目，然后将下层筛底液移至培养皿中，下层筛底液占培养皿体积的1/3；用解剖镜观察是否有线虫，然后用移液器将线虫移到载玻片，当观察到培养皿中有线虫时，盖上盖玻片进行显微形态鉴定；若不能作出准确鉴定，用移液器将线虫吸入塑料指头瓶，送专家鉴定。通过将木块劈成薄木片，使寄生在脂道薄壁细胞和上皮细胞的线虫裸露在薄木片的表面。木块在劈成薄木片时，每块薄木片至少有1/4以上的表面没有受到刀具的破坏，这部分木片表面上的线虫将保持完整形态依附或裸露在薄木片的表面，配合用水浸泡、冲洗和搅拌等技术处理，薄木片表面的线虫将脱落游离水中，达到快速从木片中分离线虫的效^ο试验一采用不同厚度木片样品(0.1-0.3cm与0.4-0.6cm)浸泡洗涤分离线虫，重复检验10个样品，观察结果。试验二采用不同温度的水浸泡样品(5°C、10°C、15°C、20°C、25°C、3(rC)，洗涤分离线虫，重复检验3次，观察结果。试验三采用不同时间(5、30、60、180、360、720、1440min)分离线虫，重复检验2次，观察分离结果。试验四对比不同样品Imin内线虫溢出量。试验五同一样品分别用电动锯切片与人工用柴刀制片，浸泡、洗涤分离线虫，重复检验5次，观察对比线虫溢出量。试验六同种样品浸泡后分别用不同方法处理(不作技术处理或立即实施搅拌、冲洗处理)lmin，分离线虫，观察线虫溢出量。上述每一样品均取50g，采用本发明对300木材样品进行线虫分离试验，试验结果表明样品能在经l-5min的技术处理后，分离出线虫的占99%，对含有松材线虫的150个木材样品进行线虫快速分离试验，结果100%的木材样品都能在经l-5min的技术处理后分离出部分线虫(约占木材样品线虫总量的25%以上)。对试验结果进行分析1、木片厚度对线虫溢出量的影响见表1，从表1可以看出，木片厚度影响线虫的溢出量，0.1-0.3cm木片厚度样品，比0.4-0.6cm木片厚度样品线虫的溢出量多40%以上。表1不同厚度木片线虫溢出量比较<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>2水温对线虫溢出量的影响从表2可以看出，水温对线虫溢出量的影响甚微，试验表明，3°C-38°C的水温都能分离出线虫。表2不同温度线虫溢出量比较<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>3泡水时间长短的影响从表3可以看出，样品泡水时间长短对线虫溢出量有影响，线虫溢出量有随泡水时间的延长而增加的趋势。表3不同泡水时间线虫溢出量比较<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>4从表4可以看出10个样品的木片都能在经1分钟的技术处理后分离出线虫，50克样品线虫的溢出量，最多达到150头，最少有6头。表4不同木样Imin内线虫溢出量<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>5制片方法的影响从表5可以看出人工制片样品分离线虫数量比电动锯切片分离线虫数量高3-8倍。表5人工制片与机械制片线虫溢出量比较<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>6处理方法的影响从表6中可看出，浸泡后立即实施搅拌、冲洗处理的样品的Imin的线虫分离量比不作技术处理的样品高一倍以上。表6不同处理方法的线虫溢出量比较<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>试验结论1采用本发明进行试验，从进境木包装中截获松材线虫7批次，拟松材线虫4批，滑刃线虫多批，首次在国内快递邮件的木包装中检出活体松材线虫，取得显著的社会效益。2薄片洗涤法操作简单，利用现有分离线虫的工具就能开展，而且时间快，能在短时间内确定样品中是否有线虫，在入境木包装检疫中起到了松材线虫检疫初筛的作用，同时也适用于林业部门在野外作松材线虫的疫情普查及木材调运检疫出证时快速确诊是否有松材线虫的方法。3目前检验检疫系统分离木材潜藏线虫的时间普遍在6-12小时以上。利用薄片洗涤法进行线虫分离，将原来6-12小时以上的分离时间缩短至l-5min，分离速度比原来提高近300倍以上；与目前处于国内领先水平的研究成果(20-30min完成线虫分离过程，成套线虫分离设备价格1万多元)相比，有以下优点第一，分离速度提高近20倍；第二，薄片洗涤法简单实用、投资少，利用现有分离线虫的设备就能开展工作。4实验证明，木材水分含量对线虫的溢出量影响较小，木材含水量从3%-38%都能分离出线虫；但木材水分含量的高低直接决定分离出来的线虫状态，一般的进境木包装水分含量较低(在15%以下)。因此，较少直接分离到活体线虫，分离出来的线虫绝大多数是没有活力的虫态(死虫、休眠虫态)；水分含量在25%以上的木材样品分离出来的线虫，基本上是活体线虫。5由于进境木包装水分含量较低，绝大多数样品，采用这种方法分离出来的线虫基本上是死虫或休眠虫态；但是溢出的线虫形态完整；可以进行种类鉴定，部分线虫经过短时间(5-lOmin或更长时间)吸收水分后，逐步表现出活力；或将木材样品继续泡水24小时以上，结果95%以上样品都能分离到活体线虫。6从染病松树上取下的木材样品，因水分含量高，分离出来的线虫绝大多数是活虫，所以薄片洗涤法也适应于林间的松材线虫疫情普查。7如果样品木片厚度为0.1-0.3cm，检验样品重量为30-60克；木片厚度为0.3-0.6cm，则样品重量应为60-100克。为增加线虫溢出量可以适当增加木材重量，但木片0.1-0.3cm为最佳厚度。8机制薄木片不适用本发明。9本发明适应所有木材及其制品的线虫分离。权利要求一种松材线虫快速分离技术的薄片洗涤法，其特征在于步骤是第一步是取样，选取长8-12cm、宽6-8cm、厚2cm、重20-100g的木材样品一块，检测其水分含量；第二步是制取薄木片，用刀具将木块劈成0.1-1cm厚的薄木片；第三步是泡水和冲洗，将薄木片放入容器中，加水盖过薄木片，在泡水的过程中不断地进行搅拌和冲洗，时间控制在1-5min内，然后提取冲洗液；第四步是过滤，将冲洗液倒进两层线虫筛进行过滤，两层线虫筛的上层筛孔为120-300目、下层筛孔为500目，然后将下层筛底液移至培养皿中；第五步是用解剖镜观察培养皿中是否有线虫，先用解剖镜观察培养皿中是否有线虫，当观察到培养皿中有线虫时，用移液器将线虫移到载玻片上，盖上盖玻片，进行显微形态鉴定。2.如权利要求1所述的松材线虫快速分离技术的薄片洗涤法，其特征是在第一步中，木块重量为20-50克。3.如权利要求1所述的松材线虫快速分离技术的薄片洗涤法，其特征是在第二步中薄木片的厚度为0.1-0.3cm。4.如权利要求1所述的松材线虫快速分离技术的薄片洗涤法，其特征是在第三步中，水温控制在25-38°C间。5.如权利要求1所述的松材线虫快速分离技术的薄片洗涤法，其特征是在第四步中，所述下层筛底液占培养皿体积的1/3。6.如权利要求1所述的松材线虫快速分离技术的薄片洗涤法，其特征是在第五步中，当不能对线虫作出准确鉴定时，用移液器将线虫吸入塑料指头瓶中，送专家鉴定。7.如权利要求1或3所述的松材线虫快速分离技术的薄片洗涤法，其特征是所述木块在劈成薄木片时，每块薄木片至少有1/4以上的表面没有受到刀具的破坏。全文摘要本发明涉及一种松材线虫快速分离技术的薄片洗涤法，通过取样制取薄木片，然后进行泡水、冲洗和过滤，最后进行解剖镜观察和线虫的显微形态鉴定，作出准确鉴定。利用本发明使松材线虫的分离时间缩短至1-5min，分离速度提高数百倍，本发明简单实用、投资少，利用现有分离线虫的工具就能开展工作，提高了线虫的检出率和检疫检验工作的效率，大大加快了木材产品和木包装货物的通关过卡速度。文档编号G01N1/28GK101832889SQ20101016680公开日2010年9月15日申请日期2010年4月30日优先权日2010年4月30日发明者王进福申请人:王进福