专利名称：一种测定肠道病毒71型灭活疫苗抗原滴度的检测方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别是用于肠道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)的 一种灵敏特异的测定肠道病毒71型灭活疫苗抗原滴度的酶联免疫检测方法
背景技术：
近年来，手足口疾病肆虐我国大部分地区，给人们带来了巨大的危害。大量的流行 病学研究表明，肠道病毒71型是引发手足口病的主要病原体之一。EV71属于小RNA病毒 科，肠道病毒属成员。该病毒的感染疾病，多发生于5岁以下的婴幼儿，可引起手、足、口腔 等部位的疱疹，个别患者可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症，具有较高的致 残和致死率。因此研制安全、有效的EV71疫苗来防控手足口疾病的传播，具有非常重要的 意义。目前，在市场上还未见有相关的疫苗，而在研发的疫苗主要包括甲醛灭活疫苗、类病 毒颗粒(VLP)疫苗和DNA疫苗等，其中又以甲醛灭活疫苗的进展最快。在EV71灭活疫苗的研制过程中，均需要进行EV71病毒抗原(EV71Ag)的检测，尽 管EV71病毒能产生细胞病变(CPE)，能够通过病毒感染组织培养细胞检测来进行EV71抗原 含量的测定。但是该方法周期较长，往往需要数天时间才能得到结果，并且由于CPE只能检 测有感染活性的病毒使得其无法正确检测出灭活疫苗中的抗原含量，如空泡病毒，失活病 毒等，因此无法在疫苗的生产过程中进行有效、即时、正确的监控，从而给EV71灭活疫苗的 生产工艺研发带来了 一些不便和瓶颈。
发明内容
本发明的目的是要克服CPE只能检测有感染活性的病毒使得其无法正确检测出 灭活疫苗中的抗原含量状况(情况)，利用双抗体夹心酶联免疫法(ELISA)，提供一种特异 性好、灵敏度高、使用方便、检测快速的肠道病毒71型灭活疫苗抗原的检测方法，可以应用 于肠道病毒71型灭活疫苗生产及质量检定。本发明通过下列技术方案完成一种肠道病毒71型灭活疫苗抗原的检测方法，其 特征在于经过下列步骤A.酶标板的预制A. 1酶标板的包被用碳酸盐缓冲液(pH9. 0)将兔抗EV71血清抗体稀释至5 20 微克/毫升，按50 100微升/孔的量，加入酶标板的空中，放于4°C孵育过夜，用PBS洗液 洗板3 5次；A. 2酶标板的封闭用封闭液按200微升/孔的量加入封闭液，37°C孵育1 2小 时，PBS洗液洗板3 5次，晾干，冰箱4°C保存备用；B.按50 100微升/孔的量，在步骤1的预制酶标板的孔中，加入不同稀释度的 待检抗原，并设阴性对照和空白调零孔，放入湿盒中，放入37°C摇床，180转/分钟震荡培养 1 2小时后，PBS洗液洗板3 5次；C.按50 100微升/孔的量，在步骤2. 1的酶标板的各孔中，加入稀释度为
31 800 1 1500的鼠抗EV71病毒单克隆抗体，放入湿盒中，放入37°C摇床，180转/分 钟震荡培养1 2小时，PBS洗液洗板3 5次；D.按50 100微升/孔的量，在步骤2. 2的酶标板的各孔中，加入稀释度为 1 1000 1 2000的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠免疫球蛋白G(IgG)抗体，放入37°C 摇床，180转/分钟震荡培养0. 5 1小时，PBS洗液洗板3 5次；E.按50 100微升/孔的量，在步骤2. 3的酶标板的各孔中，加入OPD显色液，放 入湿盒中，于37°C保温10 20分钟；F.按50 100微升/孔的量，在步骤2. 4的酶标板的各孔中，加入终止液，而后置 于酶标仪上，在492nm波长下，用空白孔调零后检测吸光度A值，即得到检测结果。根据检测的结果按下列条件进行判定域值(Cut off) = 2. 1XN(N为阴性对照平均A值，阴性对照的平均值大于0. 05， 按实际值计算；若阴性对照的平均值小于0. 05则按0. 05计算)，标本A值小于Cut off值 为阴性，大于等于Cut off值为阳性。所述A. 1步骤中的兔抗EV71血清抗体按下面的方法制备a、将病毒的浓度稀释成LogTCID50/ml (感染滴度)为7. 0 8. 0 (即将病毒作 107_° 108_°稀释，每孔接种1毫升，可使半数的组织细胞发生病变)，吸取1 2毫升的病 毒接种于大耳白兔子，分3 4个部位皮下注射；b、12 15天后，以同样的剂量进行加强免疫；C、在初次注射免疫后的第4 6周采血，处理血清；d、用市售的亲和纯化柱纯化血清中的抗体。所述B步骤中的鼠抗EV71病毒单克隆抗体为市购。所述C步骤中的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠免疫球蛋白G(IgG)抗体为市购。所述磷酸盐缓冲液(PBS)、磷酸盐缓冲液洗液、碳酸盐缓冲液、OPD显色液、终止 液、封闭液为常规用液。所述洗板为用PBS洗液在洗板机上洗板或者手工洗板。本发明具有以下优点和效果采用上述方案，以辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠免 疫球蛋白G抗体作为抗抗体有助于放大显色信号，提高检测的灵敏度，通常能检测到3. 7 4. 3LogTCID50/ml的病毒抗原，并且在对EV71灭活疫苗抗原进行检测时，由于不需要进行 细胞培养等一系列复杂费时的工作，从而缩短了检测时间，即由通常的数天缩短为4小时， 并且采用该方法进行酶联免疫反应时，具有低背景的优点，通常阴性对照孔的A值在小于 0. 08 (空白孔调零后)。本发明所建立的检测方法是一种特异性好、灵敏度高、重复性好、简 单方便的测定EV71病毒灭活疫苗抗原滴度的检测方法。
具体实施例方式以下实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和 权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。实施例1 兔抗肠道病毒71型病毒血清抗体的制备与纯化1)将病毒的浓度稀释成LogTCID50/ml (感染滴度)为8. 0吸取2毫升的病毒接种 于新西兰大耳白兔子，分4个部位皮下注射；
2) 14天后，以同样的剂量进行加强免疫；3)在初次注射免疫后的第4周采血；4)分离血清，-200C以下保存待用；5)取市购的Protein A亲和抗体纯化柱于室温放置平衡30分钟，用五倍柱体积 的平衡液(20毫摩尔浓度磷酸盐缓冲液)对层析柱进行平衡，将4)中的血清融化后上样过 柱，用10倍柱体积的平衡液洗脱杂蛋白，保留目的蛋白，用3个柱体积的洗脱液(0. 1摩尔 浓度的柠檬酸，PH值为3. 0)将目的蛋白从柱上洗脱下来，收集洗脱液。1)取1摩尔浓度的三羟甲基氨基甲烷(pH值为9. 0)以1 9的比例加入收集的 洗脱液中，中和过多的柠檬酸，用Iowry法测定蛋白含量，-20°C以下保存待用。实施例2酶标板的预包被1)酶标板的包被用碳酸盐缓冲液(pH9. 0)将兔抗EV71血清抗体稀释至10微克 /毫升，按100微升/孔的量，加入酶标板的空中，放于4°C孵育20小时以上，PBS洗液洗板 3次；2)酶标板的封闭用封闭液按200微升/孔的量加入封闭液，37°C孵育1小时，PBS 洗液洗板3次，晾干，冰箱4°C保存备用。实施例3肠道病毒71型病毒抗原的测定1)先将待检抗原样品用PBS稀释液进行不同稀释度的系列稀释1 90,1 270、 1 810、1 2430、1 7290、1 14580、1 29160，1 58320 具体稀释方法如下取 100 微升待检EV71病毒抗原样品加入900微升PBS稀释液，混勻即成1 10样品；取100微升 1 10样品加入800微升PBS稀释液，混勻即成1 90样品，如此类推稀释；用微量移液 器将稀释好的EV71病毒抗原样品从低稀释(1 90)开始依次加入预包被的酶标板孔中， 100微升/孔，每个稀释样品加两孔，同时在酶标板的另外孔中设立阴性孔2个，并留2孔作 空白调零孔，放入37°C摇床，180转/分钟震荡培养1小时，用PBS洗液洗板4次；2)在上述酶标板的各孔中加入稀释度为1 1000的鼠抗EV71病毒单克隆抗体， 100微升/孔，放入37°C摇床，180转/分钟震荡培养1小时，用PBS洗液洗板4次；3)在上述酶标板的各孔中加入稀释度为1 1500的辣根过氧化物酶标记的羊抗 鼠免疫球蛋白G (IgG)抗体，100微升/孔，放入37°C摇床，180转/分钟震荡培养0. 5小时， 用PBS洗液洗板5次；4)在上述酶标板的各孔中加入OPD显色液，100微升/孔，放入湿盒中，于37°C保 温15分钟；5)在上述酶标板的各孔中加入终止液，50微升/孔，置于酶标仪在490nm波长下， 用空白孔调零后检测吸光度A值，结果见表1 ；6)判定结果7)阴性对照孔平均A值0. 0608) Cutoff值=0. 060X2. 1 = 0. 1260，(阴性对照平均A值大于0. 05，按实际值计算)。9)按照样品的A值彡Cutoff值，该样品判定为阳性样品；样品的A值< Cutoff 值，该样品判为阴性。则本样品1 90 1 29160稀释度均为阳性、1 58320为阴性， 因此，该样品中的EV71病毒抗原滴度价为1 29160。
所用溶液如下1、包被缓冲液(0. 05M碳酸盐缓冲液，PH9. 6)碳酸钠1. 59克，碳酸氢钠2. 93克， 加蒸馏水至1000毫升。2、磷酸盐缓冲液(PBS，PH7.4)磷酸二氢钾0. 2克，磷酸氢二钠2. 9克，氯化钠8. 0 克，氯化钾0. 2克，Tween-200. 5毫升，加蒸馏水至1000毫升。3、PBS洗液1000毫升磷酸盐缓冲液中，加入0. 5毫升吐温20。4、封闭液100毫升PBS洗液中加入1克牛血清白蛋白，溶解混勻。5、OPD显色液称取20mg邻苯二胺，溶于50毫升0. 1摩尔浓度/升pH 5.0的柠 檬酸钠_磷酸盐缓冲液，再加入20微升双氧水，混勻后避光保存。6、终止液(2N硫酸)取浓硫酸10毫升，缓慢加入80毫升水中，冷却待用。表一、实施例1的检测A值 实施例4本发明的灵敏度分析以通过细胞病变法(CPE)检测得到新鲜的病毒抗原样品为检测对象，将其灭活 后，运用本发明进行检测。结果见表一表一 *灵敏度检测限换算公式为灵敏度检测限=CPE检测结果-Logltl(滴度)由以上结果可以看出，运用本发明检测疫苗样品中的抗原滴度含量，可以检测出 相当于病毒滴度(LogTCID50/ml)为4. 006士0. 257时样品中的抗原滴度含量，具有较好的 灵敏度。实施例5本发明的重复性分析运用本方法对同一样品在不同时间进行检测，结果见表二 表二 通过以上结果可以看出，每次实验中数据的变异系数(CV%)小于10%，不同时间 所得的检测结果具有很好的一致性。因此，运用本发明来检测肠道病毒71型灭活疫苗抗原 滴度具有非常良好的可重复性。
权利要求
一种测定肠道病毒71型灭活疫苗抗原滴度的检测方法，其特征在于具有如下步骤A.酶标板的预制A.1酶标板的包被用碳酸盐缓冲液将兔抗EV71血清抗体稀释至5～20微克/毫升，按50～100微升/孔的量，加入酶标板的空中，放于4℃孵育过夜，用磷酸盐缓冲液洗液洗板3～5次；A.2酶标板的封闭用封闭液按200微升/孔的量加入封闭液，37℃孵育1～2小时，磷酸盐缓冲液洗液洗板3～5次，晾干，冰箱4℃保存备用；B.按50～100微升/孔的量，在步骤1的预制酶标板的孔中，加入不同稀释度的待检抗原，并设阴性对照和空白调零孔，放入湿盒中，放入37℃摇床，180转/分钟震荡培养1～2小时后，磷酸盐缓冲液洗液洗板3～5次；C.按50～100微升/孔的量，在步骤2.1的酶标板的各孔中，加入稀释度为1∶800～1∶1500的鼠抗EV71病毒单克隆抗体，放入湿盒中，放入37℃摇床，180转/分钟震荡培养1～2小时，磷酸盐缓冲液洗液洗板3～5次；D.按50～100微升/孔的量，在步骤2.2的酶标板的各孔中，加入稀释度为1∶1000～1∶2000的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠免疫球蛋白G抗体，放入37℃摇床，180转/分钟震荡培养0.5～1小时，磷酸盐缓冲液洗液洗板3～5次；E.按50～100微升/孔的量，在步骤2.3的酶标板的各孔中，加入OPD显色液，放入湿盒中，于37℃保温10～20分钟；F.按50～100微升/孔的量，在步骤2.4的酶标板的各孔中，加入终止液，而后置于酶标仪上，在492纳米波长下，用空白孔调零后检测吸光度A值，即得到检测结果。
2.根据权利要求1所述的肠道病毒71型灭活疫苗抗原滴度检测方法，其特征在于A步 骤所述的兔抗EV71血清抗体经过下列方法制备a、将病毒的浓度稀释成感染滴度LogTCID50/ml为7.0 8. 0，吸取1 2毫升的病毒 接种于大耳白兔子，分3 4个部位皮下注射；b、12 15天后，以同样的剂量进行加强免疫；c、在初次注射免疫后的第4 6周采血，处理血清；d、用市售的亲和纯化柱纯化血清中的抗体。
3.根据权利要求1所述的肠道病毒71型灭活疫苗抗原滴度检测方法，其特征在于洗板 用磷酸盐缓冲液洗液在洗板机上洗板或手工洗板。
4.根据权利要求1所述的肠道病毒71型灭活疫苗抗原滴度检测方法，其特征在于磷酸 盐缓冲液、磷酸盐缓冲液洗液、碳酸盐缓冲液、终止液、OPD显色液、封闭液为常规用液。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，特别是用于一种测定肠道病毒71型灭活疫苗抗原滴度的酶联免疫检测方法。该方法，以辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠免疫球蛋白G抗体作为抗体，有助于放大显色信号，提高检测的灵敏度，通常能检测到病毒滴度为3.7-4.3LogTCID50/ml的病毒抗原，并且在对EV71灭活疫苗抗原进行检测时，由于不需要进行细胞培养等一系列复杂费时的工作，从而缩短了检测时间，由通常的数天缩短为4小时，并且采用该方法进行酶联免疫反应时，具有低背景的优点，通常阴性对照孔的A值小于0.08。本发明所建立的检测方法是一种特异性好、灵敏度高、重复性好、简单方便的测定EV71病毒灭活疫苗抗原滴度的检测方法。
文档编号G01N33/543GK101881774SQ201010206469
公开日2010年11月10日 申请日期2010年6月22日 优先权日2010年6月22日
发明者周康凤, 唐彩华, 姜云水, 朱莲, 毛子安, 毛江森, 王平, 罗永能, 高丽美, 高孟 申请人:浙江普康生物技术股份有限公司