专利名称：土壤中获得纯净线虫孢囊的方法
技术领域：
本发明涉及农业土壤害虫防治领域，尤其是涉及一种土壤中获得纯净线虫孢囊的方法。
背景技术：
孢囊线虫是世界农业生产中的重要线虫病害种类，其中大豆孢囊线虫、小麦禾谷孢囊线虫、马铃薯金线虫等孢囊线虫均给世界各地的农业生产造成巨大的经济损失，为了降低因孢囊线虫给农产品带来的损失，世界各国均对孢囊线虫进行了深入的研究，对孢囊线虫进行研究的前提是首先要将孢囊线虫从土壤中分离出来，从土壤中直接分离线虫孢囊是各种孢囊线虫研究的重要技术手段。目前将线虫孢囊直接从土壤中分离的技术手段主要有利用锥形瓶的简易分离法和利用范韦克O^nwick)漂浮器分离法，但上述方法分离的前提是首先需要将土壤风干， 处理时间较长，而且需要使用特定容器，由于受分离容器体积的限制，分离土样量较小，不能够快速而大量地从土壤中直接分离线虫孢囊。
发明内容
本发明的目的是提供一种土壤中获得纯净线虫孢囊的方法，能够缩短原有方法从土壤中获得纯净线虫孢囊的时间，并可增加一次性获得纯净线虫孢囊的数量。为实现上述目的，本发明提供了一种土壤中获得纯净线虫孢囊的方法，包括步骤101，在第一容器中将破碎后的含线虫孢囊的土壤与水按比例混合，搅拌后静置20-40秒，将第一容器内的上清液倒入套筛上，所述套筛包括上层网筛和底筛，将第一容器内的沉淀物按上述方法连续处理2-3次后将所述上层网筛上的残余物中的线虫孢囊用水冲洗到所述底筛上；步骤103，将步骤101中所述底筛上的残余物用水冲洗到第二容器中，搅拌后沉淀 1. 5-5分钟，去除漂浮在第二容器内悬浮液表面的有机质和空、瘪线虫孢囊，然后倒掉第二容器中的上清液，按上述方法冲洗步骤101中所述底筛上的残余物2 3次；步骤105，将所述第二容器中倒掉上清液后的沉淀物倒入套筛中，用水冲洗所述套筛的上层网筛；步骤107，将步骤105中所述套筛的底筛上的残余物冲入漂浮液中，搅拌后静置 1-2分钟，将上述漂浮液中的漂浮物即线虫孢囊倒入所述底筛上，用水冲洗干净。因此，本发明通过采用上述从土壤中获得纯净线虫孢囊的方法，能够缩短原有方法从土壤中获得纯净线虫孢囊的时间，并可增加一次性获得纯净线虫孢囊的数量。下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
图1为本发明土壤中获得纯净线虫孢囊的方法实施例的流程图。
具体实施例方式实施例一图1为本发明土壤中获得纯净线虫孢囊的方法实施例的流程图，如图1所示，包括步骤101，在第一容器中将破碎后的含线虫孢囊的土壤与水按比例混合，所述土壤与水的比例介于1 5与1 40之间，混合溶液中主要包括线虫孢囊、有机质及较大的土壤颗粒，充分搅拌后静置20-40秒，由于线虫孢囊比重比水大，因此在此步骤中我们搅拌后只静置20-40秒，此时线虫孢囊还没沉淀，存在于第一容器内的上清液中，而破碎后的土壤中的较大的土壤颗粒则会沉淀，通过对静置时间的控制，将破碎后的土壤中的较大的土壤颗粒去除，然后将第一容器内的上清液倒入套筛上，本实施例中所述套筛均包括上层网筛和底筛，不过本实施例中不同步骤中的套筛的上层网筛和底筛的目数可以不同。倒入套筛后，线虫孢囊和部分有机质会保留在所述套筛的上层网筛和底筛上，然后将第一容器内的沉淀物按上述方法连续处理2-3次，使得土壤中的线虫孢囊能够全部被冲洗到套筛上，然后再冲洗所述上层网筛，将所述上层网筛上的残余物中的线虫孢囊全部用水冲洗到所述底筛上，通过所述上层网筛将残余物中比线虫孢囊大的有机质去除，通过所述底筛将残余物中比线虫孢囊小的有机质去除，本步骤中所述第一容器为10-70L圆筒状容器，所述上层网筛介于20目和30目之间，所述底筛介于60目和80目之间。步骤103，将步骤101中所述底筛上的残余物用水冲洗到第二容器中，此时残余物中只有大小与线虫孢囊近似的有机质，搅拌后沉淀1. 5-5分钟，去除漂浮在第二容器内悬浮液表面的有机质和空、瘪线虫孢囊，本实施例中采用棉布擦拭去除漂浮在第二容器内悬浮液表面的有机质和空、瘪线虫孢囊，由于线虫孢囊比重比水大，在本步骤中的沉淀时间内将会沉淀，然后倒掉第二容器中的上清液，按上述方法冲洗步骤101中所述底筛上的残余物2 3次，使得所述底筛上的残余物能够完全转移到所述第二容器中，并将残余物中的有机质和空、瘪线虫孢囊去除，本步骤中所述第二容器为5-20L圆筒状容器。步骤105，将所述第二容器中倒掉上清液后的沉淀物倒入套筛中，用水冲洗所述套筛的上层网筛，使得沉淀物中的线虫孢囊完全落入所述套筛的底筛上，本步骤中所述上层网筛介于20目和30目之间，所述底筛介于60目和80目之间。步骤107，将步骤105中所述套筛的底筛上的残余物冲入漂浮液中，搅拌后静置 1-2分钟，所述漂浮液可为糖液、硫酸锌、硫酸钠或硫酸镁溶液中任意一种，本实施例中选用糖液，所述糖液、硫酸锌、硫酸钠或硫酸镁溶液的密度介于1. 15-1. 2克/立方厘米之间，大于饱满线虫孢囊的比重，因此饱满线虫孢囊会漂浮在所述漂浮液表面，将所述漂浮液中的漂浮物即线虫孢囊倒入底筛上，用水冲洗干净，即可得到干净的线虫孢囊，本步骤中所述底筛介于60目和80目之间。因此，本实施例通过采用上述从土壤中获得纯净线虫孢囊的方法，不必将含有线虫孢囊的土壤阴干，能够缩短原有方法从土壤中获得纯净线虫孢囊的时间，而且由于不受容器的限制，增加了一次性获得纯净线虫孢囊的数量。实施例二在任丘小麦孢囊线虫重病田采集病土，充分破碎后在50L水中加入3kg病土，搅拌3后静置40秒，将水容器中的上清液倒入套筛上，套筛的上层网筛为20目，底筛为80目，用同样方法将水容器中的沉淀物连续冲洗2-3次，用水冲洗20目上层网筛上的杂物使其中的线虫孢囊落入80目底筛上，然后倒掉20目上层网筛上的杂物。将上述步骤获得的底筛上的残余物冲洗到IOL水中，加水并充分搅拌，沉淀2分钟，用棉布擦拭去除漂浮在水表面的有机质或空、瘪孢囊，然后将上清液倒掉，重复冲洗 2 3次，最后将含有饱满孢囊的沉淀物倒入套筛上，套筛的上层网筛为30目，底筛为60 目，用水冲洗30目上层网筛，使其上的线虫孢囊均落入60目底筛上。然后配置密度为1. 19克/立方厘米的糖液，用糖液把60目底筛上的线虫孢囊和有机质沉淀物冲洗到含2L同密度糖液的烧杯中，用玻璃棒充分搅拌，待烧杯壁边缘出现大量孢囊时即可随时用湿棉布轻擦烧杯壁上的线虫孢囊，并用水将线虫孢囊冲洗到60底筛上；最后用水将60目底筛上的线虫孢囊冲洗干净。将漂浮的线虫孢囊在体式显微镜下检测计数，分离获得的小麦孢囊线虫孢囊纯净，3kg 土壤共获得1500个。实施例三在河北安国县大豆地块中采集大豆孢囊线虫病土，在20L水中加入2kg病土，搅拌后静置20秒，将水容器的上清液倒入套筛上，套筛的上层网筛为20目，底筛为60目，用同样方法将桶中的沉淀物连续冲洗2-3次，用水冲洗20目上层网筛上的杂物使其中的线虫孢囊落入60目底筛上，然后倒掉20目上层网筛。然后将上述获得的60目底筛上的残余物冲洗到2L烧杯中，加水并充分搅拌，沉淀 2分钟，用棉布擦拭去除漂浮在水表面的有机质或空、瘪线虫孢囊，然后将上清液倒掉，重复冲洗2 3次，最后将含有饱满线虫孢囊的沉淀物倒入套筛上，套筛的上层网筛为30目，底筛为60目，用水冲洗30目上层网筛，使其上的线虫孢囊均落入60目底筛上。配置密度为1. 17克/立方厘米的硫酸镁溶液，用硫酸镁液把60目底筛上的线虫孢囊和有机质混合物冲洗到含同密度硫酸镁溶液的2L烧杯中，用玻璃棒充分搅拌，待烧杯壁边缘出现大量孢囊时即可随时用湿棉布轻擦壁上的孢囊，并用水将线虫孢囊冲洗到60 目底筛上，用水将60目底筛上的线虫孢囊冲洗干净。将得到的线虫孢囊在体式显微镜下检测计数，分离获得的大豆孢囊线虫孢囊纯净，2kg 土壤共获得大豆孢囊线虫孢囊2500个。实施例四 在河北保定市郊小麦地块中采集小麦孢囊线虫病土，在40L水中加入4kg病土，搅拌后静置25秒，将水容器中的上清液倒入套筛上，套筛的上层网筛为20目，底筛为60目， 用同样方法将水容器中的沉淀物连续冲洗2-3次，用水冲洗20目上层网筛上的残余物使其中的线虫孢囊落入60目底筛上，然后倒掉20目上层网筛上的杂物。将上述获得的60目底筛上的残余物冲洗到2L烧杯中，加水并充分搅拌，沉淀2分钟，用棉布擦拭去除漂浮在水表面的有机质或空、瘪线虫孢囊，然后将上清液倒掉，重复冲洗2 3次，最后将含有饱满线虫孢囊的沉淀物倒入套筛上，套筛的上层网筛为20目，底筛为80目，用水冲洗20目上层网筛，使其上的线虫孢囊均落入80目底筛上。配置密度为1. 15的硫酸镁溶液，用硫酸镁液把80目底筛上的线虫孢囊和有机质混合物冲洗到含同密度硫酸镁溶液的2L烧杯中，用玻璃棒充分搅拌，待烧杯壁边缘出现大量线虫孢囊时即可随时用湿棉布轻擦壁上的线虫孢囊，并用水将线虫孢囊冲洗到80目底筛上，用自来水将80目底筛上的线虫孢囊冲洗干净。将漂浮的孢囊在体式显微镜下检测计数，分离获得的小麦孢囊线虫孢囊纯净，4kg 土壤共获得大豆孢囊线虫孢囊1200个。最后应说明的是以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制， 尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解其依然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。
权利要求
1.一种土壤中获得纯净线虫孢囊的方法，其特征在于，包括步骤101，在第一容器中将破碎后的含线虫孢囊的土壤与水按比例混合，搅拌后静置 20-40秒，将第一容器内的上清液倒入套筛上，所述套筛包括上层网筛和底筛，将第一容器内的沉淀物按上述方法连续处理2-3次后将所述上层网筛上的残余物中的线虫孢囊用水冲洗到所述底筛上；步骤103，将步骤101中所述底筛上的残余物用水冲洗到第二容器中，搅拌后沉淀 1.5-5分钟，去除漂浮在第二容器内悬浮液表面的有机质和空、瘪线虫孢囊，然后倒掉第二容器中的上清液，按上述方法冲洗步骤101中所述底筛上的残余物2 3次；步骤105，将所述第二容器中倒掉上清液后的沉淀物倒入套筛中，用水冲洗所述套筛的上层网筛；步骤107，将步骤105中所述套筛的底筛上的残余物冲入漂浮液中，搅拌后静置1-2分钟，将上述漂浮液中的漂浮物即线虫孢囊倒入底筛上，用水冲洗干净。
2.根据权利要求1所述的土壤中获得纯净线虫孢囊的方法，其特征在于所述在第一容器中将破碎后的含线虫孢囊的土壤与水按比例混合中土壤与水的比例介于15与 1 40之间。
3.根据权利要求2所述的土壤中获得纯净线虫孢囊的方法，其特征在于所述步骤101 中所述第一容器为10-70L圆筒状容器，所述上层网筛介于20目和30目之间，所述底筛介于60目和80目之间。
4.根据权利要求3所述的土壤中获得纯净线虫孢囊的方法，其特征在于所述第二容器为5-20L圆筒状容器。
5.根据权利要求4所述的土壤中获得纯净线虫孢囊的方法，其特征在于所述步骤105 中所述上层网筛介于20目和30目之间，所述底筛介于60目和80目之间。
6.根据权利要求5所述的土壤中获得纯净线虫孢囊的方法，其特征在于所述步骤107 中所述底筛介于60目和80目之间。
7.根据权利要求6所述的土壤中获得纯净线虫孢囊的方法，其特征在于所述漂浮液为糖液、硫酸锌、硫酸钠或硫酸镁溶液。
8.根据权利要求7所述的土壤中获得纯净线虫孢囊的方法，其特征在于所述糖液、硫酸锌、硫酸钠或硫酸镁溶液的密度介于1. 15-1. 2克/立方厘米之间。
9.根据权利要求8所述的土壤中获得纯净线虫孢囊的方法，其特征在于所述去除漂浮在第二容器内悬浮液表面的有机质和空、瘪孢囊具体为用棉布擦拭去除漂浮在第二容器内悬浮液表面的有机质和空、瘪孢囊。
全文摘要
本发明公开了一种土壤中获得纯净线虫孢囊的方法，首先将破碎后的土壤与水在容器内混合搅拌后静置，将上清液倒入套筛上，套筛包括上层网筛和底筛，将容器内沉淀物处理2-3次后冲洗上层网筛上的残余物到底筛；然后冲洗底筛上的残余物到另一容器中，搅拌后沉淀，去除悬浮液表面上的有机质和空、瘪孢囊后倒掉容器中上清液，按上述方法冲洗底筛上的残余物2～3次；再将容器中的沉淀物倒入套筛，冲洗上层网筛的沉淀物到底筛；最后将底筛上的残余物冲入漂浮液中，搅拌后静置，将漂浮液中漂浮物倒入底筛并冲洗干净。本发明通过采用上述方法，能够缩短原有方法从土壤中获得纯净线虫孢囊的时间，并可增加一次性获得纯净线虫孢囊的数量。
文档编号G01N1/34GK102297792SQ20101020820
公开日2011年12月28日 申请日期2010年6月24日 优先权日2010年6月24日
发明者李秀花, 陈书龙, 马娟 申请人:河北省农林科学院植物保护研究所