专利名称：一种高灵敏度的集成cmos光学生物芯片的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医学检测技术领域，具体涉及一种基于大规模集成电路技术的集 成CMOS光学生物芯片，用于抗原抗体、核酸分子等高灵敏检测。
背景技术：
生物芯片技术是20世纪微电子技术和生物技术交叉融合的一项新型技术，它以 阵列化为主要特征，结合精细的机械扫描、灵敏的光学检测、专一的软件处理和友好的可 视化界面，在生物医学领域得到广泛应用，特别在后基因时代，为海量基因片段进行功能信 息定位提供了一种非常重要的工具。生物芯片依据检测方法大致可以分为电学检测和光学检测两种方法，其中光学检 测方法因灵敏度高、抗干扰能力强、标记方便等因素而使用最为普遍，并有商用产品成功推 向市场，在临床医学、生物医学研究中得到广泛应用。在光学型生物芯片系统中，仪器结构 非常复杂，光路设计要求比较高，比如有稳定性和单色性都很高的激光器(有些生物芯片甚 至需要几种不同激发波长的激光器)、滤光片、分光镜、光阑、聚焦透镜等，还配备有专用的 机械扫描系统，由高灵敏光电探测器(如光电倍增管)实现对光电转换。因此设备价格昂贵， 检测费用也很高，体系结构庞大。因此如何研制一种价格便宜、使用灵活方便、可针对特定 应用对象的生物芯片成为目前研究的热点，对于研制出便携式的、低功耗、结构简单的生物 芯片也很具有重要价值。大规模集成电路工艺技术为批量化大规模生产集成电路器件提 供了可能，一方面通过批量化生产，大大降低单个电子器件的成本；另一方面，芯片上所有 器件都是在相同环境条件下完成，能尽可能保证器件的性能参数一致。
发明内容
本发明的目的在于提供一种便携式的、低功耗、结构简单的集成CMOS生物芯片。本发明提出的高灵敏集成CMOS光学生物芯片，包括
(1)一种基于大规模集成电路技术制备的CMOS光电探测器；
(2)固定于CMOS光电探测器表面的目标分子；
(3)可与目标分子发生特异性相互作用的检测分子，实现对目标分子进行识别；所述检 测分子含有一引物，引发一种或者多种滚环扩增的复制产物，复制产物仍然连接在检测分 子表面；
(4)G-quadruplex-hemin复合结构，通过连接臂固定在滚环扩增的产物上；
(5)在G-quadruplex-hemin催化下，Iuminol和双氧水发生化学发光，产生光信号，由 CMOS光电探测器进行光电转换，实现一种或者多种的目标分子的鉴定。本发明中，所述CMOS光电探测器集成了光电转换电路模块、光电流读出电路模块 和模数转换电路模块；其中，所述的光电转换电路模块为阵列化的CMOS工艺的光电二极 管、CMOS工艺的雪崩光电二极管或者CMOS工艺的光电三极管；所述的光电流读出电路模块 为电阻性跨阻抗放大器或者电容性跨阻抗放大器，它将光电流转换为电压信号；所述的模数转换电路模块是将电流读出电路模块产生的电压信号转换为数字信号，便于后续进一步 数字化处理。本发明中，所述目标分子为核酸(DNA或者RNA)、寡核苷酸链或者多核苷酸链。对 应的检测分子为核酸、寡核苷酸链或者多核苷酸链，该检测分子有一部分能与所述的目标 分子互补配对，另一部分作为引物，产生一种或者多种滚环扩增产物。本发明中，所述目标分子也可为抗原抗体、多肽或者蛋白质。对应的检测分子为抗 体抗原或者其他配体，检测分子该与所述的目标分子能特异性相互作用而结合在一起，而 且该检测分子修饰有一段引物，以产生一种或多种滚环扩增产物。本发明中，所述滚环扩增是线性扩增复制产物。本发明中，所述G-quadruplex-hemin是由含多鸟嘌呤(G)核苷酸链分子内形成的 quadruplex结构，与hemin (氯化血红素)复合形成的具有过氧化酶催化功能结构，这种复 合结构通过连接臂与滚环扩增产物连接起来。本发明中，所述连接臂是一寡核苷酸链，通过碱基互补配对方法链接到所述的滚 环扩增复制的产物中。本发明涉及的生物芯片检测方法基本原理如下
采用大规模集成电路工艺技术设计出基于CMOS工艺的光电探测芯片版图，然后流片 并进行光学性能测试。该芯片包括光电转换电路模块、光电流读出电路模块和模数转换电 路模块。光电转换电路模块将光信号转换为光电流；光电流读出电路模块将光电流转换为 电压信号；模数转换模块将模拟的电压值转换为数字的电压信号，以便后续进行分析检测。光电探测芯片表面覆盖上SiO2,—方面可以保护芯片，另一方面可以固定上目标 分子。光电探测芯片表面通过化学修饰、物理吸附作用、自组装等方式固定上目标分子。检 测分子通过分子间特异性相互作用结合到目标分子，从而实现对目标分子的识别。检测分 子连接有一段DNA链，该链作为引物，可以引发DNA等温滚环扩增。滚环扩增是一种等温扩增过程，以检测分子上连接的一段DNA链为引物，以环状 DNA链为扩增模版，在DNA聚合酶作用下，将dNTP进行聚合反应达到DNA链的延长，从而在 检测分子上产生由数百个反复连接的重复结构单位组成的长链，每个重复结构单位都与环 状DNA链互补配对。经过滚环扩增过程后，在检测分子上连接上一长DNA单链，而检测分子 仍然固定于光电探测芯片表面。G-quadruplex是含有特定多聚鸟嘌呤(G)的核苷酸链，多聚鸟嘌呤在空间互相螯 合，形成特殊的空间结构。在加入hemin (氯化血红素)后，hemin与G-quadruplex形成 G-quadruplex-hemin复合结构(即DNAzyme)，该结构具有过氧化物酶催化功能，催化H2O2和 Iuminol发生化学发光，光电探测芯器对该光信号进行检测。DNAzyme通过连接臂与滚环 扩增产物进行连接。连接臂是一段寡核苷酸链，与滚环扩增产物的重复结构单位互补配对， 从而将DNAzyme连接到滚环扩增产生的长链上。本发明具有显著的技术进步和使用价值，其有益效果体现如下
采用大规模集成电路工艺技术制造光电探测器，可以批量规模化生产，大大降低单个 生物芯片的价格，甚至可以制作成一次性使用的生物芯片；在传统的生物芯片的检测电路 中，光电探测器模块、光电流读出模块和模数转换模块均有分离器件组成，增加系统噪声， 降低了检测的灵敏度，而本发明光电转换电路模块、光电流读出电路模块和模数转换电路模块集成在一个芯片内，增加了功能模块的集成度，大大降低噪声；
本发明所谓的生物芯片不含有任何光学元件(如聚焦透镜、滤光片、光栅、光学增强系 统和光源等)，系统结构紧凑；
本发明采用的DNAzyme催化的化学发光方法，无需激光器等作为光源，大大降低背景 噪声，提高检测灵敏度，同时由于结合滚环扩增技术，将检测分子通过等温扩增技术后结合 上数百个DNAzyme分子，相当于检测分子上连接上数百个辣根过氧化物酶分子，而传统的 过氧化物酶催化的酶联免疫分析技术，检测分子(如抗原、抗体)与过氧化酶的比例基本在 1 :1 1 :3，化学发光强度一定程度上与酶分子的浓度成线性关系，因此结合滚环扩增技术 后极大提高了化学发光检测灵敏度。
图1高灵敏集成CMOS光学生物芯片外观图和结构图。图2高灵敏集成CMOS光学生物芯片结构功能图。图3高灵敏集成CMOS光学生物芯片检测原理图。其中，(1)目标分子固定到CMOS 光电探测器表面；(2)检测分子(连接有引物)与目标分子特异性结合；(3)滚环扩增后检测 分子的DNA链延长；(4)延长后的DNA链与G-quadruplex-hemin分子结合起来；(5)加入 Iuminol和H2O2后发生化学发光；(6)化学发光的光信号由CMOS光电探测器转换为电信号， 并进行后续处理和分析。图4滚环扩增反应示意图(弧线ab、bc、cd、de.ef等为反复连接的重复结构单位， 每个重复结构单位都能与环型DNA链互补配对，为环型DNA链的拷贝，为了区别起见画成弧 形，实际是线性核苷酸链)。图5 G-qudadruplex-hemin (DNAzyme)示意图(左边为空间结构图，右图为简化 图)。图6 DNAzyme与滚环扩增后长链DNA的连接示意图。图7 DNAzyme催化化学发光反应式。图中标号1、DNAzyme (G-quadruplex-hemin) ；2、检测分子；3、光电转换电路模 块；4、光电流读出电路模块；5、模数转换电路模块；6、滚环扩增延伸链；7、目标分子；8、二 氧化硅层；9、引物；10、滚环扩增产生的重复结构单位；ll、DNAzyme的连接臂；12、Hemin分 子；
具体实施例方式
CMOS光电探测器阵列的制作。每个CMOS光电探测器将光电转换电路模块3、光电流读 出电路模块4和模数转换电路模块5集成在一块芯片上，降低了噪声干扰，提高检测微弱光 信号的能力。每个芯片尺寸在几十微米到几百微米，芯片阵列间隔在几十微米。基于CMOS 工艺的光电探测器采用SMIC 0. 18ym的N阱CMOS工艺基础上，以CMOS工艺兼容的N + /Psub型光电二级管作为光电转换模块3，将光信号转换为光电流。该光电二级管最大光电 转换灵敏度为0. 206A/W，峰值响应波长为480nm，在420nm处灵敏度为0. 15A/W。由于CMOS 光电二级管没有内部增益，光电转换效率低，因此需要通过集成的后续电路改善检测灵敏 度。光电流读出电路模块4将光电流转换为电压信号，采用伪差分电容型跨阻抗放大器。电 容型跨阻抗放大器由一个放大器、一个复位开关和积分电容组成。伪差分读出电路模块含有主探测器和冗余探测器共同构成差分电路。主探测器主要实现光电转换的光电二级管， 而冗余探测器是表面覆盖金属的光电二级管，用来消除暗电流的影响，从而抑制CMOS光电 探测器的共模干扰。光电流读出电路模块4产生的电压是模拟量，通过模数转换电路模块 5使其数字化。模数转换模块5设计采用12-bit、10-MS/s的模数转换器结构。
CMOS光电探测器表面覆盖一层二氧化硅8，其表面修饰主要通过APTES和戊二醛 化学反应，具体步骤如下先用乙醇和丙酮清洗光电探测器二氧化硅8表面，然后通入2% (重量)的APTES溶液1 2个小时，再用乙醇清洗，从而在光电探测器表面形成了有机硅分 子链，该有机硅分子链含有伯氨。然后加入含2. 5% (重量)的戊二醛和4mM的NaBH3CN溶液 0. 8^1. 2小时，然后用pH为7 7. 6的PBS (磷酸缓冲液)清洗，从而将戊二醛修饰到有机 硅分子表面。将前列腺癌标志性蛋白质PSA通过点样机滴到有机硅分子链修饰的光电探测 器表面，恒温37°C孵育30分钟左右，然后用pH为7 7. 6的PBS (缓冲液)反复清洗，洗脱 掉未结合蛋白质，从而在光电探测器表面形成目标分子7。未被PSA分子覆盖的活性位点用 牛血清白蛋白(BSA)进行封闭。然后加入羊抗人单克隆抗体IgG-DNA与之37°C孵育半小 时。其中羊抗人单克隆抗体IgG为检测分子2，而与之耦联的DNA链为引物链9。用PBS缓 冲液洗脱掉未被吸附的分子，然后加入滚环扩增反应液(含dNTP、phi29缓冲液、phi29聚合 酶和环型DNA分子链)进行孵育45分钟左右，从而在检测分子2连接上滚环扩增延伸链6， 该链是由数百个反复连接的重复结构单位10组成的长链。用缓冲液清洗掉滚环扩增反应 液后，加入 G-quadruplex-hemin 溶液，G-quadruplex 链分子结构如下 S-ATGCGCATGCTCAA rr/iGGGTAGGGCGGGTTGGG-3'(SIQ. ID. NO. 1 )，其中画横线部分就是G-quadruplex，由三个连续 鸟嘌呤相连形成特定的分子内聚合结构，并与hemin分子12形成G-quadruplex-hemin(即 DNAzyme)结构1，分子结构示意图见图5。在G-quadruplex分子结构中斜线部分是DNAzyme 连接臂11，连接臂11与滚环扩增产物中的重复结构单位10互补配对，从而将DNAzyme分子 1结合到滚环扩增延伸链6上，见图6。DNAzyme分子1具有辣根过氧化酶催化化学发光的 功能，其催化化学发光的反应方程式见图7。化学发光产生的光信号由CMOS光电探测器转 换为电信号，并进行后续信号分析。由于化学发光强度与检测分子1的浓度有关，而检测分 子1与目标分子7间存在特异性关系，从而实现对目标分子7进行定性和定量分析。由于 本芯片设计时，采用CMOS光电探测器的阵列化，而目标分子7也是阵列化点样固化，因此可 以在阵列化光电探测器不同区域点样不同目标分子7，通过对光电探测器阵列中的每一个 探测器进行化学发光信号分析，从而对不同目标分子7进行识别。
权利要求
一种高灵敏度的集成CMOS光学生物芯片，其特征在于该芯片包括(1)一种基于大规模集成电路技术制备的CMOS光电探测器；(2)固定于CMOS光电探测器表面的目标分子；(3)可与目标分子发生特异性相互作用的检测分子，实现对目标分子进行识别；所述检测分子含有一引物，引发一种或者多种滚环扩增的复制产物，复制产物仍然连接在检测分子表面；(4)G quadruplex hemin复合结构，通过连接臂固定在滚环扩增的产物上；(5)在G quadruplex hemin催化下，luminol和双氧水发生化学发光，产生光信号，由CMOS光电探测器进行光电转换，实现一种或者多种的目标分子的鉴定。
2.如权利要求1所述的集成CMOS光学生物芯片，其特征在于所述CMOS光电探测器集 成了光电转换电路模块、光电流读出电路模块和模数转换电路模块；其中，所述的光电转换 电路模块为阵列化的CMOS工艺的光电二极管、CMOS工艺的雪崩光电二极管或者CMOS工艺 的光电三极管；所述的光电流读出电路模块为电阻性跨阻抗放大器或者电容性跨阻抗放大 器，它将光电流转换为电压信号；所述的模数转换电路模块是将电流读出电路模块产生的 电压信号转换为数字信号，便于后续进一步数字化处理。
3.如权利要求1所述的集成CMOS光学生物芯片，其特征在于所述目标分子为核酸、寡 核苷酸链或者多核苷酸链。
4.如权利要求3所述的集成CMOS光学生物芯片，其特征在于所述检测分子为核酸、寡 核苷酸链或者多核苷酸链，该检测分子有一部分能与所述的目标分子互补配对，另一部分 作为引物，产生一种或者多种滚环扩增产物。
5.如权利要求1所述的集成CMOS光学生物芯片，其特征在于所述目标分子为抗原抗 体、多肽或者蛋白质。
6.如权利要求5所述的集成CMOS光学生物芯片，其特征在于所述检测分子为抗体抗原 或者其他配体，检测分子该与所述的目标分子能特异性相互作用而结合在一起，而且该检 测分子修饰有一段引物，以产生一种或多种滚环扩增产物。
7.如权利要求1所述的集成CMOS光学生物芯片，其特征在于所述滚环扩增是线性扩增复制产物。
8.如权利要求1所述的集成CMOS光学生物芯片，其特征在于所述 G-quadruplex-hemin是由含多鸟嘌呤(G)核苷酸链分子内形成的quadruplex结构，与 hemin复合形成的具有过氧化酶催化功能结构。
9.如权利要求1所述的集成CMOS光学生物芯片，其特征在于所述连接臂是一寡核苷酸 链，通过碱基互补配对方法链接到所述的滚环扩增复制的产物中。
全文摘要
本发明属于生物医学检测技术领域，具体为一种高灵敏度集成CMOS光学生物芯片。该芯片含有基于CMOS工艺的光电探测器,光电探测器包括光电转换电路、光电流读出电路和模数转换电路；目标分子固定于光电探测器表面，分子探针结合到目标分子上；所述分子探针链接有一段引物链，经过滚环扩增后分子探针上连接有由数百个相同重复结构单位组成的超长链，每一个重复结构单位通过核苷酸互补配对作用，再连接上具有过氧化物酶催化化学发光功能的DNAzyme结构，加入底物后发生化学发光，光信号由光电探测器转换为电信号。整个芯片系统基于CMOS工艺，没有光学元件，背景噪声低，系统结构简单，成本降低；采用滚环扩增技术和特定DNAzyme结构，极大提高了检测灵敏度。
文档编号G01N33/53GK101907573SQ20101025543
公开日2010年12月8日 申请日期2010年8月17日 优先权日2010年8月17日
发明者刘冉, 洪志良, 秦亚杰, 郭红斌, 陈国平 申请人:复旦大学