莱克多巴胺残留的时间分辨免疫分析检测试剂盒及其检测方法

专利名称：莱克多巴胺残留的时间分辨免疫分析检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明属于免疫检测技术领域，涉及一种化学品污染残留的检测试剂盒及其制备 方法，具体涉及一种检测莱克多巴胺残留的时间分辨免疫分析试剂盒及其制备方法。
背景技术：
食品安全是关系到广大人民的日常生活的一件大事。食品安全问题主要包括食品 中的物理危害、化学危害和微生物危害等几个因素，其中化学危害主要包括兽药残留、农药 残留、重金属、环境有害物等。在过去的几十年中，随着集约化养殖业的发展，兽药作为添加剂及药物广泛在畜 牧业中使用，由此导致的动物性食品中兽药的残留问题日益突出。其主要是指动物在使用 药物预防、治疗疾病时，使用促生长饲料药物添加剂后药物以原形或其代谢产物蓄积在动 物的组织器官或可食性产品(如奶、蛋)中。同一动物不同脏器兽药残留量不同，按残留量 由高到低一般为肝>胆汁>肾>肌肉，注射部位及脂肪的残留量一般也较多。非法添加和 加大药量，不遵守休药期规定，任意扩大使用范围和滥用药物等行为造成的兽药残留事件， 已严重危害到人民群众的健康，严重者甚至可以引起死亡，同时这些残留药物也会对环境 产生影响，对周围食品产生再次污染。莱克多巴胺(Ractopamine，简称RAC)，又名雷托巴胺，化学名为1_(4_羟基苯 基)-2 [1-甲基-3- (4-羟基苯基)-丙氨基]-乙醇盐酸盐，属于D 2-肾上腺受体激动剂类 药物，是继克伦特罗后最常被滥用添加的D2-肾上腺受体激动剂类药物，其结构式如式(I)
所示它是一种医药原料，一种可用于治疗冲血性心力衰竭症的强心药。还可以用于治 疗肌肉萎缩症，增长肌肉，减少脂肪蓄积，并对胎儿和新生儿生长有益。美国FDA在2000年 批准，可以用于动物营养重新配剂，广泛地用于畜牧业和养殖业。可以同时提高动物的日增
重，提高饲料利用率，提高动物的蛋白质含量。但由于D 2-兴奋剂易在动物脏器中积聚残 留，并可通过食物链进入人体，严重危害人类健康。目前，莱克多巴胺是最常用的添加剂之 一，在我国滥用尤其严重，其逐步取代克仑特罗，成为不法分子谋取经济利益的新手段。建 立快速、简单、方便、有效的检测手段是目前控制莱克多巴胺非法使用的迫切任务。目前，检测RAC残留的方法主要有以下几种高效液相色谱法(HPLC)、气相色 谱-质谱法(GC-MS)、液相色谱-质谱法(LC-MS)、毛细管区带电泳法(CE)以及免疫分析方法(IA)。仪器方法虽然灵敏精确，但需要昂贵的专业仪器，分析费时，成本较高。免疫分析 方法具有简单、快速、灵敏及成本低的特点，可达痕量(μ g kg—1)水平，是目前世界各国推行 并实施的一种高通量初筛方法，时间分辨免疫分析检测方法属于免疫分析方法的一种，其 实际上是在荧光分析(FIA)的基础上发展起来的，是一种特殊的荧光分析。时间分辨免疫分析(TRFIA)的基本原理是其采用了特殊的镧系金属即三价稀土 离子(Eu3+、Tb3+、Dy3+、Sm3+)及螯合剂(代替荧光物质、同位素或酶)。标记蛋白质、多肽、激 素、抗体、核酸探针或生物活性细胞，待反应体系(如抗原抗体反应、核酸探针反应、生物素 亲和素反应、靶细胞与效应细胞的杀伤反应等)发生后，用时间分辨分析仪测定最后产物 中的荧光强度，根据荧光值的强弱，判断体系中分析物的浓度，达到定量分析的目的。时间分辨免疫分析检测方法在国外已被广泛应用于临床检测，近年在许多新领域 得到应用，如免疫组织化学、微阵列，并可用于双标记、三标记和四标记等多标记免疫分析。 荧光免疫检测方法作为一项具有广阔发展潜力的新兴生物学技术，已经给标记免疫学带来 一场革命。本发明对免疫检测技术进一步应用于食品中兽药残留的快速检测提供一种新途 径。但目前尚无采用时间分辨免疫分析法检测莱克多巴胺的相关技术报道，更没有一 种适合进行莱克多巴胺时间分辨免疫分析检测的试剂盒，以便于实现高灵敏度、操作简单 的大批量快速检测。

发明内容
本发明的一个目的是克服现有技术的不足，提供一种检测莱克多巴胺残留的时间 分辨免疫分析检测试剂盒。本发明的另一个目的是提供所述检测莱克多巴胺残留的方法，高灵敏度、操作简 单，能大批量快速检测。本发明的目的通过以下技术方案予以实现提供一种检测莱克多巴胺残留的时间分辨免疫分析检测试剂盒，包括包被了莱克 多巴胺抗原的酶标板、莱克多巴胺抗体、镧系元素标记羊抗兔或羊抗鼠抗体(二抗)；所述 镧系元素包括Eu3+、Tb3+、Dy3+、Sm3+等稀土元素。所述莱克多巴胺抗原是碳二亚胺法(EDC)、活泼酯法(DCC、NHS)、混合酸酐法(氯 甲酸异丁酯)将莱克多巴胺半抗原与载体蛋白进行偶联得到的。所述载体蛋白包括牛血清 白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)等载体蛋白。将莱克多巴胺与氯乙酸钠进行卤代反应，取代莱克多巴胺分子上的羟基，合成含 有2个碳的羧基间隔臂的莱克多巴胺半抗原；或将顺丁烯二酸酐与莱克多巴胺中的氨基进 行酰化反应，合成含有4个碳的羧基间隔臂的莱克多巴胺半抗原。将含有2个碳的羧基间隔臂的半抗原用于免疫原的制备，将含有4个碳的羧基间 隔臂的半抗原用于包被原的制备，免疫原与包被原通过柱层析进行纯化，纯度经SDS-PAGE 电泳鉴定。本发明免疫原与包被原采用不同的半抗原结构将更有利于提高检测的灵敏度。所述莱克多巴胺抗体包括单克隆抗体、兔多克隆抗体或基因工程抗体。单克隆抗体的制备动物免疫以含有2个碳的羧基间隔臂的半抗原与载体蛋白偶联物为免疫原对Balb/c小鼠进行间隔免疫，间接免疫分析检测并得到血液里含有莱克多巴胺特异性抗体的 小鼠脾脏。细胞融合与克隆取产生特异性抗体的Balb/c小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP20融 合，采用间接竞争时间分辨免疫分析方法测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法或 显微克隆法对阳性孔进行克隆化，得到并建立产单克隆抗体的杂交瘤细胞株。细胞冻存和复苏取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成细胞悬液，分装 于冻存管，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37°C水浴中速融，离心去除冻 存液后，移入培养瓶内培养。单克隆抗体的制备与纯化采用体内诱生法，将Balb/c小鼠(8周龄)腹腔注入灭 菌石蜡油，7 14天后腹腔注射杂交瘤细胞，7 10天后采集腹水。经辛酸-饱和硫酸胺 法或亲和层析法进行腹水纯化，纯度经SDS-PAGE电泳鉴定，小瓶分装，-20°C保存。莱克多巴胺兔多克隆抗体的制备采用新西兰大白兔作为免疫动物，以莱克多巴胺与载体蛋白偶联物为免疫原对新 西兰大白兔进行免疫，多次免疫后测定血清抗体效价，心脏采血，经硫酸胺分级沉淀得到纯 化的多克隆抗体。莱克多巴胺基因工程抗体的制备基因工程抗体主要指小分子抗体，包括Fab (由完整的轻链和Fd构成)，Fv (由Vh 和\构成)，ScFv (单链抗体，Vh和\之间由一条连接肽连接而成)，单域抗体(仅由Vh组 成)等经基因工程技术改造后的抗体。制备方法为提取莱克多巴胺单克隆细胞或经莱克多巴胺免疫原免疫后的小鼠 脾细胞的RNA，反转录为cDNA，设计抗体轻重链扩增引物，利用PCR技术扩增出抗体的轻 重链基因，插入适当的表达质粒，在大肠杆菌中表达，利用免疫亲和方法进行纯化，纯度由 SDS-PAGE电泳鉴定。所述镧系元素标记羊抗兔或羊抗鼠抗体的制备，以Eu3+标羊抗兔为例，取溶 解于0. 05mol/L PBS pH7. 0的5mg/mL羊抗鼠IgG Iml，经PD-10柱转换缓冲盐条件， 洗脱液为50mmol/L pH 9. 6NaC03-NaHC03缓冲液。收集蛋白峰，经紫外吸收分析定量 (1. 46A280-0. 74A260)，用上述洗脱液稀释羊抗鼠至2mg/mL。取500 μ L稀释后的羊抗鼠IgG 加入含0. 2mg的Eu3+-N2-[ρ-异氰酸-苄基]-二乙酸烯三胺四乙酸(Eu3+-DTTA)的棕色小 瓶中，置于28°C恒温烘箱中反应48h，反应液用50mmol/L Tris-HCl pH 7. 8缓冲液平衡的 SepharoseCL-6B (1 X 30cm)层析，测定每管的荧光计数值，检测稀释后的第一个计数峰，稀 释后备用。标记率=标记个/IgG分子数为了方便现场操作和批量检测，所述试剂盒还可以包括莱克多巴胺标准溶液、增 强液、浓缩洗涤液、样品稀释浓缩液。优选地，还可以包括盒体、包被缓冲液、洗涤缓冲液、封闭液和盖板膜。所述莱克多巴胺标准溶液是浓度为1000 μ g/L的莱克多巴胺(RAC)标准品贮备 液，使用前再配成浓度梯度为8 μ g/L、4 μ g/L,2 μ g/L、1 μ g/L、0. 5 μ g/L、0 μ g/L的莱克多 巴胺(RAC)标准品贮备液。所述增强液包括β - 二酮体、三辛基氧化磷(TOPO)、TritonX-100、冰醋酸和邻苯二甲酸氢钾(pH值为2.0 3. 2)；将6mL冰醋酸用0. lmol/L的邻苯二甲酸氢钾调pH值至 3. 2，加入 15 μ mol β - 二酮体(β -ΝΤΑ)，50 μ mol 三辛基氧化膦，ImL Triton X-100，加三 蒸水定容至1L。所述浓缩洗液包括0. 5 1. 5 % (体积比浓度)。吐温20的磷酸盐缓冲液(pH值7. 4，0. lmol/L)，为常规使用浓度的15 25倍。所述浓缩稀释液pH值7. 4 8. 0,0. 1 0. 25mol/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐 (Tris-HCl)，为常规使用浓度的5 15倍。酶标板是96孔酶标板，采用聚苯乙烯微孔板，该微孔板包被有浓度为75 μ g/L抗 莱克多巴胺抗原，并封闭微孔表面未吸附位点；以封闭液室温封闭，所述封闭液包括溶于 PBS的脱脂奶粉溶液(5g脱脂奶粉100mL PBS)。以稀释液稀释至终浓度3 % (体积比浓 度)的小牛血清3mL (灭活)。本发明主要试剂以工作液的形式提供，节省操作时间，试剂盒的制备方法如下(1)包被了莱克多巴胺抗原的酶标板的制备方法将RAC-OVA以包被缓冲液稀释 为75μ g/L，向酶标板微孔中加入抗原100 μ L，放入4°C冰箱中包被过夜，室温平衡后洗板 两次，以脱脂奶粉封闭液(250yL)37°C封闭lh，洗板三次，用无尘吸水纸上拍干，干燥后用 铝膜真空密封保存。固定莱克多巴胺抗原载体为以下物质中的一种，例如聚苯乙烯、硝酸纤 维素、聚乙烯、聚丙烯、聚丙烯酰胺、交联葡萄糖、玻璃、硅橡胶或琼脂糖凝胶等。(2) RAC抗体稀释液的制备方法将RAC单克隆抗体用辛酸-硫酸铵法纯化后，用 PBS稀释成lmg/mL分装备用。(3)Eu3+ 标羊抗鼠用含 0. 2%的 pH 7. 85Tris_HCl 稀释 200 倍(4)莱克多巴胺标准溶液的配制以浓度为1000 μ g/L的RAC作为贮备液，使用前 再配成浓度梯度为0、0. 1,0. 3,0. 9,2. 7,8. 1 μ g/L的RAC标准品工作液。(5)增强液的配制6mL冰醋酸用0. lmol/L的邻苯二甲酸氢钾调pH值至3. 2，加 Λ 15 μ mol Q- 二酮体(□ -NTA)，50 μ mol 三辛基氧化膦(Τ0Ρ0)，ImL Triton X-100，加三 蒸水定容至1L。(6)包被缓冲液的配制取 Na2CO3O. 375g，NaHCO3O. 732g，NaCl 2. 250g， NaN3O. 100g，加蒸馏水至250mL，得0. lmol/L碳酸盐缓冲液。(7)洗涤缓冲液(PBST)的配制取 KH2P040. 4g，Na2HPO4 · 12Η205· 8g，NaCl 16. Og, KCl 0. 4g, Tween-201. OmL，加蒸馏水至 2000mL。(8)封闭液1)脱脂奶粉5g溶于IOOmL PBS ；2)小牛血清3mL(灭活)，以稀释液
稀释至终浓度3%。(9)稀释液(50mmol/L Tris-HCl, pH 7. 85)取 Tris-base 6. 4g, NaCl 9. 0g, NaN3O. 4g，以浓HCl (12M)调整其pH值为7. 85，加蒸馏水定容至IL0本发明同时提供了检测莱克多巴胺残留的方法，包括以下步骤(1)样品前处理；a.尿液样本处理清澈尿液样品可以直接进行检测分析。若尿样呈浑浊状，2000r/min离心5min或 过滤，用上清液检测。b.饲料样本处理
将饲料粉碎，称取2g置于50mL试管中，加入12mL10%氨化甲醇(pH值为9 10的 氨水溶液9份+甲醇1份)，充分混勻振荡广2min。加入9mL乙酸乙酯，振荡20min。5000r/ min(4000g)离心lOmin。取有机相500 μ L于另一试管中，用氮气吹干。加入样品稀释液 500 μ L稀释后直接检测。稀释倍数10应在结果计算中考虑。c.组织(肌肉、肝脏、肾脏等)样本处理将组织破碎，用超声仪或类似仪器将组织均质化，称取2g均质化后的组织样本置 于可密封的试管中，加IOmL纯甲醇，涡旋混勻5min。10000r/min离心5min或3000r/min离 心20min，取上清。沉淀中再加入IOmL纯甲醇，涡旋混勻后离心(方法同前)，取上清。混 勻两次离心上清，取出IOmL用氮气吹干。取ImL样品稀释液重新充分溶解后用于检测(注 意溶解后请立即进行分析检测)。稀释倍数为1。(2)利用本发明试剂盒对标准溶液和样品进行检测。(3)根据标准曲线与样品溶液荧光值计算样品浓度。应用所述试剂盒进行检测具体包括以下步骤(1)将试剂盒从冷藏环境中取出，置于20 24°C环境中平衡不少于30min，将酶标 板条固定，做两个平行实验，按顺序编号。(2)在标准品孔加入50 μ L标准溶液，样品孔加/入50 μ L待测样品，然后每孔加 入50 μ L莱克多巴胺单克隆抗体工作液，混勻；振荡反应45min。(3)待反应后洗板六次，并在吸水纸上拍干，以保证完全除去孔中的液体。每孔加 入100 μ L铕标二抗工作液，振荡反应45min。(4)待反应后洗板六次，并在吸水纸上拍干，以保证完全除去孔中的液体。每孔加 入200 μ L增强液，混勻，避光室温轻拍振荡5min。(5)用时间分辨免疫分析(TRFIA)检测仪测定各孔荧光值。(6)根据标准溶液荧光值与浓度半对数做标准曲线，根据标准曲线与样品溶液荧 光值计算样品浓度。检测结果处理与分析以所获标准样品吸光值的平均值计算百分荧光值，以百分荧光值为纵坐标，莱克 多巴胺标准溶液浓度的半对数为横坐标绘制标准曲线，求出直线方程。用同样的方法计算 样品溶液的百分荧光值，根据方程式求出对应样品的莱克多巴胺浓度。所述百分荧光值的 计算式为百分荧光值(％) = (B/B0) X 100其中，B为标准溶液或样品的平均荧光值，Btl为O μ g/L标准溶液的平均荧光值。检测结果的分析还可以利用计算机专业软件进行计算与分析，对莱克多巴胺线性 检测范围为0. 1 8. 1 μ g/L，检测限可达到0. 01 μ g/L，整个检测过程需2h就可以完成。本发明的有益效果本发明采用镧系元素作标记物，DTTA为螯合剂，建立了对莱克多巴胺的定量分析 方法，此法操作流程短、简单、快速，精密度和准确度均较好，样品前处理简单，尤其是采用 铕(Eu3+)作标记物，DTTA为螯合剂，效果好，成本低。浓缩洗涤液为含0. 5 1. 5%吐温20的磷酸盐缓冲液(pH7. 4,0. lmol/L)，为正常 使用浓度的15 25倍；所述样品稀释浓缩液为pH7. 4 8. 0,0. 1 0. 25mol/L的磷酸盐缓冲液，为正常使用浓度的5 15倍。以便于减少体积，方便在试剂盒中配备。本发明采用密封保存的方式保证所述酶标板的空白板的荧光值低于1000，保证没 有稀土元素的污染。本发明使用酸性增强液，使铕离子(Eu3+)从螯合物中解离下来，游离的Eu3+在三辛 基氧化膦协同下，重新与二酮体形成一种新的能够高效率地接受激发光的螯合物。在 激发光激发下，铕离子获能，经过电子跃迁并返回基态，便可发射出极强的荧光信号，在时 间分辨免疫(TRFIA)分析仪上读出其荧光值，其灵敏度可达16Xl(T18m0lEU3+。


图1莱克多巴胺(RAC)的半抗原一级ESI-MS图谱图2莱克多巴胺(RAC)的半抗原二级ESI-MS图谱图3标准曲线
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。下述实施例中所使用的试验 方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径 得到的试剂和材料。实施例1半抗原的制备莱克多巴胺半抗原的合成路线如下所示
权利要求
一种检测莱克多巴胺残留的时间分辨免疫分析检测试剂盒，其特征在于包括包被了莱克多巴胺抗原的酶标板、莱克多巴胺抗体、镧系元素标记羊抗兔或羊抗鼠抗体；所述镧系元素为Eu3+、Tb3+、Dy3+或Sm3+。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述莱克多巴胺抗原是将莱克多巴胺和 载体蛋白偶联得到；所述莱克多巴胺抗体包括单克隆抗体、兔多克隆抗体或基因工程抗体。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于还包括莱克多巴胺标准溶液、增强液、浓 缩洗涤液和样品稀释浓缩液。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述莱克多巴胺标准溶液是以浓度 为1000 μ g/L的莱克多巴胺标准品配成的浓度梯度为8μ g/L、4 μg/L、2μ g/L、1μ g/L、 0. 5μ g/L、0μ g/L的莱克多巴胺标准品工作液。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述增强液包括β-二酮体、三辛基氧化 磷、Triton X-100、冰醋酸和pH值为2. 0 3. 2的邻苯二甲酸氢钾。
6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述浓缩洗液包括0.5 1. 5%的吐温 20的磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液pH值为7. 4，浓度为0. lmol/L ；所述浓缩稀释液为 pH 值 7. 4 8. 0,0. 1 0. 25mol/L 的 Tris-HCl。
7.根据权利要求1所述的时间分辨免疫分析试剂盒，其特征在于所述酶标板是96孔酶 标板，包被有浓度为75μ g/L抗莱克多巴胺抗原，并封闭微孔表面未吸附位点；所述封闭液 包括溶于PBS的脱脂奶粉溶液。
8.一种莱克多巴胺的检测方法，其特征在于包括以下步骤(1)样品前处理；(2)用权利要求1 7任一项所述的试剂盒进行检测；(3)结果处理与分析。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于所述样品前处理为(1)尿液样本处理清澈尿液样品可以直接进行检测分析；若尿样呈浑浊状，2000r/min离心5min或过滤， 用上清液检测；或(2)饲料样本处理将饲料粉碎，称取2g置于50mL试管中，加入12mL10%氨化甲醇，充分混勻振荡1 2min，加入9mL乙酸乙酯，振荡20min，5000r/min离心lOmin，取有机相500 μ L于另一试管 中，用氮气吹干，加入样品稀释液500 μ L稀释后直接检测；或(3)组织样本处理所述组织包括肌肉、肝脏或肾脏；将组织破碎和均质化，称取2g均质化后的组织样本 置于可密封的试管中，加IOmL纯甲醇，涡旋混勻5min，10000r/min离心5min或3000r/min 离心20min，取上清，沉淀中再加入IOmL纯甲醇，涡旋混勻后离心，取上清，混勻两次离心上 清，取出IOmL用氮气吹干，取ImL样品稀释液重新充分溶解后用于检测。
10.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于包括以下步骤(1)将试剂盒从冷藏环境中取出，置于20 24°C环境中平衡不少于30min，将酶标板条 固定，做平行实验，按顺序编号；(2)在标准品孔加入50μ L标准溶液，样品孔加入50 μ L待测样品，然后每孔加入(50 μ L莱克多巴胺单克隆抗体工作液，混匀；振荡反应；(3)步骤(2)所述振荡反应后洗板，拍千，每孔加入100μ L铕标二抗工作液，振荡反应；(4)步骤(3)所述振荡反应后洗板，拍干，每孔加入200μL增强液，混勻，避光室温轻拍 振荡；(5)用TRFIA检测仪测定各孔荧光值；(6)根据标准溶液荧光值与浓度半对数做标准曲线，根据标准曲线与样品溶液荧光值 计算样品浓度。
全文摘要
本发明提供了一种莱克多巴胺残留的时间分辨免疫分析检测试剂盒及其检测方法。本发明所述试剂盒包被有莱克多巴胺抗原的酶标板，镧系元素标记羊抗兔或羊抗鼠抗体、莱克多巴胺抗体等。本发明还公开了应用上述试剂盒检测莱克多巴胺残留的方法。本发明提供的检测莱克多巴胺的试剂盒采用间接竞争时间分辨免疫分析技术，灵敏度高、稳定性好，大大简化了操作步骤和反应时间，减少了因操作复杂引起的误差，降低了成本，非常适合大量样品的筛查，具有重要的现实意义。
文档编号G01N33/577GK101995460SQ20101026899
公开日2011年3月30日 申请日期2010年8月31日 优先权日2010年8月31日
发明者孙远明, 徐振林, 李丽华, 李振峰, 杨金易, 沈玉栋, 王弘, 雷红涛 申请人:华南农业大学