专利名称：一种抗重金属锌的单克隆抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗重金属锌的单克隆抗体。
背景技术：
随着科技的进步和工业的发展，人们的生活水平有了很大的提高。但是在工业高 速发展的同时，也带来了一系列环境问题。1931-1972年发生于日本富山县神通川流域的 痛痛病和1953年发生于日本熊本县水鱼湾渔村的水俣病都是由食物受到重金属污染引发 的，这些悲剧事件引发了人们对环境中重金属污染的关注。什么是重金属呢？重金属系指密度4. 0以上约60种元素或密度在5. 0以上的45 种元素。环境污染方面所指的重金属主要是指生物毒性显著的汞、镉、铅、铬以及类金属砷， 也包括具有一定毒性的金属，如锌、铜、镍、锡等元素。重金属不能被微生物降解为无害物， 它们在水体中富集起来，造成水体污染，最终危害人类身体健康。目前最引起人们注意的是 汞、镉、铬等。砷和锡是非金属，但它们的毒性类似于重金属，一般都算作重金属。有些重金 属元素是人体和其它生物体必需的元素，但是其浓度超过一定范围就会引起中毒。许多重金属属于生命体必须的微量元素。一旦缺少某种或某几种，就会使生命体 健康受到威胁。但无论必须元素还是有毒元素，人体对它的忍受都要有一定的限度，超过这 个限度后便会对生命造成危害。随着现代工业的迅猛发展，重金属在工农业生产中的广泛应用，人们在制造⑶P 和财富的同时，人为活动引起的环境污染也在加剧。其中铅、汞、镉污染最为剧烈。它通过 被浸透的土壤和生长在其上的植物，经过食物链对动物和人体产生毒害作用。对重金属的常规性检测方法已经有很多种，有些也已经是非常成熟的技术，但因 为重金属离子存在的范围很广，根据检测精度、方便程度和检测成本，每种技术都有它们的 局限性，同时还需合适的场所，因此都不利于在生产中推广应用。建立更快速、更经济的免 疫分析法检测汞离子是生产及经济发展的需要。锌参与体内200多种酶的合成和活化，是动物生长发育及维持正常生理机能所必 须的微量元素，对动物的生长发育、生产性能、繁殖和免疫功能等方面均有着重要的影响， 但摄入过量的锌会导致机体代谢紊乱。肝脏、肾脏、胰脏、骨和心肌贮存锌的能力较强。过 量的锌是一种作用迅速的中枢神经毒素，通过对神经细胞的直接损害及对体内各种物质的 拮抗而影响脑功能。有报道鹦鹉因啃咬镀锌铁丝制成的鸟笼而普遍出现神经症状。高锌 还可明显抑制红细胞的免疫功能，造成雏鸡肝、脾的结构和功能受损(Cui HM, Zhao CY，Li DB, et al. Effect of high Zinc on immune function in chicken. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica，2005，36 (3) :240_245)。日粮锌(ZnS04)添加为 1300mg/kg 时， 会导致雏鸭患白肌病，肌胃、小肠平滑肌、骨骼肌和心肌受损(Cui HM, Peng X, Fang J, et al.Studies on pathologyof Zinc toxicity in ducklings. Acta Veterinaria etZootechnica Sinica,2004,35(2) :217_221)。总之，重金属是一种很危险的污染物。污染环境中存在的高浓度重金属，对生物的生理活动能产生多种影响，使一些生物发生病害甚至死亡，最终使生态系统平衡被破坏、生态环境恶化。重金属通过食物链可以在人体中积累，引起多种疾病甚至癌症，而且危害还可 以遗传到下一代。因此，痕量重金属的定量分析在食品和环境检测等方面都是非常重要的。 传统的重金属离子检测方法主要有原子吸收光谱法(AtomicAbsorption Spectroscopy)、 紫外分光光度法(Ultra-violet Spectroscopy)、阳极溶出伏安法(Anodic Stripping Voltammeter)、示波极谱法(Oscillopolarography)和各种仪器联用技术，如电感耦合等 离子体质谱法(Inductively Coupled Plasma-MassSpectrometry)、电感耦合等离子体原 子发身寸光谱分析(Inductively CoupledPlasma-Atomic Emission Spectrometry)、氧化物 发生-原子吸收法(HydrideGeneration-Atomic Absorption Spectrometry)等。检测仪器 昂贵，样品要经过湿法消解或微波消解，逐个测定单种重金属浓度，测量精度虽可达到mg/ kg或更高，但检测步骤繁琐，检测成本高，需耗时2天左右，难以适应环境及市场产品的现 场抽查及产品进出口快速通关的要求。
发明内容
本发明的一个目的是提供杂交瘤细胞株及其分泌的抗重金属锌的单克隆抗体。本发明所提供的杂交瘤细胞株为杂交瘤细胞株Z1A5，其保藏编号为CCTCC NO C200942。由杂交瘤细胞株Z1A5 CCTCC NO :C200942分泌得到的单克隆抗体也属于本发明的 保护范围。本发明的另一个目的是提供一种抗原。本发明所提供的抗原是按照包括如下步骤的方法制备得到1)将可溶性锌盐溶液与螯合剂溶液混合，进行络合反应，得到锌离子与螯合剂的 络合物；2)在步骤1)的基础上，再加入载体蛋白和偶联缓冲液，进行偶联反应，得到载体 蛋白与所述络合物的偶联物，即为抗原。所述步骤1)中，所述可溶性锌盐与所述螯合剂的投料比满足如下条件所述可溶 性锌盐中的Zn2+与所述螯合剂的投料的物质的量比为1 1;所述步骤2)中，所述螯合剂与所述载体蛋白的投料比满足如下条件所述螯合剂 与所述载体蛋白中的赖氨酸的投料的物质的量的比为5 1。所述步骤1)中，所述络合反应在PH值为7. 4的条件下进行；所述步骤2)中，所述偶联反应在pH值为9. O的条件下进行。所述步骤1)中，所述络合反应的温度为25°C，所述络合反应的时间为10分钟；所述步骤2)中，所述偶联反应的温度为25°C，所述偶联反应的时间为12小时。所述步骤1)中，所述螯合剂的分子式为C22H28N4OltlS · 3HC1 ；所述步骤1)中，所述可溶性锌盐溶液按照包括如下步骤的方法制备得到将锌粉 溶于浓度为68% (体积百分含量)的HNO3水溶液中，且使锌粉完全反应，得到所述可溶性 锌盐溶液；所述步骤1)中，所述螯合剂溶液按照包括如下步骤的方法制备得到将所述螯合 剂加入到PH值为9. 73、浓度为1. 4165g/50mL的HEPES缓冲液中，得到所述螯合剂溶液；
所述步骤2)中，所述载体蛋白为牛血清白蛋白或匙孔血蓝蛋白；所述步骤2)中，所述偶联缓冲液为pH9. 73、浓度为1. 4165g/50mL的HEPES缓冲 液。本发明的另一个目的是提供一种不完全包被原。本发明所提供的不完全包被原，按照包括如下步骤的方法制备得到将螯合剂、载体蛋白和反应缓冲液混合，在PH至9. 0、25°C的条件下反应12小时，得到不完全包被原。上述不完全包被原中，所述反应缓冲液为pH值为9. 73的HEPES缓冲液；上述不完全包被原中，所述载体蛋白为牛血清白蛋白；上述不完全包被原中，所述螯合剂的分子式为C22H28N4OltlS · 3HC1 ；上述不完全包被原中，所述螯合剂与所述载体蛋白中的赖氨酸的投料的物质的量 的比为5 1。上述单克隆抗体在检测样品中是否含有锌中的应用也属于本发明的保护范围。上述单克隆抗体在检测样品中锌的含量中的应用也属于本发明的保护范围。本发明的抗重金属锌的单克隆抗体的效价高。利用本发明的抗体可以用于锌离子 残留的免疫学检测。并利用其快速、廉价、灵敏和特异性强的优点，发展便于现场检测的便 携方法，从而适用于农畜产品的抽样检测及进出口通关的快速检验。对提高风险评估工作 的效率和质量，保障食品安全有重要现实意义。
图1为Zn螯合剂包被抗原的紫外扫描图谱；图2为Zn螯合剂免疫抗原的紫外扫描图谱；图3为细胞株Z1A5分泌抗体与p-SCN-Bn-DTPA结合系数测定结果；图4为杂交瘤细胞株Z1A5分泌抗体的亚型；图5为单克隆抗体效价的检测；图6为细胞株Z1A5分泌抗体特异性鉴定；图7为Z1A5分泌抗体的稳定性；图 8 为 Zn-DTPA-BSA，DTPA-BSA 及载体蛋白 BSA 的 SDS-PAGE 电泳图；图 9 为 Zn-DTPA-KLH，载体蛋白 KLH 的 SDS-PAGE 电泳具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、抗原和不完全包被原的制备一、制备p-SCN-Bn-DTPA 购自美国 Macrocyclics，货号为 B-305。产品名p-SCN-Bn-DTPA。英文名2~(4-isothiocyanatobenzyl)-diethylenetriaminepentaaceticacid别名:S-2-(4-Isothiocyanatobenzyl)-Diethylenetriamine Pentaacetic Acid分子式=C22H28N4OltlS· 3HC1。
pH值为9. 73的HEPES缓冲液1. 4165g HEPES，去离子水溶解，用10mol/L的K0H 水溶液调PH至9. 73，去离子水定容至50mL，过滤除菌，4°C保存。浓度为1. 4165g/50mL。pH值为7. 4的HEPES缓冲液14. 165g HEPES，去离子水溶解，用10mol/L的K0H水 溶液调pH至7. 4，去离子水定容至500mL。浓度为1. 4165g/50mL。A液30mg锌粉溶于200uL 68% (体积百分含量)的浓HN03水溶液中，得到浓度 为 150mg/mL 的 Zn(N03)2 溶液。B 液10. 668mg p-SCN-Bn-DTPA，加入 0. 4mL pH9. 73 的 HEPES 缓冲液，终浓度为 26.67mg/mL。C液20mg BSA溶于0. 4mL pH7. 4的HEPES缓冲液，得到浓度为50mg/mL的溶液。B1 液称取 10mg p-SCN-Bn-DTPA 溶于 0. 6mL pH9. 73 的 HEPES 缓冲液，得到浓度 为16. 67mg/mL的溶液。C1液浓度为5. 9mg/mL的匙孔血蓝蛋白(KLH)溶液；共1. 695mL。C1 液购自 Sigma，货号H8283。中文名匙孔血蓝蛋白(KLH)。产品英文名:Hemocyanin from Megathura crenulata(keyhole limpet)。1、Zn-DTPA-BSA 和 Zn-DTPA-KLH 的制备Zn-DTPA-BSA的制备(1)取0. 4mL的B液加入反应器，再加入7 u LA液，在pH为 7. 4、室温(25 °C)下反应10分钟，得到Zn-DTPA母液；(2)再向其中加入1.2mL pH9. 73 的HEPES缓冲液、C液0. 4mL,调节pH至9. 0，室温(25 V )下搅拌，反应12小时，得到 Zn-DTPA-BSA。步骤(1)中，Zn(N03)2中的Zn2+与p-SCN-Bn-DTPA的投料的物质的量比为 1:1。步骤(2)中，p-SCN-Bn-DTPA与BSA中的赖氨酸的投料的物质的量的比为5 1。Zn-DTPA-KLH (1)取0. 133mL的B1液加入反应器，再加入A液7. 5 y L，在pH为 7. 4、室温(25°C )下反应10分钟，得到Zn-DTPA母液；(2)再向其中加入0. 14mL pH9. 73 的HEPES缓冲液、C1液1. 695mL,调节pH至9. 0，室温(25°C )下搅拌，反应12小时。步骤 ⑴中，Zn(N03)2中的Zn2+与p-SCN-Bn-DTPA的投料的物质的量比为1 1。步骤(2)中， p-SCN-Bn-DTPA与KLH中的赖氨酸的投料的物质的量的比为5 1。CentriconYM-30超滤离心管预先用0. lmol/L二乙烯三胺五乙酸(DTPA)溶液浸泡 过夜，然后用PH9. 73的HEPES缓冲液充分冲洗。偶联反应后，用CentriconYM-30超滤离心 管对蛋白质复合物进行分离纯化，即用CentriconYM-30过滤除去没有参与反应的过量的 金属离子Zn2+和螯合剂DTPA及Zn-DTPA，分离纯化时先用pH9. 73的HEPES缓冲液洗涤超 滤管一次，再用PH7. 4的HEPES缓冲液洗涤两次。2、DTPA_BSA 的制备DTPA-BSA的制备取0. 4mL的B液加入反应器，再向其中加入1. 2mL pH9. 73的 HEPES缓冲液、C液0. 4mL,再加pH9. 73的HEPES缓冲液将调节pH至9. 0，室温(25°C )下 搅拌，反应12小时，得到DTPA-BSA。反应中p-SCN-Bn-DTPA与BSA中的赖氨酸的投料的物 质的量的比为5 1。分离纯化步骤同步骤1。纯化后所得的抗原分装于-20°C保存，长期保存存于-80°C。二、抗原的鉴定
1、抗原的浓度测定参照BCA试剂盒步骤，用BCA法构建浓度检测标准曲线。蛋白浓度测定标准曲线 的绘制在聚苯乙烯微孔板上，分别将2mg/mL的BSA标准蛋白稀释至浓度为1000 y g/mL、 500 u g/mL、250 u g/mL、125 u g/mL、25 u g/mL,0u g/mL。用 BCA 蛋白定量试剂盒测定 570nm 的光吸收值。以吸收值减去空白值得到的数值对BSA含量作图，绘出标准曲线。KLH的标准 曲线绘制原理同BSA。抗原浓度的测定将分离纯化后的抗原样品适当稀释，用BCA蛋白定 量试剂盒测定570nm的光吸收值，通过标准曲线计算样品溶液中抗原浓度。结果表明，利用BCA法检测分离纯化后的的Zn-DTPA-BSA、Zn-DTPA-KLH、DTPA-BSA 中蛋白的实际浓度依次为 25. 155 士 0. 038mg/mL，4. 195 士 0. 014mg/mL，9. 242 士 0. 015mg/ mL(见表1)。表1. BCA法检测抗原中蛋白浓度
权利要求
杂交瘤细胞株Z1A5，其保藏编号为CCTCC NOC200942。
2.由杂交瘤细胞株Z1A5CCTCC NO :C200942分泌得到的单克隆抗体。
3.—种抗原，按照包括如下步骤的方法制备得到1)将可溶性锌盐溶液与螯合剂溶液混合，进行络合反应，得到锌离子与螯合剂的络合物；2)在步骤1)的基础上，再加入载体蛋白和偶联缓冲液，进行偶联反应，得到载体蛋白 与所述络合物的偶联物，即为抗原。
4.根据权利要求3所述的抗原，其特征在于所述步骤1)中，所述可溶性锌盐与所述螯合剂的投料比满足如下条件所述可溶性锌 盐中的Zn2+与所述螯合剂的投料的物质的量比为1 1;所述步骤2)中，所述螯合剂与所述载体蛋白的投料比满足如下条件所述螯合剂与所 述载体蛋白中的赖氨酸的投料的物质的量的比为5 1。
5.根据权利要求3或4所述的抗原，其特征在于所述步骤1)中，所述络合反应在PH值为7. 4的条件下进行； 所述步骤2)中，所述偶联反应在pH值为9. 0的条件下进行。
6.根据权利要求3-5中任一所述的抗原，其特征在于所述步骤1)中，所述络合反应的温度为25°C，所述络合反应的时间为10分钟； 所述步骤2)中，所述偶联反应的温度为25°C，所述偶联反应的时间为12小时。
7.根据权利要求3-6中任一所述的抗原，其特征在于所述步骤1)中，所述螯合剂的分子式为C22H28N401(iS 3HC1 ；所述步骤1)中，所述可溶性锌盐溶液按照包括如下步骤的方法制备得到将锌粉溶于 浓度为68% (体积百分含量)的HN03水溶液中，且使锌粉完全反应，得到所述可溶性锌盐 溶液；所述步骤1)中，所述螯合剂溶液按照包括如下步骤的方法制备得到将所述螯合剂加 入到PH值为9. 73、浓度为1. 4165g/50mL的HEPES缓冲液中，得到所述螯合剂溶液； 所述步骤2)中，所述载体蛋白为牛血清白蛋白或匙孔血蓝蛋白； 所述步骤2)中，所述偶联缓冲液为pH9. 73、浓度为1. 4165g/50mL的HEPES缓冲液。
8.一种不完全包被原，按照包括如下步骤的方法制备得到将螯合剂、载体蛋白和反 应缓冲液混合，在pH至9.0、25°C的条件下反应12小时，得到不完全包被原。
9.根据权利要求8所述的不完全包被原，其特征在于所述反应缓冲液为pH9.73、浓度 为 1. 4165g/50mL 的 HEPES 缓冲液；和/或，所述载体蛋白为牛血清白蛋白； 和/或，所述螯合剂的分子式为C22H28N401QS 3HC1 ；和/或，所述螯合剂与所述载体蛋白中的赖氨酸的投料的物质的量的比为5 1。
10.权利要求2所述单克隆抗体在检测样品中是否含有锌中的应用；权利要求2所述 单克隆抗体在检测样品中锌的含量中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种抗重金属锌的单克隆抗体。该单克隆抗体是由杂交瘤细胞株Z1A5 CCTCC NOC200942分泌得到的。本发明的抗重金属锌的单克隆抗体的效价高。利用本发明的抗体可以用于锌离子残留的免疫学检测。并利用其快速、廉价、灵敏和特异性强的优点，发展便于现场检测的便携方法，从而适用于农畜产品的抽样检测及进出口通关的快速检验。对提高风险评估工作的效率和质量，保障食品安全有重要现实意义。
文档编号G01N33/577GK101979511SQ201010533200
公开日2011年2月23日 申请日期2010年11月5日 优先权日2010年11月5日
发明者刘丹, 李霞, 杨慧, 赵丽 申请人:北京市农林科学院