专利名称：辣根过氧化酶修饰电极测定酚类化合物的方法
技术领域：
本发明涉及一种氧化铝纳米粒子/壳聚糖/辣根过氧化酶复合膜修饰玻碳电极测 定酚类化合物的方法，属电化学分析检测技术领域。
背景技术：
酚类化合物是芳香烃苯环上连着羟基的一大类化合物，通式为ArOH。常见的酚有 苯酚、邻苯二酚、对苯二酚等。酚类化合物可以制备树脂、染料、医药品、杀菌剂、炸药等系列 化工产品。但是酚类化 合物对环境及人类的健康危害较大，因此，酚类化合物被美国国家 环保局列入“129种优先控制污染物黑名单”。近年来，许多测酚的方法被发展，如紫外分光 光度法、气相色谱法、液相色谱法和毛细管电泳法等。但是这些方法所需仪器都比较昂贵， 操作比较耗时和复杂，不适合现场检测，而生物传感器测定分类化合物具有操作简单、分析 速度快、检测限低等特点，因此研制测酚生物传感器对于保护环境和人类身体健康具有重 要意义。在测酚生物传感器中，酪氨酸酶是一种常用的酶，但是酪氨酸酶生物传感器只能 用来检测至少有一个空邻位的酚类化合物。同样，基于漆酶的生物传感器只适合用来测定 有空对位或间位的酚类化合物。与之相比，辣根过氧化酶生物传感器对于大量的酚类化合 物都很灵敏。同时，在测酚的过程中，基于辣根过氧化酶构建的生物传感器的机理是不同于 酪氨酸酶和漆酶生物传感器的。当酶分子被氧气氧化后，酪氨酸酶和漆酶是通过酚类化合 物被还原，而辣根过氧化酶是通过过氧化氢还原。壳聚糖又称聚氨基葡萄糖、可溶性甲壳素，是甲壳素经化学处理脱乙酰基后的产 物，是一种天然的阳离子聚合物，无毒无害。壳聚糖具有一些罕见的物理化学性质，如高的 机械强度和亲水性、好的成膜性和生物相容性。因此，壳聚糖被广泛的用作酶固定的基质。酶的固定对生物传感器的性能起着非常重要的作用。到目前为止，辣根过氧化酶 已经被固定在表面活性剂，聚合物和无机材料等各种基质上。在这些基质中，无机材料由于 他们的规则结构，好的机械、化学和热稳定性等特性受到广大研究者的热切关注。其中，纳 米氧化铝一直也是人们研究的热点。在本发明中，用氧化铝纳米粒子固定辣根过氧化酶，对 所制备的辣根过氧化酶生物传感器的性能以及在酚类化合物测定中的应用进行了详细的 研究。
发明内容
本发明的目的是利用氧化铝纳米粒子/壳聚糖/辣根过氧化酶复合膜修饰的玻碳 电极构建相当于一种电流型生物传感器，用来测定酚类化合物的浓度。本发明一种辣根过氧化酶修饰电极测定酚类化合物的方法，其特征在于具有以下 的过程和步骤
a.玻碳电极的预刘理首先将玻碳电极用0. 05mm Al2O3抛光粉和麂皮进行抛光，抛至 光镜面，然后依次用蒸馏水、稀硝酸溶液、无水乙醇及二次蒸馏水超声清洗干净，待用；b.氧化铝纳米粒子/壳聚糖/辣根过氧化酶复合修饰的玻碳电极的制备首先称取 适量的壳聚糖溶解在0. IM醋酸溶液中，并在室温下超声2h，得到0. 2 0. 6% (ff/V,mg/ml) 的壳聚糖溶液；然后将适量的氧化铝纳米粒子分散在Iml的上述0. 2 0. 6% (ff/V,mg/ml) 壳聚糖溶液，并超声至均勻；另外，用二次蒸馏水配制6 10mg/ml辣根过氧化酶溶液，将该 辣根过氧化酶溶液与上述分散有氧化铝纳米粒子的壳聚糖溶液的体积比1 :1混合，得到氧 化铝纳米粒子/壳聚糖/辣根过程化酶混合溶液；然后取4 8ml的该混合溶液滴涂于上 述准备好的玻碳电极表面，并在4°C的冰箱中晾干，放置一夜后待用；
c.对酚类化合物的电化学测定利用上述的氧化铝纳米粒子/壳聚糖/辣根过氧化 酶复合膜修饰的玻碳电极当作电流型生物传感器，对酚类化合物进行电化学测定，其测定 方法如下利用电化学工作站采用二电极系统进行测试，即将氧化铝纳米粒子/壳聚糖/ 辣根过氧化酶复合膜修饰的玻碳电极作为工作电极，饱和甘汞电极作为参比电极，钼片电 极作为辅助电极；将该三电极系统置于PH6. O的0. IM磷酸盐缓冲溶液中，在-1. OV至1. OV 循环伏安扫描数圈以活化电极；然后同0. IM酸盐缓冲溶液中加入适量的过氧化氢；选择电 流-时间曲线法，设定一定的应用电位，启动程序，当背晾电流达到稳定后，用微量进样器 向上述溶液中加入对苯二酚样品，记录相应的电流信号；在浓度0. 005mM 70mM范围内，得 到电流与对苯二酚浓度的线性关系，其线性方程为I (mA)=0. 533C(mM)+0. 05，线性相关系 数r=0. 999，利用该线性关系曲线及相应的线性方程，可测定对苯二酚溶液试样的浓度。 本发明的有关机理或原理本发明中的修饰电极相当于一种新型的酶生物传感 器。本发明中固定在玻碳电极表面的辣根过氧化酶作为生物传感器的敏感元件基元，通过 各种物理、化学信号换能器捕捉目标物与敏感元件基元之间的反应所产生的与目标物成比 例关系的可测信号，实现对目标物进行定量测定。在本发明中，固定在玻碳电极表面的辣根 过氧化酶作为传感器元件基元，而电极作为信号转换器，从而实现对酚类化合物的定量测 定。因此，本发明中，氧化铝纳米粒子/壳聚糖/辣根过氧化酶复合膜修饰的玻碳电极相当 于一种酶生物传感器。在本发明中，首先在辣根过氧化酶(还原态)作用下，过氧化氢被还原成水，同时辣 根过氧化酶被氧化；氧化态的辣根过氧化酶与酚类化合物作用后对王成辣根过氧化酶(还 原态)和醌类物质或自由基；这些醌类物质或自由基在电极表面发生还原反应，其还原电流 与酚类化合物浓度成正比，从而可以定量测定酚类化合物。本发明的优点和特点如下所述本发明利用氧化铝纳米粒子大的比表面积等特性 以及壳聚糖的生物相容性的特点使得辣根过氧化酶不仅很好的固定的玻碳电极表面，同时 保持了良好的生物活性。同时，氧化铝纳米粒子的引入增强了反应的催化活性。又由于在 溶液中加入了适量的过氧化氢极大的增加了反应的响应电流。本发明中的修饰电极相当于一种新型的酶生物传感器，用于对酚类化合物和实际 样品的测定，具有快速、灵敏、准确等特点。本发明的酶生物传感器具有良好的稳定性和重 现性，且制备简单、快速。
图1为本发明中相同浓度的对苯二酚溶液(20mM)在壳聚糖/辣根过氧化酶修饰 电极(a)和氧化铝纳米粒子/壳聚糖/辣根过氧化修饰电极(b)上的循环伏安图；图2为本发明中加入的标准对苯二酚浓度与峰电流的线性关系曲线图。
具体实施例方式现将本发明的具体实施例叙述于后。实施例1 本实施例中包括修饰电极(生物传感器)的制备及对苯二酚的测定，其具 体过程如下
(1)玻碳电极的预处理首先将玻碳电极用0.05mm Al2O3抛光粉和麂皮进行抛光，抛 光至镜面，然后依次用蒸馏水、稀硝酸溶液、无水乙醇及二次蒸馏水超声清洗干净，待用；
(2)—种氧化铝纳米粒子/壳聚糖/辣根过氧化酶复合膜修饰电极(生物传感器)的制 备首先称取适量的壳聚糖溶解在0. 1 M醋酸溶液中并在室温下超声2 h得到0. 2% -0. 6% (w/v，mg/ml)的壳聚糖溶液，将适量的氧化铝纳米粒子分散在1 mL的0. 2% -0.6% (w/v, mg/ml)壳聚糖溶液并超声至均勻。用二次蒸馏水配制6-10 mg/mL辣根过氧化酶溶液，将 此辣根过氧化酶溶液与上述的氧化铝溶液以体积比1 1混合得到氧化铝纳米粒子/壳聚糖 /辣根过氧化酶混合溶液。取4-8 uL此混合液滴涂于步骤a所得的玻碳电极表面，并在4 0C的冰箱中晾干，放置一夜后待用；最终制得氧化铝纳米粒子/壳聚糖/辣根过氧化酶复合 膜修饰玻碳电极。(3)修饰玻碳电极对苯二酚的测定，其测定方法如下
利用电化学工作站采用三电极系统进行测定，即将氧化铝纳米粒子/壳聚糖/辣根 过氧化酶复合膜修饰的玻碳电极作为工作电极，饱和甘汞电极和钼片电极分别作为参比电 极、辅助电极；将该三电极系统置于PH 6.0的0.1 M磷酸盐缓冲溶液中电位从-1.0 V至 1.0 V循环伏安扫描数圈以活化电极；然后向0.1 M磷酸盐缓冲溶液中加入适量的过氧化 氢。选择电流_时间曲线法，设定一定的应用电位，启动程序，当背景电流达到稳定后，用微 量进样器向上述溶液中加入对苯二酚样品，记录相应的电流信号；在浓度0.005 mM -70 mM 范围内，得到电流与对苯二酚浓度的线性关系，其线性方程为/ (mA) = 0.533 C (mM) + 0.05，其线性相关系数r = 0.999，利用该线性关系曲线及相应的线性方程，可用它测定对 苯二酚溶液试样的浓度。本实施例中的测定试验结果列于图1和图2中。参见图1，图1为本实施例中相同浓度的对苯二酚溶液(20mM)在壳聚糖/辣根过 氧化酶修饰电极(a)和氧化铝纳米粒子/壳聚糖/辣根过氧化酶修饰电极的循环伏安曲线 图。从图中可看出，后者(即b)具有较高伏安性能显示，也即是有较好的电极信号显示。参见图2，图2为本实施例中加入的标准对苯二酚浓度与峰电流的线性关系曲线 图。并由此获得线性方程:/ (mA) = 0.533 C (mM) + 0. 05 ；其线性相关系数r=0. 999。
权利要求
1. 一种辣根过氧化酶修饰电极测定酚类化合物的方法，其特征在于具有以下的过程和 步骤a.玻碳电极的预处理首先将玻碳电极用0.05mmAl2O3抛光粉和麂皮进行抛光，抛至 光镜面，然后依次用蒸馏水、稀硝酸溶液、无水乙醇及二次蒸馏水超声清洗干净，待用；b.氧化铝纳米粒子/壳聚糖/辣根过氧化酶复合修饰的玻碳电极的制备首先称取适 量的壳聚糖溶解在0. IM醋酸溶液中，并在室温下超声2h，得到0. 2 0. 6% (W/V，mg/ml) 的壳聚糖溶液；然后将适量的氧化铝纳米粒子分散在Iml的上述0. 2 0. 6% (ff/V,mg/ml) 壳聚糖溶液，并超声至均勻；另外，用二次蒸馏水配制6 10mg/ml辣根过氧化酶溶液，将该 辣根过氧化酶溶液与上述分散有氧化铝纳米粒子的壳聚糖溶液的体积比1 :1混合，得到氧 化铝纳米粒子/壳聚糖/辣根过程化酶混合溶液；然后取4 8ml的该混合溶液滴涂于上 述准备好的玻碳电极表面，并在4°C的冰箱中晾干，放置一夜后待用；c.对酚类化合物的电化学测定利用上述的氧化铝纳米粒子/壳聚糖/辣根过氧化酶 复合膜修饰的玻碳电极当作电流型生物传感器，对酚类化合物进行电化学测定，其测定方 法如下利用电化学工作站采用二电极系统进行测试，即将氧化铝纳米粒子/壳聚糖/辣 根过氧化酶复合膜修饰的玻碳电极作为工作电极，饱和甘汞电极作为参比电极，钼片电极 作为辅助电极；将该三电极系统置于PH6. O的0. IM磷酸盐缓冲溶液中，在-1.0V至1.0V 循环伏安扫描数圈以活化电极；然后同0. IM酸盐缓冲溶液中加入适量的过氧化氢；选择电 流-时间曲线法，设定一定的应用电位，启动程序，当背晾电流达到稳定后，用微量进样器 向上述溶液中加入对苯二酚样品，记录相应的电流信号；在浓度0. 005mM 70mM范围内，得 到电流与对苯二酚浓度的线性关系，其线性方程为I (mA)=0. 533C(mM)+0. 05，线性相关系 数r=0. 999，利用该线性关系曲线及相应的线性方程，可测定对苯二酚溶液试样的浓度。
全文摘要
本发明涉及一种氧化铝纳米粒子/壳聚糖/辣根过氧化酶复合膜修饰玻碳电极测定酚类化合物的方法，属电化学分析检测技术领域。本发明的要点是将一定量的氧化铝纳米粒子/壳聚糖/辣根过氧化酶混合液滴涂在玻碳电极表面，得到修饰的玻碳电极，它相当于一种电流型生物传感器；并利用该氧化铝纳米粒子/壳聚糖/辣根过氧化酶复合膜修饰的玻碳电极对酚类化合物进行电化学的定量测定。本发明测定方法具有快速、灵敏、准确、稳定等特点。
文档编号G01N27/48GK102128865SQ20101056145
公开日2011年7月20日 申请日期2010年11月28日 优先权日2010年11月28日
发明者丁亚平, 刘小娟, 李丽, 王玉龙, 罗立强 申请人:上海大学