专利名称：能靶向治疗乳癌的人造油体载体及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程和医学生物学领域，涉及使用大肠杆菌表达oleZH2蛋白的 方法，人造油体载体的制备方法以及该载体在专一性侦测及标靶治疗乳癌中的应用。
背景技术：
癌症，亦称为恶性肿瘤，根据目前了解，其病因是由于癌细胞异常分裂且在体内各 处进行转移，导致生理功能异常且难以治愈，近年来成为全球人类死因之首。从2003年起， 乳癌已成为台湾女性中最常见的癌症，世界上50%的乳癌病患已诊断出HER2/neU阳性。这 些病患缺乏临床症状，且难以在早期发现。因此，迫切需求乳癌早期诊断工具。传统上治疗方法主要是利用外科手术方式将肿瘤切除，或是以化学药物或放射线 手段来杀死癌细胞。但是外科手术方式难以根除癌细胞而且不易实施，一般化学药物和放 射线治疗不具有专一性，在治疗过程中，往往会杀死维持一般生理功能所必须的正常细胞， 从而产生许多副作用，例如免疫功能下降(白血球数量下降)、恶心、呕吐、掉发、肠胃吸收功 能衰退及贫血等现象。经研究发现，癌细胞通常会带有某些特殊分子生物标记，近年来针对癌症治疗发 展出标靶治疗(targeting therapy)的方法。所谓标靶治疗，是设计一种可以专一性辨识癌 细胞表面分子生物标记的药物，可以有效阻断癌细胞活化或抑制其生长，从而达到治疗的 目的。标靶治疗药物可以直接精准地命中目标癌细胞，对于体内正常细胞的影响较小。因 此相对于传统治疗方法，标靶治疗具有低毒性、低副作用、高效率和实行方便等优点。标靶治疗有多种方式，如利用一载体包覆、连结或镶嵌一具有治疗活性的药 物分子，运用各种机制将该载体与药物分子专一性地递送到目标癌细胞，此种模式一般称 为药物传递系统(drug delivery system)。该载体具有标靶功能，该物质可以为蛋白质(例 如抗体)、类固醇、糖类或其它化合物等。目前已知载体有高分子聚合颗粒、微胞(micell)、微酯粒(liposome)及病 毒性载体等，这些载体各具不同缺点，例如粒径过大而不易被人体吸收、具有毒性、在血液 或体液中不稳定等，在实际运用上多有局限。此外，当此类型载体结合上述可辨识癌细胞的 物质时，通常需要复杂且耗时的化学合成步骤，不仅提高了制造成本，且会造成环境污染。 所以，迫切需求具有微小粒径、无毒性、稳定及易于结合辨识癌细胞的载体。针对上述需求，本发明利用分子生物技术，可提供一种人造油体载体，其制 备过程简便且对环境污染很低。经由活体外(in vitro)和活体内(in vivo)实验证明本发 明的油体载体可有效地运用于标靶治疗或侦测，且具优异的生物兼容性。
发明内容
本发明的目的是提供一种融合蛋白，其包含一油体蛋白、一配体性肽或一抗体性 肽、一细胞穿透性肽或前述组合。本发明的另一个目的是提供一种人造油体载体，其包含上述融合蛋白和一脂质，融合蛋白与脂质重量/体积比值(微克/微升)至少约1/25，该油体平均粒径为50纳米 至2000纳米。本发明的另一个目的是提供上述融合蛋白和人造油体载体的制备方法。本发明还有一个目的是提供一种可以靶向治疗乳癌的药物传递系统，其包含上述 人造油体载体及一药物、一讯号分子、或前述组合，能在活体外(in vitro)及活体内(in vivo)对乳癌进行专一性侦测及标靶治疗。
本发明所述的一种能靶向治疗乳癌的人造油体载体的制备方法包括以下步骤
(1)融合蛋白的表达。重组菌种BL21(DE3)/pJ01-oleZH2在37°C下培养，细菌初 始密度OD55tl值为0.08。接种到新鲜含有氨苄青霉素的LB培养液，当细菌密度OD55tl值为 0. 3时，37°C诱导4小时，收集菌体，以4000 rpm、4°C冷冻离心10 min，再用0. 1 M pH7. 5 sodium phosphate buffer 清洗一次，收集菌体，以 0. IM pH7. 5 sodium phosphate buffer 浓缩成细菌密度OD55tl值为10的菌液。将细菌密度OD55tl值为10的菌液用超声波细胞粉碎机进行冰上超声破碎(功 率3. 5%，时间2分钟，run 0. 5秒，rest :0. 5秒)。超声结束后，以13000 rpm、4°C冷冻 离心10 min，收集离心后上清液和沉淀不水溶蛋白。(2)人造油体载体的制备。取IOOPg oleZH2蛋白，加入950μ1 0. OlM pH7. 5 sodium phosphate buffer，再加入50μ1芝麻油，用超声波细胞粉碎机进行冰上超声混合 (功率3. 0%, time :20 秒，run :0. 5 秒，rest :0. 5 秒)，以 13000 rpm、4°C冷冻离心 10 min, 取出上面一层白色的油饼，加入0. OlM pH7. 5 sodium phosphate buffer 1 ml，用超声波细 胞粉碎机打散，相同步骤进行三次，构建出人造油体载体。本发明所述的人造油体载体经过了各种性能测试，具有容积小、在血球或血清中 稳定性佳、低毒性、低副作用、高效、操作方便等优点。本发明所述的人造油体载体在活体外(in vitro)和活体内(in vivo)实验中都具 有靶向性，能专一性识别靶细胞，当包覆药物后，能抑制肿瘤生长。在体内抗肿瘤活性测试中，取约8-10周的裸鼠，用细胞株(SK0V3和MDA-MB-231) 进行皮下组织注射，使裸鼠皮下组织的肿瘤大小约0. 5厘米以上，每星期两次注射IOOmg/ ml包覆喜树碱的油体载体在肿瘤上，结果显示，随时间的增加，包覆喜树碱的油体载体能抑 制肿瘤生长，而且裸鼠体重没有减少。这说明本研究成功构建一种能靶向治疗乳癌的人造 油体载体。除非文中另有说明，于本说明书中所使用之“一”或“该”及类似用语应理解为包 含单数及复数形式。植物种子的油体具有相当大的表面积，可用于包覆或镶嵌大量的讯号分子， 以做为生物体内移动的实时(real time)讯号放大器来追踪并确认病灶，也可用于包覆脂 溶性药物，作为专一性药物传递系统来治疗疾病。本发明利用油体的上述特性，结合分子生 物技术，由简易制备方法来提供一种人造油体载体(下文简称为油体载体)。本发明的油体载体包含一融合蛋白及一脂质，其中，该融合蛋白包含一油体 蛋白、一配体性肽或一抗体性肽、一细胞穿透性肽或前述组合。本发明油体载体融合蛋白所含的油体蛋白并无任何限制。来自植物种子的油体蛋白较佳，例如芝麻油、橄榄油、大豆油、花生油和矿物油其组合，其中芝麻种子的油体蛋白更佳。本发明油体载体融合蛋白所含的配体性肽或抗体性肽，使油体载体成为专一性传 递载体(即标靶载体)。配体性肽或抗体性肽可精准地辨识癌细胞表面受体(rec印tor)，通 过配体性肽或抗体性肽与受体结合，可将包覆有抗癌药物的油体载体直接投递至癌变部位 或作用于癌细胞，提高区域性的药物浓度，不影响正常细胞。此外，利用上述机制，也可刺激 癌细胞通过吞式作用(phagocytosis)与融合作用(fusion)吸收油体载体，使抗癌药物进 入癌细胞，从而达到治疗及避免产生抗药性的目的。本发明融合蛋白所包含配体胜肽或抗体胜肽并无任何限制，只要具有专一性 识别细胞的功能即可。就配体性肽而言，当治疗乳癌或卵巢癌时，可采用HER2/neU蛋白 质受体的配体性肽。已知HER2/neu蛋白质受体系属于表皮细胞生长因子受体(印idermal growth factor receptor, EGFR)，其存在于多种癌细胞表面，在致癌机制中扮演重要角色， Nord等人已经研发出一种可专一性地与HER2/neu蛋白质受体结合的Sfer2性肽，以作 为该受体的配体。ZHer2性肽有58个氨基酸，其分子量(约为7至15千道尔顿)远小于单 株抗体分子量(150千道尔顿)，易于穿透细胞膜，使油体载体进入乳癌细胞，进行靶向性检 测及治疗。本发明具有以下优点
本发明利用pJ01-oleZH2质粒转化进入大肠杆菌BL21 (DE3)宿主细胞后，经过诱 导，进行ole ZH2蛋白的生产，再将油和ole ZH2蛋白混合，构建出人造油体载体。经由活 体外(in vitro)和活体内(in vivo)实验确认本发明的油体载体可有效地运用于标靶治疗 或侦测，且具优异的生物兼容性。本发明的制备过程简便且对环境造成的污染很低。油体 载体在血球或血清中稳定性佳，便宜、低毒性、低副作用、高效率、操作方便、容积小，容易运 输、能包覆各种不同油溶性抗癌药物，包覆药物后可有效杀死癌细胞，并可以对癌细胞进行 专一性侦测及治疗。
图1是融合蛋白在大肠杆菌表达和油体载体制备后的电泳图。在图1中，marker 蛋白标准116kDa，66. 2kDa, 45kDa, 35kDa, 25kDa, 18. 4kDa, 14. 4kDa 分别代表不同分子量 大小标准蛋白；oleosin 油体蛋白；oleoSin-ZH2 融合蛋白；AOB 油体载体；-IPTG 诱导 前；+IPTG诱导后；sup-1 大肠杆菌表达融合蛋白，超声破碎，离心后的上清液；ppt-Ι 大 肠杆菌表达融合蛋白，超声破碎，离心后的沉淀不水溶蛋白；sup-2 油与融合蛋白，超声混 合，离心后的上清液；ppt-2 油与融合蛋白，超声混合，离心后的沉淀不水溶蛋白。图2是油体载体包覆荧光物质yellow GGK和Nile red的显微镜观察。在图2中， 左列图为明视野观察图。右列图为荧光视野观察图。图3是油体载体的AFM测试。图4是油体载体在不同制备条件下的显微镜观察。图5是油体载体在不同制备条件下的稳定度测试。图6是油体载体的融血实验(上图)；不同温度下油体载体随时间增加的粒径变 化测试(下图)。
图7是油体载体作用于固定肿瘤细胞(Fixed cell)的专一性测试。图8是油体载体作用于肿瘤活细胞(Living cell)的专一性测试。图9是不同浓度的油体载体作用于I0V3细胞株的专一性测试。图10是油体载体作用于SK0V3细胞株不同时间的专一性测试。图11是不同浓度的油体载体作用于不同肿瘤活细胞株的专一性FLOW测试。图12是油体载体作用于不同肿瘤活细胞株不同时间的专一性FLOW测试。图13是油体载体作用于SK0V3细胞株的共轭荧光显微镜XY轴平面观察和Z轴切 面观察。图14是包覆不同浓度喜树碱的油体载体的FIlR观察。图15是包覆不同浓度喜树碱的油体载体的稳定性浊度测试。图16是包覆不同浓度喜树碱的油体载体的细胞存活性试验。图17是肿瘤小鼠注射油体载体后随时间的IVSI观察测试。图18是肿瘤小鼠注射油体载体M小时后，脏器累积性测试和肿瘤组织冷冻切片 的荧光显微镜观察。图19是油体载体治疗肿瘤负荷鼠的肿瘤体变化和体重变化观察图。图20是油体载体治疗肿瘤负荷鼠的肿瘤生长观察图。表1是油和融合蛋白的不同比例。表2是油体载体在不同制备条件下的粒径大小测试。表3是油体载体在不同制备条件下的电负度测试。表4是包覆不同浓度喜树碱的油体载体的粒径大小和电负度测试。
具体实施例方式实施例1油体载体的制备
重组菌种BL21 (DE3)/pJ01-oleZH2在37°C下培养，细菌初始密度OD55tl值为0. 08。 接种到新鲜含有氨苄青霉素的LB培养液，当细菌密度OD55tl值为0.3时，37°C诱导4小时， 收集菌体，以 4000 rpm、4°C冷冻离心 10 min，再用 0. 1 M pH7. 5 sodium phosphate buffer 清洗一次，收集菌体，以0. IM pH7. 5 sodium phosphate buffer浓缩成细菌密度OD55tl值为 10的菌液。将细菌密度OD55tl值为10的菌液用超声波细胞粉碎机进行冰上超声破碎(功 率3. 5%，时间2分钟，run 0. 5秒，rest :0. 5秒)。超声结束后，以13000 rpm、4°C冷 冻离心10 min，收集离心后上清液和沉淀不水溶蛋白。取30μ1的上清液并加入10μ1的 2Χ Sample Buffer，利用牛血清定量得到supl。沉淀不水溶蛋白加入30μ1的0. IM ρΗ7· 5 sodium phosphate buffer,并加入 10μ1 的 2Χ Sample buffer，利用牛血清定量得到 pptl，并用SDS-PAGE分析(图1)，以Quantity One (Bio-RAD)软件进行蛋白质定量分析， 由融合蛋白量换算融合蛋白质浓度。取 IOOPg oleZH2 蛋白，加入 950μ1 0. OlM ρΗ7· 5 sodium phosphate buffer，再 加入50μ1芝麻油，用超声波细胞粉碎机进行冰上超声混合(功率3. 0%，time :20秒，run 0. 5秒，rest 0. 5秒)，以13000 rpm、4°C冷冻离心10 min，取出上面一层白色的油饼，加入 0.01M pH7. 5 sodium phosphate buffer 1 ml，用超声波细胞粉碎机打散，相同步骤进行三次，构建出油体载体。用SDS-PAGE分析观察是否为所构建出来的目标油体载体(图1)。
结果显示，将pJ01-oleZH2质粒转化进入BL21(DE!3)菌株后，会表达ole ZH2蛋白，可 以很明显看到经过诱导后，在预测位置有目标蛋白生产出。然后，经过构建油体载体的步 骤后，目标蛋白oleZH2可通过ole油体结构蛋白，固定于油体上，可以看出oleZH2位置在 33KDa。实施例2油体载体包覆荧光物质及油体AFM测试
取 oleZH2 蛋白，加入 0. OlM pH7. 5 sodium phosphate buffer，再加入含有 nile red (厂牌SIGMA，浓度0. 5Pg/ml)或是kllow GGK (厂牌怀德生技化学股份有限公司，浓度 lPg/ml)的芝麻油，用超声波细胞粉碎机进行冰上超声混合(功率3. 0%，time :20秒，run 0. 5秒，rest :0. 5秒)，以13000 rpm、4°C冷冻离心10 min，取出上面一层白色的油饼，加入 0.01M pH7.5 sodium phosphate buffer，用超声波细胞粉碎机打散，相同步骤进行三次，构 建出荧光油体载体。用0. OlM pH7. 5 sodium phosphate buffer稀释，并用荧光显微镜观 察，Yellow GGK用488 nm激发，能看到油体载体发绿色荧光，nile red用454-458 nm激 发，能看到油体载体发红色荧光(图2)。将云母片用水清洗三次，每次三分钟，再用0. 02M的MgC12泡2_3分钟，再用清 水清洗一次。把油体载体加在云母片上，静置2小时，使油体载体吸附在云母片上，然后用 ddH20清洗两次，放置于37°C烘箱中干燥，最后AFM观察油体型态和大小(图3)。利用AFM 测试得出油体载体的大小约200 500纳米。
实施例3油体载体在不同制备条件下的测试
不同比例的油和蛋白构建油体载体。将油和oleZH2蛋白分别以比例为10:1、2:1、1:1、 1:5、1:10混合，取0162!12蛋白，加入0.01]\1 pH7. 5 sodium phosphate buffer，再加入芝 麻油(表1)，用超声波细胞粉碎机进行冰上超声混合(功率3. 0%，time :20秒，run :0. 5秒， rest :0. 5秒)，以13000 rpm、4°C冷冻离心10 min，取出上面一层白色的油饼，加入0. OlM pH7. 5 sodium phosphate buffer 1 ml，用超声波细胞粉碎机打散，相同步骤进行三次，构 建油体载体。在不同pH条件下构建油体载体。将油和融合蛋白的比例固定，取oleZH2蛋白， 力口入各种 PH 的 sodium phosphate buffer (pH6. 5、pH7. 0、pH7. 5、pH8. 0、pH9. 0)，再力口 入芝麻油，用超声波细胞粉碎机进行冰上超声混合(功率3. 0%，time 20秒，run :0. 5秒， rest :0. 5秒)，以13000 rpm、4°C冷冻离心10 min，取出上面一层白色的油饼，加入各种pH 的0.01M sodium phosphate buffer 1 ml，用超声波细胞粉碎机打散，相同步骤进行三次， 构建油体载体。用不同种类的油构建油体载体。将油和融合蛋白的比例固定，取oleZH2蛋白质， 加入0. OlM pH7. 5 sodium phosphate buffer，再加入不同油(芝麻油、矿物油、花生油、橄 榄油和大豆油)，用超声波细胞粉碎机进行冰上超声混合(功率3. 0%，time 20秒，run :0. 5 秒，rest :0. 5秒)，以13000 rpm、4°C冷冻离心10 min，取出上面一层白色的油饼，加入0. OlM sodium phosphate buffer 1 ml，用超声波细胞粉碎机打散，相同步骤进行三次，构建油体 载体。构建上述不同条件的油体载体，用sodium phosphate buffer稀释，再用荧光显微 镜观察(图4)。
油体载体的粒径大小测试。不同条件的油体载体用sodium phosphate buffer稀 释，适合粒径分析仪测试的最佳稀释比例是IXlO4到IXlO6个油体，将不同条件的油体载 体放入aiil cuvette里，再放进粒径分析仪中，进行测试(表2)。油体载体的电负度测试。不同条件的油体载体用sodium phosphate buffer稀释， 适合电位量测仪测试的最佳稀释比例是1XIO4到1 X IO6个油体，将不同条件的油体载体放 Λ 2ml cuvette里，利用Zeta电位量测仪测试油体(表3)。
结果显示，将油和融合蛋白以下列比例(10:1、2:1、1:1、1:5、1:10)混合，来测出最佳 的比例，用显微镜观察，得出油和融合蛋白的最佳比例为1:1，此时油体载体的大小轮廓最 平均，而且油体载体之间的相互融合较少。当以不同PH (6.5,7.0,7.5,8.0,9. 0)的buffer 构建出油体载体，得出用PH7. 5的buffer构建的油体载体大小轮廓最平均，而且油体载 体之间的相互融合较少。用各种油(芝麻油、矿物油、花生油、橄榄油和大豆油)构建油体载 体，芝麻油和橄榄油所构建的油体载体的大小轮廓最平均，而且油体载体之间的相互融合 较少，相反矿物油油体载体颗粒最大，而花生油油体载体之间互相融合较多，呈现链球状。通过粒径分析可知油和融合蛋白在1:1、1:5和1:10时，油体载体颗粒偏小。用 pH7. 5、pH8. 0和pH9. 0的buffer构建出的油体载体颗粒偏小。用大豆油、芝麻油和橄榄油 所构建的油体载体颗粒偏小。在zata分析图中可以看出在不同制备条件下的油体载体的 电负度在-45 -56，差异不大。实施例4油体载体的稳定度测试
不同条件的油体载体用sodium phosphate buffer调整其悬浮的混浊度(T)，在每 间隔固定时间持续进行稳定度测试。为了要用分光光度计0D600测量油体载体，并使用2ml cuvette，选定间隔20分钟，用分光光度计记录不同条件的油体载体在sodium phosphate buffer中的悬浮程度。油体载体悬浮液的混浊度(T)，用10A表示是成比例，混浊度关系表 示T/T0=10A/10A0=10A/102. 0，将人造油体稀释至iVo=2，开始随时间测试其稳定度(图5)。 稳定度结果显示，油体载体的size越大越不稳定，反之，油体载体的size越小越稳定。实施例5油体载体对血球溶血性测试和血清稳定性测试
油体载体对血球溶血性测试。将油体载体置于生理盐水和5%葡萄糖溶液，并放置 3730分钟后离心10000rpm、10分钟，最后用分光光度计测量(图6)。油体载体对血清稳定性测试。将油体载体置于含有5%血清的sodium phosphate buffer并打散，用粒径分析仪在不同时间和不同温度进行测量，并观察随时间增加油体载 体在血清的稳定度和大小(图6)。结果显示油体载体对血球无伤害，不会使血球溶血。粒径分析显示，油体载体在5% 血清里，在不同温度测量二4小时后仍非常稳定。实施例6油体载体的靶向专一性功能测试(in vitro检测)
油体载体作用于固定肿瘤细胞(Fixed cell)的专一性测试。取细胞SK0V3和 MDA-MB-231，于前一日接种在 24 孔板中，隔日以 Phosphate Buffered Saline (PBS)pH7. 5 清洗两次，用2. 5% Formaldehyde在30°C固定40分钟后，再用PBS pH7. 5清洗，放置30°C 让PBS蒸发。将油体载体加入在固定好的细胞，在25°C反应两小时，以PBS pH7.5清洗三 次，每次15分钟，用blocking solution (3% BSA溶于PBS中)在室温下反应一小时，以1 200稀释一抗anti-her2/neu (9G6)，室温反应至少一小时，再PBS清洗三次，每次15分钟， 以1 :500稀释二抗anti-mouse IgG-TRITC,反应一小时，再用PBS清洗三次，每次15分钟， 用1 :15000稀释的DAPI染细胞核，染色4分钟，再以PBS清洗三次，每次15分钟，放置干 燥，封片，利用荧光显微镜观察(图7)。油体载体作用于肿瘤活细胞(Living cell)的专一性测试。取细胞(MCF_7、MCF_7/ Herl8、SK0V3、SKBR3和MDA-MB-231 )，于前一日以每孔1 X IO5细胞的密度接种在M孔板 中，以 DMEM/F12 培养液(GIBCO Invitrogen Corporation, New York, USA)培养，隔日以 DMEM/F12清洗两次，以DMEM/F12培养液稀释油体载体，加在已清洗好的细胞中，在37°C， 5% CO2的培养箱培养2小时，再以PBS pH7. 4清洗三次，用2.5% R)rmaldehyde于30°C固 定40分钟，以PBS pH7. 4清洗三次，然后用blocking solution (3% BSA溶于PBS中)在室 温下反应一小时，以1 :200稀释一抗anti-her2/neu(9G6)，室温反应一小时，再PBS pH7. 4 清洗三次，每次15分钟，以1 :500稀释二抗anti-mouse IgG-TRITC,反应一小时，再用PBS PH7. 4清洗三次，每次15分钟，用1 15000稀释的DAPI染细胞核，染色4分钟，再以PBS清 洗三次，每次15分钟，放置干燥，封片，利用荧光显微镜观察(图8)。不同浓度(MOI)的油体载体作用于肿瘤活细胞测试。取细胞(MCF-7、MCF_7/ Herl8、SK0V3、SKBR3和MDA-MB-231 )，于前一日以每孔1 X IO5细胞的密度接种在M孔板 中，以DMEM/F12培养液培养，隔日以DMEM/F12清洗两次，以DMEM/F12培养液稀释油体载 体，加入不同浓度油体载体在已清洗好的细胞中，在37°C，5% CO2的培养箱培养2小时，再 以PBS pH7. 4清洗三次，用2. 5% Formaldehyde于30°C固定40分钟，以PBS pH7. 4清洗三 次，然后用blocking solution (3% BSA溶于PBS中)在室温下反应一小时，以1 :200稀释 一抗anti-her2/neu (9G6)，室温反应一小时，再PBS ρΗ7· 4清洗三次，每次15分钟，以1 500稀释二抗anti-mouse IgG _ TRITC，反应一小时，再用PBS pH7. 4清洗三次，每次15分 钟，用1 :15000稀释的DAPI染细胞核，染色4分钟，再以PBS清洗三次，每次15分钟，放置 干燥，封片，利用荧光显微镜观察(图9)。油体载体作用肿瘤活细胞不同时间的测试。细胞于前一日以每孔IX IO5细胞的密 度接种在24孔板中，以DMEM/F12培养液培养，隔日以DMEM/F12清洗两次，以DMEM/F12培 养液稀释油体载体，加在已清洗好的细胞中，在37°C，5% CO2的培养箱培养不同时间(15分 钟、30分钟、60分钟、120分钟和240分钟)，再以PBS pH7. 4清洗三次，用2. 5% Formaldehyde 于30°C固定40分钟，以PBS pH7. 4清洗三次，然后用blocking solution (3% BSA溶于 PBS中)在室温下反应一小时，以1 :200稀释一抗anti-her2/neu (9G6)，室温反应一小时， 再PBS pH7. 4清洗三次，每次15分钟，以1 :500稀释二抗anti-mouse IgG - TRITC,反应 一小时，再用PBS pH7. 4清洗三次，每次15分钟，用1 15000稀释的DAPI染细胞核，染色4 分钟，再以PBS清洗三次，每次15分钟，放置干燥，封片，利用荧光显微镜观察(图10)。不同浓度的油体载体作用于肿瘤活细胞的FLOW测试。取细胞(MCF-7、MCF_7/ Her 18、SK0V3、SKBR3和MDA-MB-231 )，于前一日以每孔5X105细胞的密度接种在12孔板中， 以DMEM/F12培养液培养，隔日以DMEM/F12清洗两次，以DMEM/F12培养液稀释油体载体，加 入不同浓度油体载体在已清洗好的细胞中，在37°C，5% CO2的培养箱培养2小时，再以PBS PH7. 4清洗三次，加入trypsin作用5分钟，取细胞至tube (厂牌BD，型号Falcon)中， 1000 rpm、离心10分钟，去除上清液，若马上用流式细胞仪(厂牌BD，型号=FACSCanto)检测，直接加PBS buffer。若隔天测试，用2. 5% i^ormaldehyde于4°C固定，隔夜放置，将细胞 打散，用流式细胞仪检测(图11)。油体载体作用肿瘤活细胞不同时间的FLOW测试。取细胞(MCF-7、MCF_7/Herl8、 SK0V3、SKBR3和MDA-MB-231)，于前一日以每孔5 X IO5细胞的密度接种在12孔板中，以 DMEM/F12培养液培养，隔日以DMEM/F12清洗两次，以DMEM/F12培养液稀释油体载体，加在 已清洗好的细胞中，在37°C，5% CO2的培养箱培养不同时间(15分钟、30分钟、60分钟、120 分钟和240分钟)，再以PBS pH7. 4清洗三次，加入trypsin作用5分钟，取细胞至tube中， 1000 rpm、离心10分钟，去除上清液，若马上用流式细胞仪检测，直接加PBS buffer.若隔 天测试，用2. 5% Formaldehyde于4°C固定，隔夜放置，将细胞打散，用流式细胞仪检测(图 12)。油体载体对SK0V3细胞株的共轭荧光显微镜XY轴平面观察和Z轴切面观察。取细 胞SK0V3，于前一日以每孔1 X IO5细胞的密度接种在M孔板中，以DMEM/F12培养液培养， 隔日以DMEM/F12清洗两次，以DMEM/F12培养液稀释油体载体，加在已清洗好的细胞中，在 37°C, 5% CO2的培养箱培养2小时，再以PBS pH7. 4清洗三次，再用2. 5% Formaldehyde于 30°C固定40分钟，以PBS pH7. 4清洗三次，然后用blocking solution (3% BSA溶于PBS 中)在室温下反应一小时，以1 :200稀释一抗anti-her2/neu(9G6)，室温反应一小时，再PBS ρΗ7· 4清洗三次，每次15分钟，以1 :500稀释二抗anti-mouse IgG - TRITC，反应一小时， 再用PBS pH7. 4清洗三次，每次15分钟，用1 :15000稀释的DAPI染细胞核，染色4分钟，再 以PBS清洗三次，每次15分钟，放置干燥，封片，利用雷射扫描共轭焦分光光谱显微镜拍摄 相同位置不同高度的照片，再用Leica system分析(图13)。结果显示，利用细胞固定的方式，来测试由oleZH2所构建的油体载体表面融合的 ZH2 pepteide是否能专一性识别HER-2/neu蛋白受体。利用有HER-2/neu的MCF7/Herl8细 胞和无HER-2/neu的MDA-MB-231细胞，用油体载体作用此两种细胞，结果发现MDA-MB-231 细胞未观察到有荧光讯号产生，而在MCF7/Herl8细胞可以观察到很多绿色荧光讯号。有绿 色荧光油体载体讯号是因为细胞上的HER-2/neu过度表达，所以能让油体载体辨识到。可 见，油体载体的oleZH2能专一性识别HER-2/neu过度表现的细胞。油体载体能专一性识别HER-2/neu过度表现的固定细胞，下一步要深入了解油 体载体对活细胞的专一性识别。利用MCF-7、MCF-7/Herl8、SK0V3、SKBR3和MDA-MB-231 细胞株，从结果可知油体载体作用于HER-2/neu过度表现的细胞(MCF7/Herl8、SKBR3和 SK0V3)，由荧光显微镜可以观察到很多绿色荧光讯号。油体载体不能作用于没有HER-2/neu 过度表现的细胞(MCF7和MDA-MB-231)，由荧光显微镜未观察到有荧光讯号产生。以上结果表明证明油体载体能专一性识别靶细胞。当用不同浓度的油体载体作用 于HER-2/neu过度表现的SK0V3细胞，由荧光显微镜观察，随着油体载体的加入浓度越高， 油体载体结合在细胞表面越多，专一性识别细胞的能力越好，但是油体载体作用到MOI 200 时有呈现饱和的趋势。利用油体载体在不同时间作用SK0V3细胞，由荧光显微镜观察发现，当油体载体 加入浓度固定时，随着时间越长，油体载体结合在细胞表面越多，专一性识别细胞的能力越 好，但是油体载体作用到两小时时有呈现饱和的趋势。利用流式细胞仪检测油体载体在不同时间和不同浓度进入细胞的多少，结果显示当浓度固定时，时间越长，油体载体进入细胞的量越多。当时间固定，浓度越高，油体载体进 入细胞的量越多。无论是时间越长或是浓度越高，油体载体进入细胞的量都有增加的趋势， 后来都会有饱和的情形。利用共轭荧光显微镜对有油体载体作用的单一细胞进行平行切割，在不同的层面 叠加起来，可以看到发绿色荧光的油体载体确实进入细胞。实施例7油体载体的靶向药物传送测试(in vitro检测)
取oleZH2蛋白，加入0. OlM pH7. 5 sodium phosphate buffer，再加入含有喜树碱 (厂牌SIGMA，浓度500μ g/ml)的芝麻油，用超声波细胞粉碎机进行冰上超声混合(功 3. 0%, time :20 秒，run :0. 5 秒，rest :0. 5 秒)，以 13000 rpm、4°C冷冻离心 10 min，取出上 面一层白色的油饼，加入0. OlM pH7. 5 sodium phosphate buffer 1 ml，用超声机打散，相 同步骤进行三次，构建出包覆油溶性药物的油体载体。包覆不同浓度喜树碱的油体载体的FIlR观察。油体载体于4°C冷冻离心10 min, 取出上层油饼，再用冷冻干燥机将油体载体冷冻干燥，最后将油体载体放置盐片中，并用 FTIR观察(图14)。包覆不同浓度喜树碱的油体载体的稳定性浊度测试。油体载体用sodium phosphate buffer调整其悬浮的混浊度(T)，在每间隔固定时间持续进行稳定度测试。为 了要用分光光度计0D600测量油体载体，并使用aiil cuvette，选定间隔20分钟，并用分光 光度计记录不同条件的油体载体在sodium phosphate buffer中的悬浮程度。油体载体悬 浮液的混浊度(T)，用10A表示是成比例，混浊度关系表示为T/T0=10A/10A0=10A/102. 0，将 油体载体稀释至Ao=2，开始随时间测试其稳定度(图15)。包覆不同浓度喜树碱的油体载体的粒径大小测试。油体载体用sodium phosphate buffer稀释，适合粒径分析仪测试的最佳稀释比例是1 X IO4到1 X IO6个油体，将不同条件 的油体载体放入anl cuvette里，放进粒径分析仪中，进行测试(表4)。
包覆不同浓度喜树碱的油体载体的电负度测试。油体载体用sodium phosphate buffer稀释，适合电位量测仪测试的最佳稀释比例是IXlO4到1 X IO6个油体，将不同条件 的油体载体放入anl cuvette，利用kta电位量测仪测试(表4)。包覆不同浓度喜树碱的油体载体的细胞存活性测试。取细胞(MCF-7、MCF_7/ Herl8、SK0V3、SKBR3和MDA-MB-231 )，于前一日以每孔1 X IO4细胞的密度接种在M孔板 中，以DMEM/F12培养液培养，隔日以DMEM/F12清洗两次，并以DMEM/F12培养液稀释油体载 体，加在已清洗好的细胞中，在37°C，5% CO2培养箱培养2小时，再以PBS pH7. 4清洗三次， 加入含有10% FBS的DMEM/F12培养液，在37°C，5% CO2的培养箱以标准程序进行继代培养， 于72小时计数活细胞和apoptosis细胞，进行分析(图16)。结果显示，当用油体载体包覆不同浓度的油溶性喜树碱后，利用FIlR测试喜树碱 的官能基结果得知，油体载体可以包覆油溶性药物(喜树碱最大溶油溶解度是500mg/ml)。 由粒径测试得知油体载体可以包覆油溶性药物，不会因为包覆药物而使油体载体的size 更大。但是，油体载体包覆喜树碱后，随包覆量增加，其粒径增加，负电性减少。经过稳定度 测试，油体载体包覆喜树碱后的size偏小，因此非常稳定。经以上实验证明，可知油体载体能专一性识别细胞，当用油体载体包覆不同浓度 的油溶性药物(喜树碱)作用在HER-2/neu过度表现细胞(MCF7/Herl8和SK0V3)和没有HER-2/neu过度表现细胞(MDA-MB-231和MCF7)，观察不同时间细胞apoptosis程度，结果 得到在固定时间内，油体载体包覆浓度越高的油溶性药物，细胞apoptosis程度越高。实施例8油体载体的靶向专一性功能测试(in vivo检测)
取约8-10周的裸鼠，利用细胞株(SK0V3和MDA-MB-231)进行皮下组织注射，使裸 鼠皮下组织的肿瘤大小约0. 5厘米以上，注射lOOPg/ml含有荧光染剂(Yellow GGK)的油 体载体在肿瘤上，在注射后的0h、lh、4h、》!和Mh时间，利用IVIS观察油体载体的残留讯 号(图17)。再取出肿瘤、心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏，利用非侵入式活体影像系统观察油 体载体残留在各个脏器中的讯号(图18)。再把肿瘤和有讯号的组织进行冷冻组织切片。先取下肿瘤，利用OCT包埋(包埋时不要有气泡)，在_20°C的冰箱里放置一小时 以上，利用冷冻切片机(厂牌LeiCa，型号CM3050S)切下包埋的组织并贴附在玻片上，用 PBS pH7. 4清洗两次，再用2. 5% R)rmaldehyde于室温固定40分钟，以PBS pH7. 4清洗三 次，用15000倍稀释的DAPI进行细胞核染色，以PBS pH7. 4清洗三次，封片，利用荧光显微 镜进行观察(图18)。
结果显示，约8-10周大的裸鼠利用有HER-2/neu过度表现细胞(SKOViB)和没有 HER-2/neu过度表现细胞(MDA-MB-231)，进行皮下组织注射，使裸鼠皮下组织的肿瘤长、宽 和高大小各约0. 5厘米以上，并注射带荧光的油体载体在肿瘤上，利用IVIS观察，随着时间 增加，在有HER-2/neu过度表现的肿瘤上，亮度不会减少，一直有残留讯号，而没有HER-2/ neu过度表现的肿瘤，随着时间的增加，油体载体荧光讯号发光强度会慢慢消失，可见油体 载体能专一性识别肿瘤。取出裸鼠的肿瘤、心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏，对每个脏器进行IVIS观察，可以 看到在有HER-2/neu过度表现的肿瘤细胞里，有荧光讯号。再进行冷冻组织切片，利用荧光 显微镜观察油体载体的分布，可以看出有HER-2/neu过度表现的肿瘤细胞有荧光油体载体 残留。实施例9油体载体的靶向药物递送测试(in vivo检测)
取约8-10周的裸鼠，利用细胞株(SK0V3和MDA-MB-231)进行皮下组织注射，使裸鼠皮 下组织的肿瘤大小约0. 5厘米以上，每星期两次注射100mg/ml包覆喜树碱的油体载体在肿 瘤上，观察肿瘤大小与体重变化(图19，图20)。由以上动物实验可观察到油体载体的靶向性，进一步观察包覆药物的油体载体的 癌症治疗效果。由结果显示，随时间的增加，包覆喜树碱的油体载体能抑制肿瘤生长，使肿 瘤缩小，而裸鼠的体重没有减少，这更能达到治疗的功效。
权利要求
1.一种靶向治疗乳癌的人造油体载体，其特征在于，所述人造油体载体包含一融合蛋 白和一脂质，融合蛋白与脂质重量/体积比值(微克/微升)至少约1/25，该油体平均粒径 为50纳米至2000纳米。
2.根据权利要求1所述的人造油体载体，其特征在于，该人造油体载体所含的融合蛋 白，其包含一油体蛋白、一配体性肽或一抗体性肽、一细胞穿透性肽或前述组合。
3.根据权利要求1或2所述的人造油体载体，其特征在于，该人造油体载体所含的融合 蛋白，其所含的油体蛋白并无任何限制；来自植物种子的油体蛋白较佳，例如芝麻油、橄榄 油、大豆油、花生油和矿物油其组合，来自芝麻种子的油体蛋白更佳。
4.根据权利要求1或2所述的人造油体载体，其特征在于，该人造油体载体所含的融合 蛋白，其所含的配体胜肽或抗体胜肽并无任何限制，只要具有专一性识别细胞的功能即可； 就配体性肽而言，当治疗乳癌或卵巢癌时，可采用HER2/neU蛋白质受体的配体性肽。
5.一种如权利要求1所述的靶向治疗乳癌的人造油体载体的制备方法，其特征包括以 下步骤(1)融合蛋白的表达；重组菌种BL21(DE3)/pJ01-oleZH2在37°C下培养，细菌初始密 度OD55tl值为0.08 ；接种到新鲜含有氨苄青霉素的LB培养液，当细菌密度OD55tl值为0.3时， 37°C诱导4小时，收集菌体，以4000 rpm、4°C冷冻离心10 min，再用0. 1 M pH7. 5 sodium phosphate buffer 清洗一次,收集菌体，以 0. IM pH7. 5 sodium phosphate buffer浓缩成 细菌密度OD55tl值为10的菌液；将细菌密度OD55tl值为10的菌液用超声波细胞粉碎机进行冰上超声破碎(功率3. 5%， 时间2分钟，run 0. 5秒，rest :0. 5秒);超声结束后，以13000 rpm、4°C冷冻离心10 min, 收集离心后上清液和沉淀不水溶蛋白；(2)人造油体载体的制备；取IOOPgoleZH2蛋白，加入950μ1 0. OlM pH7. 5 sodium phosphate buffer，再加入50μ1芝麻油，用超声波细胞粉碎机进行冰上超声混合(功率 3. 0%, time :20 秒，run :0. 5 秒，rest :0. 5 秒)，以 13000 rpm、4°C冷冻离心 10 min，取出上 面一层白色的油饼，加入0. OlM pH7. 5 sodium phosphate buffer 1 ml，用超声波细胞粉碎 机打散，相同步骤进行三次，构建出人造油体载体。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于步骤(1)所述的重组菌种为BL21(DE3)/ pJ01-oleS12，在 37°C下培养，初始浓为 OD55tl = 0. 08。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于步骤(1)所述的重组菌种接种到新鲜含有 氨苄青霉素的LB培养液，当细胞浓达OD55tl = 0.3时，37°C诱导4小时，收集菌体，以 4000 rpm、4°C冷冻离心 10 min，再用 0. 1 M pH7. 5 sodium phosphate buffer 清洗一次， 收集菌体，以0. IM pH7. 5 sodium phosphate buffer浓缩成细胞浓 OD55tl = 10的菌液。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于步骤(1)所述的细胞浓OD55tl = 10的菌 液用超声波细胞粉碎机进行冰上超声破碎；超声设置为功率3. 5%，时间2分钟，rim 0. 5秒， rest 0. 5 秒。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于步骤(2)所述的取IOOPgoleZH2蛋白，加 入950μ1 0. OlM ρΗ7· 5 sodium phosphate buffer，再加入50μ1芝麻油，用超声波细胞粉 碎机进行冰上超声混合。
10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于步骤(2)所述的超声设置为功率3.0%，time 20 秒，run 0. 5 秒，rest 0. 5 秒。
11.根据权利要求5所述的方法，其特征在于步骤(2)所述的冰上超声混合后，以13000 rpm、4°C冷冻离心10 min，取出上面一层白色的油饼，加入0. OlM pH7. 5 sodium phosphate buffer 1 ml，用超声波细胞粉碎机打散，相同步骤进行三次，建构出人造油体载体。
12.根据权利要求5获得的人造油体载体，其特征在于，所述的人造油体载体在不同制 备条件下(不同比例、不同PH和不同种的油)的优化测试，由荧光显微镜观察、粒径大小分 析、电负度测试和稳定度测试可得到人造油体载体最佳条件有下列几点(1)油和融合蛋 白的最佳比例为1:1，此时人造油体载体的大小轮廓最平均，而且人造油体载体之间的相互 融合较少；(2)用pH7.5的buffer构建的人造油体载体大小轮廓最平均，而且人造油体载体之 间的相互融合较少；(3)以芝麻油制备的人造油体载体最稳定；(4)人造油体载体的size越大越不稳定，越小越稳定；(5)利用过膜实验能得到较小的人造油体载体；(6)不同条件构建的人造油体载体的负电荷为-45 -56，差异不大。
13.根据权利要求5获得的人造油体载体，其特征在于所述的人造油体载体包覆荧光 物质(如yellow GGK和Nile red)后，也能使人造油体载体发出荧光，而且更利于观察，可 用于反映HER2/neu阳性癌细胞，从而可专一性检测过度表达HER2/neu的乳癌细胞。
14.根据权利要求5获得的人造油体载体，其特征在于所述的人造油体载体在活体外 (in vitro)和活体内(in vivo)实验中都具有靶向性，能专一性识别靶细胞，包覆药物后可 有效杀死乳癌细胞，可用于乳癌细胞的靶向治疗。
15.根据权利要求5获得的人造油体载体，其特征在于所述的人造油体载体进行 细胞实验(固定细胞和活细胞)，可以看出人造油体载体可专一性识别过度表现HER-2/ neu的肿瘤细胞株(SKBR3和SK0V3)，不会识别没有表现HER-2/neu的肿瘤细胞(MCF7和 MDA-MB-231)；人造油体载体加入的时间越长或浓度越高，人造油体载体结合到HER-2/neu 过度表现的细胞越多，专一性识别此细胞的能力越好，但是人造油体载体作用时间达两小 时或浓度达200时有呈现饱和的情形；利用共轭荧光显微镜在不同的层面叠加起来可以看 出发绿色荧光的人造油体载体进入细胞；用流式细胞仪进一步说明若浓度固定，时间越长， 人造油体载体进入细胞的量越多，若时间固定，浓度越多，人造油体载体进入细胞的量越多。
16.根据权利要求5获得的人造油体载体，其特征在于所述的人造油体载体包覆油溶 性药物(喜树碱)，当其作用于有HER-2/neu过度表现的细胞时，会产生毒杀效果，使细胞有 apoptosis现象；当作用于没有HER-2/neu过度表现的细胞时，则少看到有毒杀效果。
17.根据权利要求5获得的人造油体载体，其特征在于所述的人造油体载体注射到裸 鼠肿瘤细胞，利用IVIS观察到人造油体载体在有HER-2/neu过度表现的肿瘤组织上有讯号 产生，在没有HER-2/neu过度表现的肿瘤组织则无讯号；再经由组织切片得知人造油体载 体会专一性识别过度表现HER-2/neu的肿瘤，不会识别没有表现HER-2/neu的肿瘤。
18.根据权利要求5获得的人造油体载体，其特征在于所述的人造油体载体包覆油 溶性药物(喜树碱)，在体内抗肿瘤活性测试中，取约8-10周的裸鼠，用细胞(SK0V3和MDA-MB-231)进行皮下组织注射，使裸鼠皮下组织的肿瘤大小约0. 5厘米以上，每星期两次 注射100mg/ml包覆喜树碱的人造油体载体在肿瘤上，结果显示，随时间增加，包覆喜树碱 的人造油体载体能抑制肿瘤生长，而且裸鼠体重没有减少；这说明本研究成功构建一种能 靶向治疗乳癌的人造油体载体。
全文摘要
本发明公开了一种能靶向治疗乳癌的人造油体载体、该载体的制备方法及应用。本发明利用pJO1-oleZH2质粒转化进入大肠杆菌BL21(DE3)宿主细胞后，经过诱导，进行oleZH2蛋白的生产，再将油和oleZH2蛋白混合，构建出人造油体载体。经由活体外(invitro)和活体内(invivo)实验确认本发明的人造油体载体可有效地运用于标靶治疗，而且包覆荧光物质的油体载体可反映HER2/neu阳性癌细胞，从而可专一性检测过度表达HER2/neu的乳癌细胞。本发明的制备过程简便且对环境造成的污染很低，人造油体载体在血球或血清中稳定性佳，还具有便宜、高效、操作方便、容积小和容易运输等优点。此人造油体载体能包覆各种不同油溶性抗乳癌药物，包覆药物后可有效杀死乳癌细胞，并可以对乳癌细胞进行专一性检测及标靶治疗。
文档编号G01N33/574GK102100914SQ201010598650
公开日2011年6月22日 申请日期2010年12月21日 优先权日2010年12月21日
发明者朱宝美, 陈顺基 申请人:朱宝美, 陈顺基