专利名称：一种鱼类早期生命阶段的高通量急性毒性测试方法
技术领域：
本发明涉及一种专门针对鱼类早期生命阶段的高通量急性毒性测试方法，属于环境检测和评价技术范畴。
背景技术：
随着社会经济的快速发展和工农业生产活动的日益加剧，越来越多的化学品被生产和使用，据报道，目前已登记的化学品数量超过数千万种之多，日常生活和生产中使用的化学品数量超过10万种。这些化学品在生产和使用过程中可能通过多种途径进入环境或残留在人体、生物体中，对生态环境和人体健康造成严重威胁。为准确评价化学品以及环境样品的安全性，生物毒性效应是必不可少且最为重要的基础数据。
当前普遍采用的生物毒性测试方法已有数十种之多，国际标准组织(ISO)、经济合作与发展组织(0E⑶)、美国环保署(USEPA)、欧盟(EU)等国际组织和机构已经对部分生物毒性测试的方法制定了规范、标准，我国近年也陆续颁布实施了数项生物毒性测试的标准方法，《水质物质对淡水鱼(斑马鱼)急性毒性测定方法GB/T13^7-1991》就是其中之一， 和ISO等国际标准组织推荐的方法具有一定的可比性，在国内毒性测试领域广泛使用。但是，目前有关鱼类急性毒性测试的标准方法中，大多推荐使用成鱼作为受试生物，在实际操作中存在诸多不足。比如，由于每个样品的毒性测试都需要大量的受试鱼，成鱼的喂养相对较难，对实验人员的技术要求较高；喂养大量的实验用鱼需要高额的实验室建设费用、日常维护费用和人员投入；测试用成鱼体型较大，暴露容器也相应较大，不方便操作，另外，需要的样品体积也比较大，若采用流水式实验，所需样品体积更大，不利于微量样品的测试；由于成鱼个体之间的差异较大，所测得的结果往往存在一定的差异性，为降低个体误差往往需要进行多个平行实验，却又增加了实验用鱼的数量、样品体积、实验费用；传统的成鱼毒性测试实验暴露时间一般不低于96小时，所需时间较长，不利于大批量样品的快速测试； 成鱼对化学污染物的敏感性相对较低，测定半数致死浓度往往需要较大量的样品。因此，开发一种快速、灵敏、高通量的鱼类急性毒性测试方法十分迫切。发明内容
本发明的目的是为克服传统成鱼急性毒性测试中受试生物个体大、数量少、个体差异大、测试时间长、重现性低等不足，提供一种简便、经济、快速、高通量的急性毒性测试方法，为有毒化学污染物和环境样品的急性毒性测试提供技术保障。
本发明的目的通过以下方式实现针对毒性测试中的受试生物鱼类，开发出一种专门的重组稀释溶液，培养新生的仔鱼并用于急性毒性测试；同时，通过选择早期生命阶段的仔鱼、采用微孔板作为毒性暴露容器，进行急性毒性测试，实现了鱼类急性毒性的高通量测试。
本发明的优点主要体现在以下几个方面(1)开发了一种专门针对鱼类培养的重组稀释溶液，用于快速、稳定培养早期生命阶段的受试仔鱼；( 通过比较、选择了处于早期生命阶段的仔鱼作为受试生物开展急性毒性测试，弥补了传统方法中采用成鱼进行毒性测试的诸多不足(如个体差异大、重现性差、灵敏度低、成本高、技术要求高等)；C3)采用微孔板作为毒性暴露的容器，既降低了实验待测样品的体积，也实现了毒性测试的高通量；(4)采用该方法既节省了实验时间，也降低了实验成本，实验结果比传统方法有所提高；(5)本发明操作简单，降低了对操作人员技术水平的要求，也便于方法的推广普及。
综上所述，本发明通过开发一种专门针对鱼类培养和毒性测试的重组稀释溶液， 实现了对早期生命阶段受试鱼类的快速、稳定培养；通过比较不同生命阶段受试鱼类对毒性污染物的敏感性，确定采用处于早期生命阶段的鱼类作为受试生物，既实现了急性毒性测试的灵敏性和稳定性，又缩短了毒性测试时间，也降低了成本；采用微孔板作为毒性测试的暴露容器，降低了待测样品的体积，实现了测试的高通量，一定程度上提高了检测的灵敏度。运用该方法，保证了化学污染物、环境样品急性毒性的简便、经济、快速、高通量检测。
图1.仔鱼微孔板方法与成鱼传统方法急性毒性测试结果的比较
图中实心柱代表用仔鱼的微孔板高通量方法测定锌离子所得半数致死浓度，空心柱代表用成鱼的传统方法测定锌离子所得半数致死浓度。
具体实施方式
实施例
将采集的日本青鏘鱼卵经过精心挑选后，置于配制的重组稀释溶液中，放入40°C 的恒温培养箱中培养、孵化。收集孵化出的仔鱼，继续放入稀释溶液中培养6小时，作为受试生物。在6孔板的每个孔中盛放待测污染物的溶液5毫升，每孔中放入5条受试仔鱼，之后放入25°C恒温培养箱中暴露12小时，记录死亡的仔鱼数目，计算污染物的半数致死率。
权利要求
1.本发明涉及一种专门针对鱼类早期生命阶段的高通量急性毒性测试方法，属于环境检测和评价技术范畴。通过开发毒性测试的重组稀释溶液，探讨处于不同生命阶段的鱼对毒性污染物的敏感性，以及不同数量的受试生物、不同暴露容器等条件对测试结果的影响， 实现了仔鱼急性毒性测试的高通量。该方法简便、经济、快速，对实验操作技术水平要求不高，便于推广应用。
2.权利要求1所述的一种鱼类早期生命阶段的高通量急性毒性测试方法，其特征在于受试鱼类包括斑马鱼、日本青鏘、稀有鉤鲫等多种小型鱼种。
3.权利要求1所述的一种鱼类早期生命阶段的高通量急性毒性测试方法，其特征还在于受试鱼类应为出生0-240小时之间的仔鱼。
4.权利要求1所述的一种鱼类早期生命阶段的高通量急性毒性测试方法，其特征还在于培养仔鱼的重组稀释溶液的组成，包括无机组分(如氯化钠、氯化钙、碳酸氢钠、氯化镁、氯化钾等)，有机组分(包括氨基酸、甘油、维生素、葡萄糖等)。
5.权利要求1所述的一种鱼类早期生命阶段的高通量急性毒性测试方法，其特征还在于毒性测试的暴露容器可以是6孔板、12孔板、M孔板、48孔板、96孔板等。
6.权利要求1所述的一种鱼类早期生命阶段的高通量急性毒性测试方法，其特征还在于急性毒性测试的暴露温度可以在5°C -40°C之间。
7.权利要求1所述的一种鱼类早期生命阶段的高通量急性毒性测试方法，其特征还在于毒性测试的暴露时间可以在6-120小时之间。
全文摘要
本发明涉及一种专门针对鱼类早期生命阶段的高通量急性毒性测试方法，属于环境检测和评价技术范畴。通过开发毒性测试的重组稀释溶液，探讨处于不同生命阶段的鱼对毒性污染物的敏感性，以及不同数量的受试生物、不同暴露容器等条件对测试结果的影响，实现了仔鱼急性毒性测试的高通量。该方法简便、经济、快速、灵敏，对实验操作技术水平要求不高，便于推广应用。
文档编号G01N33/00GK102539640SQ20101060851
公开日2012年7月4日 申请日期2010年12月17日 优先权日2010年12月17日
发明者杜宇国, 谭卓威, 魏东斌 申请人:中国科学院生态环境研究中心