专利名称：人载脂蛋白B100(Apo-B100)ELISA试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于检测人载脂蛋白B100的试剂
品.o
背景技术：
酶联免疫吸附测定法(enzymelinked immunosorbent assay，ELISA)是以免疫学 反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏 感性很高的试验技术。由于抗原、抗体的反应在一种固相载体——聚苯乙烯微量滴定板的 孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而有效的保证试 验结果的特异性与稳定性。肝脏合成的载脂蛋白BlOO(Apo-BlOO)是人血浆中低密度脂蛋白(LDL)及极低密 度脂蛋白(VLDL)的主要载脂蛋白。大量临床研究指出，高水平的ApO-B100是提示动脉粥 样硬化、冠心病及脑血管疾病发生的危险因素。特别是在冠心病易患性的预测上，ApO-B100 的测定比总胆固醇和LDL-C的测定更好。传统的检测ApO-B100的方法有比浊测定法、火箭免疫电泳测定法、放射性免疫扩 散法(RID)等。其中比浊测定法是目前应用于载脂蛋白定量测定的比较普遍的方法，主要 有两类散射比浊法和透射比浊法。这两种方法都可以测ug/ml以上的含量，操作简便、快 速，但需要特殊的激光浊度计或全自动生化分析仪，一次性投资大，价格昂贵，不适合一般 实验室使用；火箭电泳法操作比较复杂，并且由于其是通过测量火箭峰的高度或面积来进 行定量，所以误差较大，并且稳定性也较差，临床使用较少；由于放射免疫分析是竞争性的 反应，使用RID法时被测物和标准物不能全部参与反应，测得的值是相对量而非绝对量，而 且RID法存在放射性同位素半衰期短，放射性污染不易保存，稳定性差等缺点，使用中有诸 多不便。ELISA法是免疫学检测中的一项新技术，现已广泛应用于多种病原微生物所引起 的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断，也已应用于大分子抗原和小分子抗原 的定量测定。ELISA法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点，不仅适用 于临床标本的检验，而且由于一天之内可以检查几百份甚至上千份样品，因此特别适用于 血清流行病学的研究。
实用新型内容本实用新型要解决的技术问题是本试剂盒采用ELISA方法检测血清中的 Apo-B100含量，而且在传统的ELISA技术基础上采用了生物素-亲和素放大系统，显著提高 了 ApO-B100检测的灵敏度。为了解决上述技术问题，本实用新型所采用的技术方案是一种人载脂蛋白 B100 (Apo-B100) ELISA试剂盒，包括酶标板，所述酶标板包括固相载体和包被层，所述固相 载体为设置有多个微孔的微孔板，所述包被层附着在所述固相载体的微孔表面，所述包被层是由人载脂蛋白B100单克隆抗体涂布在微孔上形成的。优选的，所述固相载体为96孔聚苯乙烯试剂板(PS)。优选的，所述固相载体为48孔聚苯乙烯试剂板(PS)。优选的，所述固相载体为60孔聚苯乙烯试剂板(PS)。本试剂盒是利用ELISA方法来检测人血清中的Apo-BlOO，与传统方法相比，ELISA 法敏感性高、稳定性好、操作简便，且成本较低。
图1为本实用新型一具体实施例试剂盒的酶标板沿着一列微孔的纵剖示意图。1固相载体微孔，2包被层。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本实用新型作进一步说明，以使本领域的技术人员 可以更好的理解本实用新型并能予以实施，但所举实施例不作为对本实用新型的限定。试剂盒的酶标板包括固相载体和包被层。如图1所示，固相载体上有微孔1，包被 层2附着在微孔1上。包被层是由人Apo-BlOO单克隆抗体涂布在微孔上形成的。固相载 体采用60孔聚苯乙烯试剂板(PS)，即固相载体上每列有5个微孔，一共12列。当然也可采 用90或48孔聚苯乙烯试剂板(PS)或其他材料的试剂板。该具体实施例的试剂盒制备方法是采用聚苯乙烯试剂板作为固相载体，在试剂 板微孔条上先包被一定浓度的人Apo-BlOO单克隆抗体，4°C过夜，经洗板后制成包被好的 酶标板，以备标本检测。分别以生物素化兔抗人Apo-BlOO多克隆抗体，辣根过氧化物酶 (HRP)标记的亲和素作为检测试剂A及B，以3，3' ,5,5'-四甲基联苯胺(TMB)及硫酸分 别作为底物及终止液。经过对试剂盒一系列的质量指标检测，包括灵敏度、重复性、特异性、回收率及线 性测定，表明该检测体系成熟，本实用新型试剂盒各项指标检测结果1.标准曲线
浓度(ng/ml)标准品OD值OD值平均值校正值00.0980.0740.086--1.560.4150.1230.2690.1833.120.6090.2450.4270.3416.250.7750.3650.570.48412.50.9490.5290.7390.653251.146—0.8080.9770.891501.4581.3261.3921.3061002.0542.1172.0312.灵敏度与比浊法lug/ml的最低检测限相比，ELISA法检测人血清标本时最低 检测限为0. 45ng/ml，极大地提高了灵敏度；3.回收率用同一血清样本分别添加不同量的定值标准品，作回收试验(n = 5)。 平均回收率98. 56% (表1)。
4[0022] 表1ELISA法测定Apo-B100的回收试验
定值标准品(ng/ml)回收率(％)10093.3825102.666.2599.64平均回收率98.56因此该试剂盒适用于血清中Apo-BlOO检测，对于反映肝病活动与否、肝损程度、 肝贮备能力和肝病预后，有相当的临床意义和价值，也对预测动脉粥样硬化性心血管疾病 极有价值。下面通过两个实验来检测本实用新型试剂盒的质量指标实验1 应用人血清载脂蛋白B100 (Apo-BlOO)ELISA试剂盒以及大型自动生化分 析仪分别定量检测人定值(2. 53ng/ml)血清标本(n = 20)。1、人血清载脂蛋白B100 (Apo-B100) ELISA试剂盒方法操作①将试剂盒平衡至室 温。②加样分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液lOOul，余孔分别加 标准品(Apo-BlOO)或定值样品lOOul，覆膜，37°C放置2小时。标准品浓度分别为100ng/ mL, 50ng/mL, 25ng/mL, 12. 5ng/mL, 6. 25ng/mL, 3. 12ng/mL, 1. 56ng/mL。③弃去液体,甩干,每 孔加检测试剂A工作液lOOul，覆膜，37°C放置1小时。④弃去孔内液体，洗板3次，甩干， 每孔加检测液试剂B工作液lOOul，覆膜，37°C放置1小时。⑤弃去孔内液体，洗板5次，甩 干。⑥每孔加TMB溶液90ul，37°C避光显色30分钟。依序每孔加终止溶液50ul，用酶联仪 在450nm波长测量各孔的光密度(0D值)。2、大型自动生化分析仪检测同一上述血清标本按照仪器要求，上样，运行仪器，仪器自动打出结果。3、结果见表2表2.不同实验方法检测结果比较
定值样品 测定均值 (mean)相对误 差 (%)标准差(SD)变异系数(CV %)批内批间批内批间ELISA 法2.541 ng/ml0.4350.1670.1486.485.72生化仪 法低于检测限实验2 应用人载脂蛋白B100(Apo-B100)ELISA试剂盒以及大型自动生化分析仪 分别定量检测人定值(8. 72ug/ml)血清标本(n = 20)。1、方法及操作同实施例1，但用ELISA方法进行检测时需对标本进行10，000倍稀释。2、结果见表3
5[0036]表3.不同实验方法检测结果比较
权利要求一种人载脂蛋白B100(Apo B100)ELISA试剂盒，包括酶标板，所述酶标板包括固相载体和包被层，其特征在于所述固相载体为设置有多个微孔的微孔板，所述包被层附着在所述固相载体的微孔表面，所述包被层是由人载脂蛋白B100单克隆抗体涂布在微孔上形成的。
2.如权利要求1所述的人载脂蛋白B100(Apo-B100)ELISA试剂盒，其特征在于所述 固相载体为96孔聚苯乙烯试剂板。
3.如权利要求1所述的人载脂蛋白B100(Apo-B100)ELISA试剂盒，其特征在于所述 固相载体为48孔聚苯乙烯试剂板。
4.如权利要求1所述的人载脂蛋白B100(Apo-B100)ELISA试剂盒，其特征在于所述 固相载体为60孔聚苯乙烯试剂板。
专利摘要本实用新型涉及检测人载脂蛋白B100的生物技术领域，具体提供了一种人载脂蛋白B100(Apo-B100)ELISA试剂盒，包括酶标板，其中酶标板又包括固相载体和包被层，固相载体为设置有多个微孔的微孔板，包被层附着在固相载体的微孔表面，包被层是由人载脂蛋白B100单克隆抗体涂布在微孔上形成的。利用本试剂盒检测人血清中的Apo-B100，敏感性高、稳定性好、操作简便，且成本较低。
文档编号G01N33/544GK201707338SQ20102023614
公开日2011年1月12日 申请日期2010年6月24日 优先权日2010年6月24日
发明者从旭霞, 何峰容, 汪景, 章秀波, 童晓玲, 马云芳 申请人:武汉优尔生科技股份有限公司