专利名称：免疫分析方法及用于该方法的试剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于低浓度样品测定的新型免疫分析方法及用于该方法的试剂。
背景技术：
免疫学分析方法通过在血清、血浆、尿等的临床检查中使用自动分析装置而简便、 迅速地进行测定，因此得到广泛普及。为了扩大免疫学分析法的用途，要求比现有的试剂低的低值区域的检出灵敏度及可靠性。在免疫学分析试剂中添加表面活性剂的方法虽然为已知，但多数是作为避免基质的影响等控制反应性的方法或放大吸光度变化量的方法而使用(参照专利文献1、2)。扩大免疫学分析试剂的可测定区域的方法有提高测定区域的检出上限的方法、 及降低测定区域的检出下限的方法。为了降低免疫学分析试剂的可测定区域的检出下限而实现高灵敏度化，有增加试剂中所含的致敏粒子或抗体或者抗原的量来提高低值区域的灵敏度的方法。但当提高低值区域的灵敏度而再现性仍差时，则得不到低值的精度。当使用反应性高的成分以便提高低值区域的灵敏度时，存在以下情况试剂的稳定性降低，由于自身凝集而在试剂保存中进行凝集反应，和引起非特异性凝集而即便是在空白样品中也进行凝集反应。当提高低值区域的灵敏度时，例如在测定吸光度变化的自动分析装置中，由于对吸光度变化量设定了上限，因此高值区域的灵敏度受到限制，存在得不到宽的测定区域的情况。在欲降低测定区域的检出下限时，由于会产生如上所述的问题，因此难以扩大可测定区域。现有技术文献
专利文献1 日本专利特开2005-241415号公报专利文献2 日本专利特开2006-U6166号公报。
发明内容
因此，本发明的目的是提供能够使免疫分析法中的测定区域扩大的新型方法。本申请发明者进行努力研究，结果发现，通过在免疫分析时使聚氧乙烯烷基醚硫酸盐及聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯于反应体系内共存，可以抑制空白测定值的偏差从而空白测定值也降低，并且能够提高受检物质在低浓度区域中的测定精度，从而完成了本申请发明。即，本发明提供免疫分析方法，其包含使聚氧乙烯烷基醚硫酸盐及聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯于反应体系内共存。另外，本发明提供样本中标记蛋白质的测定方法，其通过上述本发明的免疫分析方法进行。并且，本发明提供使通过免疫分析得到的测定值稳定的方法，其包含在免疫分析方法中使聚氧乙烯烷基醚硫酸盐及聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸
3酯于反应体系内共存。并且，本发明提供免疫分析试剂，其包含聚氧乙烯烷基醚硫酸盐及聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯。并且，本发明提供免疫分析试剂盒，其包含上述本发明的免疫分析试剂。并且，本发明提供免疫分析用测定值稳定剂，其包含聚氧乙烯烷基醚硫酸盐及聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯。根据本发明，提供了在免疫分析中能够提高受检物质在低浓度区域中的测定精度的新型方法。根据本发明的方法，通过仅将规定的物质添加至反应体系中，特别是空白测定值的偏差(标准偏差)得到抑制，使测定值稳定。由此，即便在以前的免疫分析方法中难以测定的低浓度区域，测定值也获得显著差异，低浓度区域的测定精度得到提高。本发明对于样本中微量存在的物质的微量定量有利。
图1是表示本发明的实施例及比较例的免疫凝集法中测定试剂添加后的时间 (秒)和吸光度变化的关系的图。
具体实施例方式本发明的特征是，在聚氧乙烯烷基醚硫酸盐及聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯的存在下进行免疫分析。另外，本说明书中的％只要无特别说明，则为质量基准(W/V/。)。另外， “测定”的情况包括检出、定量及半定量。聚氧乙烯烷基醚硫酸盐如果是通常作为表面活性剂使用的聚氧乙烯烷基醚硫酸盐，则并无特别限定。烷基部分可以为直链也可以为支链，还可以包含1个以上的不饱和键。烷基部分也可以如烷氧基那样，为1个以上的碳被氧取代而成的惰性烷基(非活性烷基)。烷基中的一部分可以被芳基(苯基等)或卤素原子等取代。烷基部分的碳数并无特别限定，通常为广30，优选为5 20，更优选为1(Γ15。特别优选的烷基部分为饱和或者包含多个以下不饱和键的直链状碳链，其具体例子可以列举月桂基等。硫酸盐部分只要是1价以上的盐即可，其具体例子可以列举钠盐、钾盐等碱金属盐，钙盐、镁盐等碱土金属盐，铵盐、胺盐等，适合使用三乙醇胺盐和钠盐。聚氧乙烯烷基醚硫酸盐的分子中的氧乙烯单元的数量并无特别限定，通常为广10
左右ο聚氧乙烯烷基醚硫酸盐可以为单一组成，也可以为2种以上的混合物。聚氧乙烯烷基醚硫酸盐可以优选使用作为表面活性剂销售的市售品。聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯如果是通常作为表面活性剂使用的聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯，则并无特别限定。脂肪酸的烷基部分可以为直链也可以为支链，还可以包含1个以上的不饱和键。脂肪酸的烷基部分也可以如烷氧基那样，为1个以上的碳被氧取代而成的惰性烷基。烷基中的一部分可以被卤素原子等取代。烷基部分的碳数并无特别限定，通常为广30，优选为5 25，更优选为10 20。特别优选的烷基部分为饱和或者包含多个以下的不饱和键的直链或支链碳链，如果列举优选作为脂肪酸部分的具体例子，则可以列举油酸、硬脂酸、月桂酸、棕榈酸等。聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯的分子中的氧乙烯单元的数量并无特别限定，通常为广100左右，优选为5飞0左右。
聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯的组成可以为单一组成，也可以为2种以上的混合物。组成的具体例可以列举聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯和聚氧乙烯山梨糖醇酐单硬脂酸酯等，但并不限定于这些。聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯可以优选使用作为表面活性剂销售的市售品。对于聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯，HLB值为1(Γ20、数均分子量为100(Γ50000的
聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯的添加效果显著，且适合使用。本发明的分析方法中，只要在从抗原抗体反应开始至抗原抗体反应量的检出、定量结束为止的任一阶段，使聚氧乙烯烷基醚硫酸盐及聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯于反应体系内共存即可，优选在从抗原抗体反应开始至检出、定量为止的期间共存。因此，聚氧乙烯烷基醚硫酸盐及聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯可以优选在抗原抗体反应开始前或开始的同时添加到反应体系内。例如可以在稀释样本时添加，也可以在将抗体或者抗原和样本混合时添加。另外，可以使免疫分析所用的各种试剂事先含有聚氧乙烯烷基醚硫酸盐及聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯。例如可以使稀释样本的缓冲液、包含抗体或者抗原的试剂等中事先含有这些物质。在免疫凝集时，例如可以使包含固定(致敏)了抗体或者抗原的不溶性载体粒子(致敏粒子)的试剂含有聚氧乙烯烷基醚硫酸盐及聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯。另外，在进行B/F分离操作时，会失去在抗原抗体反应时共存的聚氧乙烯烷基醚硫酸盐及聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯，因此优选使用包含聚氧乙烯烷基醚硫酸盐及聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯的缓冲液作为洗涤液等适当地将聚氧乙烯烷基醚硫酸盐及聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯追加至反应体系内。反应体系内的聚氧乙烯烷基醚硫酸盐的浓度优选为0 . 00 0 59Γ0. 25%，更优选为0.01259Γ0.25%。另外，反应体系内的聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯的浓度优选为 0 . 00 0 59Π). 25%，更优选为0 . 00 0 59Π). 005%。在免疫分析试剂中事先含有聚氧乙烯烷基醚硫酸盐及聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯时，它们能够以在反应体系内的浓度达到上述浓度的方式在免疫分析试剂中含有。例如在包含致敏粒子的试剂中含有聚氧乙烯烷基醚硫酸盐及聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯时，聚氧乙烯烷基醚硫酸盐在试剂中的浓度可以优选设定为0. 0019Γ0. 5%、更优选设定为0. 0259Γ0. 5%，并且聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯在试剂中的浓度可以优选设定为0. 0019Γ0. 5%、更优选设定为0. 0019Γ0. 01%。免疫分析的方法本身为众所周知。本发明的免疫分析方法的形态可以为公知的任意免疫分析方法，其中优选免疫凝集法，特别优选使用乳胶粒子作为不溶性载体粒子的乳胶凝集法。免疫凝集法中检出致敏粒子的凝集的方法为众所周知，本发明中也可以使用检出因致敏粒子的凝集所引起的吸光度或光散射等的方法等众所周知的方法。例如可以列举免疫比浊法(TIA法、乳胶凝集法)、比色法、RPLA法、CL法及免疫色谱法等，适合使用灵敏度高且定量精度佳的比浊法及比色法。通过免疫凝集法进行免疫分析时，所用的不溶性载体粒子并无特别限定，可以为以前在免疫分析试剂中使用的众所周知的不溶性载体粒子。例如可以列举聚乙烯、聚苯乙烯等乳胶粒子，氧化铝粒子、二氧化硅粒子、金胶体、磁性粒子等粒子。这些不溶性载体中， 适合使用乳胶粒子，特别适合使用聚苯乙烯乳胶粒子。乳胶粒子的尺寸并无特别限定，粒径优选为 30nnT600nm。本发明中免疫分析的测定对象的具体例子可以列举C_反应蛋白(CRP)、铁蛋白
5(FER)、肌红蛋白(Mb)、前列腺特异性抗原(PSA)、β-2微球蛋白(BMG)、巨蛋白、足萼蛋白等标记蛋白质，及大肠杆菌等细菌，流感病毒(influenza virus)、诺如病毒(Norovirus)、RS 病毒等病毒，以及针对它们的抗体。优选的测定对象为成为各种疾病等的标记的标记蛋白质。免疫分析所用的样本只要是可以包含测定对象的样本，则并无特别限定，优选血液、血清、血浆、尿、便、唾液、组织液、脑脊髓液、痰液等体液等或者其稀释物，更优选血液、 血清、血浆、尿、便、脑脊髓液或它们的稀释物。免疫分析所用的空白样品只要是可以包含测定对象的空白样品，则并无特别限定，优选纯化水、生理盐水液、缓冲液、阴性样本或其稀释物。免疫凝集法本身为众所周知，这里无须说明，如果以测定受检样品中的抗原的情况为例进行简单说明，则在上述不溶性载体粒子上，将与应测定的抗原进行抗原抗体反应的抗体或其抗原结合片段加以固定。固定的方法也为众所周知，其通过物理吸附或共价键合等众所周知的方法来进行。当将所得的致敏粒子的悬浮液和受检样品混合时，致敏粒子因受检样品中所含的应测定的抗原而凝集，使致敏粒子悬浮液的吸光度发生变化。测定该吸光度的变化量(终点(endpoint)法)或者变化率(比率法)。准备以各种已知浓度包含应测定的抗原的多个标准样品，通过上述方法对这些样品测定吸光度的变化量或变化率。 将标准样品中应测定的抗原的浓度绘制成横轴，将所测定的吸光度的变化量或变化率绘制成纵轴，而画出校准曲线。也可以通过用相同的方法对未知的受检样品测定吸光度的变化量或变化率，并将测定结果应用于上述校准曲线，对受检样品中的抗原进行定量。另外，市售有各种进行上述免疫凝集法的自动装置，可以使用市售的免疫凝集法用自动装置容易、 简便地进行测定。如下述实施例所记载的，在聚氧乙烯烷基醚硫酸盐及聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯的共存下进行免疫分析时，空白及低浓度样品(下述实施例中为0.005mg/dL的CRP)的测定值的变动得以抑制和稳定。即，测定值的标准偏差变小。结果由于空白和低浓度样品之间的测定值的显著差异增大，因此例如对于CRP的情况，在Omg/dL、. 005mg/dL左右的低浓度区域的分析精度提高。所以，本发明的分析方法对于受检物质的微量测定非常有利。上述事先含有聚氧乙烯烷基醚硫酸盐及聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯的用于免疫分析的各种试剂可以作为上述本发明的方法中所用的免疫分析试剂提供。本发明的免疫分析试剂中包含免疫分析中所用的各种试剂类。例如可以列举样本稀释液、抗体/抗原稀释液、固相抗体/抗原、致敏粒子悬浮液、洗涤液、酶液、基质液、校准曲线制作用受检物质标准液等。本发明的免疫分析试剂优选乳胶凝集试剂等免疫凝集试剂，具体优选包含致敏粒子的试剂。免疫分析试剂中的致敏粒子的浓度并无特别限定，优选为Ο.ΟΡ/ΓΟ.5%。致敏粒子悬浮液中的抗体量及抗原量可以如通常方法所述，并无特别限定，例如为抗体致敏乳胶时抗体量在乳胶悬浮液中优选设定为0. 01mg/m广2. Omg/mL。本发明的免疫分析试剂中的聚氧乙烯烷基醚硫酸盐的浓度优选为 0 . 00 0 59Π). 25%、更优选为0. 01259Π). 25%。免疫分析试剂中的聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯的浓度优选为0 . 00 0 59Γ0. 25%，更优选为0 . 0 0 0 59Γ0. 005%。另外，聚氧乙烯烷基醚硫酸盐及聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯也可以作为用于免疫分析的测定值稳定剂提供。这里所说的测定值的稳定是指如上所述减小测定值的标准偏差。将该稳定剂添加在用于免疫分析的各种试剂中而进行优选使用。上述本发明的免疫分析试剂可以和不包含聚氧乙烯烷基醚硫酸盐及聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯的通常试剂类等共同作为免疫分析试剂盒提供。或者，本发明的免疫分析试剂盒可以是将通常的免疫分析试剂类和上述本发明的测定值稳定剂加以组合的试剂
品.ο
实施例以下，根据实施例更具体地对本发明进行说明。但本发明并不限定于下述实施例。实施例1 (使用试剂)
使用针对C-反应蛋白(CRP)、铁蛋白(FER)及肌红蛋白(Mb)的抗体，如以下所述通过免疫凝集法制备测定试剂。将对ImL平均粒径为190nm的聚苯乙烯乳胶悬浮液担载0. 08mg的抗CRP抗体、抗 FER抗体及抗Mb抗体中的任意一种所形成的致敏粒子悬浮在缓冲液(Tris、pH8.0)中，使其浓度达到0. 1%，从而制备乳胶悬浮液。在上述乳胶悬浮液中添加如下所述的表面活性剂，制备各蛋白质(CRP、FER、Mb) 的测定试剂。比较例使用未添加上述表面活性剂成分的乳胶悬浮液。测定试剂(实施例) 乳胶悬浮液
+表面活性剂10. 1%
表面活性剂20. 005%。测定试剂(比较例) 仅乳胶悬浮液。表面活性剂1
聚氧乙烯烷基醚硫酸三乙醇胺(花王制造的“工7 20T”(商品名)、聚氧乙烯月桂基醚硫酸三乙醇胺为主体) 表面活性剂2:
聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯(和光纯药制造的“Tween 80”(商品名)、聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯为主体、HLB=15、数均分子量5000)。(使用自动分析装置进行的测定)
自动分析装置是使用日立7180型自动分析装置通过终点法进行自动测定。使用所述的测定试剂进行共计10次的生理盐水(空白)样品液的测定。在2.4yL 样品液中添加120 μ L缓冲液(扑化、？!18.5)，将该混合液于371下搅拌混合。放置5分钟后，添加120 μ L上述所制备的测定试剂，再于37°C下搅拌混合。将约5分钟的凝集反应测定为吸光度变化量，并算出标准偏差。(结果)
将测定结果表示于下述表1中。另外，图1表示将测定试剂刚添加后的吸光度设为 0. OOOAbs时的经过时间内的吸光度变化。
[表 1]
权利要求
1.免疫分析方法，其包含使聚氧乙烯烷基醚硫酸盐及聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯于反应体系内共存。
2.根据权利要求1所述的免疫分析方法，其中所述聚氧乙烯烷基醚硫酸盐的浓度为 0.0005% 0· 25%。
3.根据权利要求1或2所述的免疫分析方法，其中所述聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯的浓度为 0 . 00 0 59Γ0. 005%。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的免疫分析方法，其中所述聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯的HLB值为1(Γ20。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的免疫分析方法，其中所述聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯的数均分子量为100(Γ50000。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的免疫分析方法，其中所述聚氧乙烯烷基醚硫酸盐为聚氧乙烯月桂基醚硫酸三乙醇胺。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的免疫分析方法，其中所述聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯为聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的免疫分析方法，其为免疫凝集法。
9.根据权利要求9所述的免疫分析方法，其为乳胶凝集法。
10.样本中的标记蛋白质测定方法，其通过根据权利要求1至9中任一项所述的方法进行。
11.使通过免疫分析得到的测定值稳定的方法，其包含在免疫分析方法中使聚氧乙烯烷基醚硫酸盐及聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯于反应体系内共存。
12.免疫分析试剂，其包含聚氧乙烯烷基醚硫酸盐及聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯。
13.根据权利要求12所述的免疫分析试剂，其中所述聚氧乙烯烷基醚硫酸盐的浓度为 0.0005% 0· 25%。
14.根据权利要求12或13所述的免疫分析试剂，其中所述聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯的浓度为0 . 00 0 59Γ0. 005%。
15.免疫分析试剂盒，其包含根据权利要求12至14中任一项所述的免疫分析试剂。
16.免疫分析用测定值稳定剂，其包含聚氧乙烯烷基醚硫酸盐及聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯。
17.根据权利要求16所述的测定值稳定剂，其为添加于免疫分析试剂中的形式。
全文摘要
提供能够使免疫分析法中的测定区域扩大的新型方法。本发明的免疫分析方法包含使聚氧乙烯烷基醚硫酸盐及聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯于反应体系内共存。通过本发明的方法，特别是空白测定值的偏差(标准偏差)得以抑制，测定值稳定。由此，即便是在以前的免疫分析方法中难以测定的低浓度区域，测定值也能获得显著差异，从而提高低浓度区域的测定精度。
文档编号G01N33/545GK102369441SQ20108001448
公开日2012年3月7日 申请日期2010年3月30日 优先权日2009年3月31日
发明者加纳 M. 申请人:电化生研株式会社