专利名称：作为氧化应激标志物的gp91phox的体外检测法的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于检测生物液体中的gp91ph°x蛋白的非酶促的体外方法，所述gp9Iphox蛋白作为NADPH氧化酶激活以及氧化应激的标志物。
背景技术：
活性氧(ROS)是小的高度反应性的分子，其存在于人类和动物体内并源于氧。ROS能够通过与DNA、蛋白质和脂质分子反应而改变细胞的功能，其通常作为不同代谢途径的副产物存在于生物系统中。它们还在细胞信号转导和免疫系统细胞活性的调节中具有关键作用。氧化应激(oxidative stress)定义为就可用的细胞抗氧化电位而言，ROS的生产与存在之间的严重失衡。其能够导致一系列生理破坏并由此能够造成病症的发作。潜 在地，氧化应激可以牵涉并破坏任何细胞成分，例如DNA、碳水化合物和蛋白质。有多种代谢疾病的特征都在于存在明显的氧化应激，其中有糖尿病、高胆固醇血症、高脂血症和心血管疾病、例如高血压、动脉粥样硬化、心脏肥大和心肌梗塞。在败血病和具有强炎性成分的疾病例如类风湿性关节炎中也检测到了高水平的氧化应激(Cave A. C. et al. , Antiox.Redox Signal. (2006)8 :691-728 ；Valko M. et al. , Int. J. Biochem. Cell. Biol. (2007)39:44-84)。氧化应激本身是难以被抓住并在体内进行测定的现象。这是因为ROS的寿命非常短，并且不能在血液或组织中被检测。因此，只能通过间接方法来测定它们的水平，例如在细胞DNA或在氨基酸中检测它们的衍生物，但是细胞的ROS生产的这些副产物与实际的氧化应激之间的精确关联尚未被证明(Halliwell B. and Whiteman M. , Br. J. Pharmacol.(2004) 142 :231-255) 0通常使用的体外方法是通过使用荧光探针例如二氯荧光素二酯(DCFH)、双氢罗丹明(DHR)、鲁米诺和光泽精来检测R0S，但是其不能被转化为体内检测方法。脂质过氧化是相当复杂的过程，其产生数量差异巨大的多种不同的化合物。虽然如此，检测所产生的此类化合物仍然被认为是氧化应激的有用的指标。体内的氧化应激水平目前是通过EIA或ELISA法检测尿中的异前列烷来测定的(Wang Z. et al. ,Pharmacol. Exp. Ther. (1995)275 :94-100 ；US 6，620，800 ；US 5，700，654，US 5，891，622)或通过质谱法测定的(M. S. Lawson et al. , J. Biol. Chem. (1999)274 2441-2444)。在我们的体内，异前列烷是通过花生四烯酸(AA)的直接过氧化而产生的，无任何酶促过程的干预，因此被认为是体内过氧化的直接度量。在细胞生产ROS时，NADPH氧化酶发挥着关键作用，该酶是最初发现于吞噬细胞中的多亚基蛋白。NADPH氧化酶包含5个亚基，其中的催化亚基是被称作Nox的膜蛋白(已知其有5种不同亚型)。在免疫吞噬性细胞、例如嗜中性粒细胞和巨噬细胞中存在的Nox亚型是Nox2，其也被称作gp91ph°x，在这些细胞中，其负责超氧阴离子的产生，继而产生氧过氧化物(oxygen peroxide)，这会允许这些细胞在感染过程中杀死细菌细胞。当gp91ph°x主要与该酶的第二个膜亚基即P22ph°x相互作用时，吞噬性NADPH氧化酶被激活，随后，通常存在于细胞质中的其余亚基P47ph°x、p67phox和Racl-2被募集于质膜上以重构工作酶(SkppardFR et al. ，J Leukoc Biol(2005)78 :1025-1042)。文献中已经建立了 ROS在调节血管舒张、在动脉粥样硬化和炎性过程中的作用(Dworakowsky R. et al. , Pharmacol. Reports (2008) 60 :21-28 ；Martino F. et al.，Pediatrics(2008) 122 e648-e655 ；Bedard K and Krause KH, Physiol rev (2007)87 245 313 ；Valko M et al. , Int J Biochem Cell Biol (2007) 39 :44-84 ；Bauerova K andBezek S. (1999) Gen Physiol. Biophys. 18 (spec, issue) 15-2) !Griffiths H. R. (2008)Autoimmun. Rev 7 :544-449 ;Carnevale R. et al (2007)FASEB J. 21 :927-934 ;NewsholmeP. et al. (2007) J. Physiol. 583 :9-24)。举例而言，在高胆固醇血症中，血液中过量的LDL(低密度脂蛋白)的存在引起血小板和血管壁中NADPH氧化酶的增加，显著地促成泡沫细胞的浸润以及粥样斑的形成。在文献中从来没见过有人测定NADPH氧化酶的激活。事实上，已经在细胞(培养的或非培养的)和组织中检测到了 gp9Iphox的存在(Vaziri et al.，Biochim. Biophys.Acta (2005) 1723 :321-327 ；ffolfort et al. , Am. J.Physiol.Heart Circ Physiol.(2008)294 :H2619_H2626 ；Paravicini T. M. et al. ,Circ. Res. (2002)91 :54-61 ；Morawietzet al. , Biochem. Biophys. Res Commun. (2001)285:1130-1135 ；Samuelson D.J. et al.,J. Leukoc Biol. (2001) 69 :161-168 ；Anrather J. et al. , J. Biol. Chem. (2006) 281 5657-5667 ；Gandhi M. S. et al.，J. Cardiovasc Pharmacol. (2008)52 :245-252)。在上文提及的例子中，通过PCR方法、流式细胞术或免疫印迹定量测定该酶的亚基、特别是催化亚基gp91ph°x的存在，或通过测定某些条件下上清液或细胞培养物中所产生的ROS的水平来间接测试该酶的酶活性，被认为是NADPH活性的指示(Cross A. R.，Ericson R. ff. , and Curnutte J. T. , Biochem. J. (1999)341 :251-255 ;Teufelhofer 0.etal.，Toxicol. Sci. (2003)76 :376-383)。无论如何，上述方法是复杂的、精致的并且需要专门的和专业的人员来实施，其仅给出样品中是否存在NADPH氧化酶，但不给出关于NADPH氧化酶的激活的信息，这在临床环境中不是特别有用的。另外，这些方法耗时并且对于分析大量样品不是非常有用的。例如，分析血小板中gp9 Iphox的存在，需要在非常短的时间、即3个小时内从样品中提取这些血液成分。此外，血小板的操作是非常错综复杂的，因为要求它们必须不被激活或破坏，以获得可靠的数据。WO 2007/047796仅提供了一般性的公开内容，其不包含关于“血清中gp91ph°x的存在是NADPH氧化酶激活的指标”这一事实的任何数据或暗示。因此，到目前为止，仍不可能将患者中的ROS之产生(以及氧化应激)与他/她的体内NADPH氧化酶的实际激活关联起来。另外，关于细胞中的血小板NADPH氧化酶激活之后的步骤以及激活之后酶本身的状态知之甚少。在如上文提及的Carnevale R.等人的论文中发现在离体状态下，分离自高胆固醇血受试者的血小板能够产生ROS并且能够通过NADPH氧化酶有效氧化LDL，而来自遗传性缺乏gP91ph°x的患者的血小板则不能。最后，MartinoF. et al. , Pediatrics (2008) 122 :e648_e655 发现来自高胆固酉享血儿科患者的血小板中gp91ph°x的存在与尿异前列烷水平之间的弱相关性。如本领域技术人员将知晓的那样，简单地检测酶水平的变化不是酶活性的度量，因为后者会受到超出酶(或酶亚基)水平的简单增加之外的很多因素的影响。因此，可以负责任地讲直至目前为止，没有人能够发现简单且直接的在体内或在培养的细胞系统中测定NADPH氧化酶的实际激活的方法。另外，到目前为止，没有人能够建立ROS产生过程中的关键性酶例如NADPH氧化酶的实际激活与氧化应激的参数指示例如尿异前列烷水平之间的体内的强烈且显著的关系。因此，目前不可能在体内或在细胞中监视NADPH氧化酶的激活并将其作为直接的、简单的和可靠的用于测定患者或培养的细胞系统中的氧化应激水平的方法。同样，如果可以通过简单的、不昂贵的分析方法例如ELISA方法，使用诸如血浆或血清的起始样品而非细胞或活组织检查样品，来进行NADPH氧化酶激活的检测，将是非常有用的。
发明内容
本发明人现在出人意料地发现gp91ph°x蛋白存在于人类血清中；并且所述存在是NADPH氧化酶活性的可靠的指标，因为细胞NADPH氧化酶的激活水平与血清中gp91ph°x的存在显著相关。本发明人还发现NADPH激活水平显著影响尿异前列烷的浓度。因此，血清中gp9Iphox水平(表示为sgp91ph°x的)的检验也可被认为是身体氧化应激的有效度量。因此，本发明的一个方面是一种简单的、有效的且可靠的分析方法，其允许在体外检测血清中的gp91ph°x蛋白，其作为血小板中NADPH氧化酶激活的标志物，同时作为氧化应激的标志物，如以下实施例部分所示。特别地，本发明的方法允许检测血清和其它生物样品例如血浆和细胞培养上清液中的可溶性gp91ph°x，其作为NADPH氧化酶激活的有效度量。本发明的另一个方面是评价给定的治疗法的有效性，例如在败血病的情况下、在糖尿病患者的情况下或在高胆固醇血患者的情况下，其是通过检测生物样品例如血清或血浆中的gp91ph°x的水平，作为所述治疗过程中NADPH氧化酶激活及氧化应激的标志物。本发明的另一个方面是生物样品例如血清、血浆或细胞培养上清液中gp91ph°x或相应的肽片段用于检测细胞NADPH氧化酶激活和相关的氧化应激的激活的用途。本发明的另一个方面是对应于SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :3的肽以及相应的肽片段和包含肽序列，它们用作NADPH氧化酶激活的标志物。本发明的另一个方面是编码SEQ ID NO : I和SEQ ID NO :3的肽的多核苷酸序列，以及包含编码SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :3的肽的多核苷酸序列的转录和表达载体、cDNA和 RNA。本发明的另一个方面是针对gp91ph°x蛋白及其SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :3的相应的肽片段的多克隆和单克隆抗体，所述抗体用于检测生物液体中的作为NADPH氧化酶激活和氧化应激标志物的所述蛋白的存在。本发明的另一方面是用于检测和测定在血清和不同的生物样品中释放的、作为NADPH氧化酶激活的标志物的gp91ph°x蛋白、尤其是其细胞外部分的试剂盒。本发明的试剂盒在用于临床目的(例如心血管疾病、代谢障碍疾病、炎症和败血病)的氧化应激控制领域中是特别有用的。
另外的方面是针对SEQ ID NO :3的肽的单克隆抗体，其是来自于2010年6月10日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)的杂交瘤SD-6311。其它方面将通过以下详细描述和随附的权利要求书变得明显。
图I :血清中的gp91ph°x的检测
图板A :为了证明gp91ph°x能够作为可溶性蛋白在血液中被检测，免疫沉淀来自3位健康人员的血清。使用针对人 gp91ph°x 的肽 QTAESLAVHNITVCEQKISEWGKIKECPIPQFAGNPPMTffKffIV GPMFLYLCERLVRFffR(SEQ ID NO:2)的单克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology,Inc.)将样品1、3和5进行免疫沉淀。使用针对山羊IgG的非特异性抗体将样品2、4和6进行沉淀。标示了条带的分子量。图板B :图板A的免疫沉淀的定量分析。使用程序“NIH IMAGE I. 63”通过光密度测定法进行gp91ph°x的定量分析。图2 gp9Iphox的水平在高胆固醇血患者中升高。图板A :通过western印迹分析法定量分析临床研究中登记的30位高胆固醇血患者(HC)和20位健康受试者(HS)的血清中的gp91ph°x水平。使用程序“NIH IMAGE 1.63”通过光密度测定法进行gp91ph°x的定量分析。图板B :来自图板A的两个组中的10位高胆固醇血患者和10位健康受试者的代表性 Western 印迹分析。使用针对人 gp91ph°x 的肽 QTAESLAVHNITVCEQKISEWGKIKECPIPQFAGNPPMTffKffIV GPMFLYLCERLVRFffR(SEQ ID NO 2)的单克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology,Inc.)进行该分析。图板C :使用如图板A和B中所使用的相同的单克隆抗体通过细胞荧光测定法检测血小板中gP91ph°x水平的分布的统计学分析。图板D :图板A、B和C中的30位高胆固醇血患者和20位健康受试者中检测的尿异前列烷水平的统计学分析。图3 :闻胆固醇血患者的临床研究图板A :使用本发明的兔子多克隆抗体，通过ELISA测定的HC患者的sgp91ph°x血清水平，其中所述HC患者随机分为以阿托伐他汀(IOmg/天)进行30天治疗并进行合理膳食治疗，或者仅进行合理膳食治疗。图板B :使用本发明的单克隆抗体(来自杂交瘤SD-6311)通过ELISA测定基线时以及治疗30天后的图板A的相同样品的sgp91ph°x血清水平。图板C :在基线时和治疗30天之后，通过流式细胞术测定的来自两个治疗组的血小板表面的gp91ph°x的存在。图板D :在基线时和治疗30天之后，两个治疗组中的尿异前列烷水平。图4 :通过使用一抗和本发明的对应的免疫肽获得的ELISA标准曲线。图板A :通过使用 64pg/ml、32pg/ml、16pg/ml、8pg/ml 的来自 gp91ph°x 蛋白序列的免疫肽LNFARKRIKNPEGGLC(SEQ ID NO 1)和本发明的兔子多克隆抗体获得的ELISA标准曲线。图板B :通过使用 64pg/ml、32pg/ml、16pg/ml 和 8pg/ml 的来自 gp91ph°x 蛋白序列的免疫肽 AERIVRGQTAESLAVHNITVCEQKISEWGKIKECPIPQFAGNPPM(SEQ ID NO :3)和来自杂交瘤SD-6311的本发明的单克隆抗体获得的ELISA标准曲线。图5 :特异性的血小板NADPH氧化酶激活与其以可溶性形式在上清液和血清中的存在相关联图板A :通过测定在以花生四烯酸(AA)刺激以及在存在特异性抑制剂夹竹桃麻素(apocynin)、gp91ds_tat和药物阿托伐他汀的情况下的ROS产生而测定血小板NADPH氧化酶激活(n = 5 广 p < 0. 001)。图板B :以AA激活以及在存在特异性抑制剂夹竹桃 麻素、gp91ds-tat和药物阿托伐他汀的情况下，来自血小板的血小板膜gp91ph°x的western印迹。使用了本发明的单克隆抗体。图板C :以AA激活以及在存在特异性抑制剂夹竹桃麻素、gp91ds-tat和药物阿托伐他汀的情况下，使用本发明的单克隆抗体，通过ELISA测验法测定的血小板的上清液中的 gp9Iphox 水平(n = 5 ;* p < 0. 001)。图板D :血清、AA刺激的和未刺激的血小板、醋酸佛波豆寇酯(PMA)刺激的和未刺激的PMN以及脂多糖(LPS)刺激和未刺激的淋巴细胞/单核细胞中的sgp91ph°x(n = 5 ；*p<0.001)。样品与上文所述的相同。发明详述本发明基于以下意料不到的发现在血小板酶类NADPH氧化酶激活之后，其催化亚基，蛋白gp91ph°x(图I)被释放到血流中。此外，在来自患有代谢障碍疾病例如高胆固醇血症的患者的血清样品中可以检测到高水平的可溶性gp91ph°x(以下称作"sgp91ph°x")(图I和2A-C)。如本文使用的"可溶性gP91ph°x "或"sgp9 Iphox "或"血清gp9 Iphox"或"血清sgp91ph°x"，意思是在血小板NADPH氧化酶被激活之后释放到血流中并且可以通过使用本发明的多克隆和/或单克隆抗体以极大的特异性被检测的gp91ph°x肽，如下文所解释。另外，所述患者中血小板NADPH氧化酶的激活和抑制(通过血清中的sgp91ph°x的水平而测定)显示出与尿异前列烷水平的良好相关性，后者目前被认为与生物的氧化应激水平严格相关，如下文实施例部分所描述。但是，血小板膜上检测到gp9 Iphox水平的存在却证明不是实际的NADPH氧化酶激活的指示，也不与尿异前列烷水平强烈相关，因此不与身体内的氧化应激相关(图5)。本发明人获得的结果(如实施例I和图2D和3D所示)以及血清"sgp91ph°x"水平与尿异前列烷水平之间的良好相关性(Rs = 0. 77, p < 0. 001，通过单变量分析所计算)，首次证明了 NADPH氧化酶的酶活性能够直接影响人类中的尿异前列烷水平。另一方面，所观察到的血小板膜上gp91ph°x的存在(通过细胞荧光测定法测定)与尿异前列烷之间的低相关性(Rs = 0. 5，p = 0. 05)仅仅确认了异前列烷水平依赖于sgp9Iphox活性并且不依赖于血小板上存在的sgp91ph°x的量。由于已经知道在血液吞噬性细胞(例如嗜中性粒细胞)中存在着大量的NADPH氧化酶，所以本发明人测定了在体外在适当的刺激之后，由单核细胞、嗜中性粒细胞和血小板释放的gp91ph°x的水平(图5)。当分别以花生四烯酸(5C-D)、醋酸佛波豆寇酯或脂多糖(5D)刺激血小板、多形核细胞和淋巴细胞/单核细胞中的NADPH氧化酶时，该酶的激活引起细胞的gp91ph°x释放进入细胞培养基，然后其作为sgp91ph°x(可溶性gp91ph°x)被测定。同样，血小板细胞膜的western印迹分析(图5B)显示在NADPH氧化酶刺激之后，膜gp91ph°x的水平降低而释放到细胞上清液中的sgp91ph°x的浓度显著升高。平行地，通过使用两种不同的特异性的氧化酶抑制剂即肽91phox ds-tat (Rey FE et al. , Circ Res (2001) 89 408-414 和 Griendling KK et al. , J Cardiovasc Pharmacol (2007) 50 :9_16)和夹竹桃麻素(Griendling KK等人(2007)，见上文)确认了血小板中由于NADPH氧化酶被花生四烯酸激活而特异性驱动而产生ROS (3A)。图3C显示了血小板上清液中sgp91ph°x的对应水平如清晰所见，NADPH氧化酶的特异性抑制也引起释放到细胞培养基中的sgp91ph°x的水平降低。因此，本发明的方法允许检测人或动物、优选哺乳动物、更优选人体 内NADPH氧化酶的激活水平，其是通过简单和迅速的ELISA测验法，其中使用针对所述酶的催化亚基的多克隆或单克隆的专利抗体，这是由于以下未预料到的发现由于其激活，血小板NADPH氧化酶将sgp9 lph°x释放进入血流。另外，可溶性gp91ph°x的存在与尿异前列烷水平之间显示出的良好的相关性允许本发明的方法用作一种测验法的选择，用于分析动物、优选哺乳动物、更优选人中的氧化应激。术语“血浆”意思是通过离心(通常是在3000rpm) —定量的柠檬酸钠抗凝化血液而获得的生物样品。术语“血清”意思是凝固血液样品的上清液，通常在试管中于37°C水浴中保存30分钟，然后在3000rpm离心。术语“上清液”意思是其中曾生长着细胞、通过例如过滤离心除掉细胞之后的液体培养基。这些定义和方法是本领域技术人员已知的。本发明的方法特别涉及检测血清和其它无细胞生物样品、例如血浆和来自细胞培养物的上清液(不含分子量大于200kDa的蛋白)中的"sgp91ph°x"，例如通过传统的过滤方法或凝胶过滤进行。在优选实施方式中，本发明涉及通过ELISA方法检测gp9 Iphox蛋白，其中使用来自杂交瘤SD-6311的专利单克隆抗体，该抗体针对高度免疫原性肽AERIVRGQTAESLAVHNITVCEQKISEWGKIKECPIPQFAGNPPM(对应于 gp91ph°x 序列 224-268 ；SEQ ID NO :3)。选择该肽是因为其特别的免疫原性，以及，其是gp91ph°x蛋白的细胞外结构域。所述抗体是这样获得的以纯化的SEQ ID NO 3的合成肽注射小鼠，然后，反应性最强的动物的脾脏用于获得杂交瘤，并根据本领域技术人员已知的常规方法筛选和选择所述杂交瘤。所选择的杂交瘤于2010年6月10日保藏于ATCC，保藏号为SD-6311。或者，可以使用针对肽LNFARKRIKNPEGGLC(SEQ ID NO 1)的专利兔子多克隆抗体。该序列对应于人gp91ph°x的氨基酸152-168,该序列处于蛋白的通常暴露于细胞膜的外侧的部分之中。该抗体是这样获得的根据本领域技术人员已知的方法以缀合于钥孔血蓝蛋白(KLH)的SEQ ID NO : I的肽注射兔子。本发明的方法可用于下列领域代谢障碍类型的病症、例如糖尿病、高胆固醇血症和高脂血症以及心血管疾病、例如高血压、动脉粥样硬化、心脏肥大和心肌梗塞中的氧化应激控制。本方法也可用于败血病领域，以及特征在于重要的炎性成分的病况，例如类风湿性关节炎。本发明的方法也可用于间接地监控针对上述疾病之一的治疗法的有效性(CaveA. C. et al.，Antiox. Redox Signal. (2006)8 :691-728 ；Valko M. et al.，Int. J. Biochem.Cell. Biol. (2007)39:44-84)。这可以通过测定由治疗法的有益效应所诱导的病症中的氧化应激的降低来进行。本发明的方法包括以下步骤(i)向获自全血的无血小板的生物液体中加入针对gp91ph°x的抗体，优选为针对源自其序列的一个肽的抗体。优选地，所述肽是合成肽，例如，具有SEQ ID NO :1的序列的肽或具有SEQ ID NO : 3的序列的肽或其对应的较大的肽；(ii)检测抗体/gp91ph°x复合物或抗体/gp91ph°x肽复合物的形成。优选地，在步骤(i)和(ii)之后还有以下另外步骤(iii)通过使用gP91ph°x或对应肽的标准物制备物、优选用于引发抗体的相同肽的 制备物构建校正曲线；和(iv)使用步骤(ii)中获得的结果和步骤(iii)中获得的校正曲线计算测试样品中存在的sgp91ph°x或其肽的浓度。在优选实施方式中，本发明的方法提供了通过使用免疫沉淀然后通过SDS-PAGE和Western印迹来特异性检测血清中的sgp91ph°x蛋白的存在和数量。所述的本发明的优选实施方式包括以下步骤(i)以针对gP91ph°x的特异性单克隆或多克隆抗体温育生物液体样品，例如血清；(ii)回收步骤⑴中形成的抗体/gp91ph°x复合物；(iii)通过SDS-PAGE和Western印迹分析由此获得的复合物。在另一个实施方式中，本发明的方法提供了 ELISA技术的用途并且包括以下步骤——将所述血清样品与针对gp91ph°x或其对应肽的单克隆或多克隆捕获抗体(一抗)、优选针对SEQ ID NO :1的肽或SEQ ID NO :3的肽或包含所述序列的较长的肽序列的抗体接触；——与过氧化物酶缀合的二抗一起温育；——通过与足够的底物温育来显色；——使用分光计读取所产生的颜色；和——通过使用浓度渐增的用于引发一抗的gp91ph°x或肽所获得的校正曲线来计算结果。该方法的优点在于其使用的简易性，因为其是在无血小板的液体中进行的，并且其可以以简单的ELISA方法实施，无需操作人员的特别培训，并且无需昂贵的工作设备。另外，由于本发明人所作出的发现即“循环的血小板中的激活的NADPH氧化酶引起sgp91ph°x的释放”，以及由于所观察到和证明的该释放与尿异前列烷水平之间的相关性，本发明的方法是首创性的，并且是目前唯一的能够直接测定氧化应激水平的分析方法。因此，本发明的方法对于研究一些代谢障碍疾病(例如糖尿病、高血糖症、肥胖症、高胆固醇血症和高甘油三酯血症)、败血病、炎性疾病(例如类风湿性关节炎)、慢性感染、以及心血管疾病(例如高血压、动脉粥样硬化、心脏肥大和心肌梗塞)中的氧化应激的变化是特别有用的。以下实施例被认为是解释本发明的，不应该被理解为限制其范围。实施例实施例I :1 胆固醇血患者中的临床研究本临床研究得到University of Rome" La Sapienza;/的伦理委员会的批准。患者和棑除标准本研究在30位患有高胆固醇血的患者(16位男性和14位女性受试者)中进行，其中高胆固醇血定义为LDL胆固醇水平高于200mg/dl，年龄为52±4岁。排除标准是肾功能不全、严重肾病(血清肌酸酐水平> 2. 5mg/dl)、糖尿病、动脉高血压、心肌梗塞或其它动脉粥样化血栓形成病况的存在、任何自身免疫疾病、癌症、最近或正在发生的感染。此外，服用非留族抗炎药物(NSAID)、胆固醇代谢干扰药物或维生素补 充物的患者也排除在本研究之外。所有的患者均为来自相同的地理区域的高加索人种。研究设计来自本研究中所包括的所有受试者的数据用于进行尿异前列烷水平与gp91ph°x水平(通过免疫沉淀的方法从血清样品中检测的)之间的比较性研究。高胆固醇血患者公开地随机分为接受30天的阿托伐他汀(IOmg/天)治疗并进行合理膳食，或者仅进行合理膳食治疗。在研究的这个阶段，患者经历根据ATPIII指南的低脂肪膳食，包括平均数量的大量营养素(macronutrient),其对应于来自脂肪的7%的能量和来自膳食的200mg/天的胆固醇。由不参与本研究的医生随机给出随机化数目，并且在整个研究阶段将钥匙保存在密封的信封中。根据基于随机数序列(casual number sequence)的程序进行随机化。参与本研究的医生不知晓治疗分配情况。首席研究者仅在研究末尾和完成实验室测试之后开启随机化列表。实验室测试在早晨8点至9点从空腹患者获取抗凝全血样品(5ml)。然后将样品在37°C放置I小时并在3000 X g离心10分钟以获得血清。将由此获得的上清液保存在_80°C直至用于测验。将晨尿样品的IOml等份试样冷冻保存于_80°C直至用于测验。使用Iml血清和IOml尿进行以下测验-使用商业酶学方法(DADE Behringer),在以磷酸鹤酸/MgCl2沉淀之后测定总
胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和HDL胆固醇；-根据Friedewald公式计算LDL胆固醇；-通过 Hoffman Sff et al. , J. Neurosci. Methods (1996) 68 :133-136 和在 Wang
Z. et al. , Pharmacol. Exp. Ther. (1995) 275 :94-100 中描述的经验证的 EIA 方法测定尿8-异前列腺素 F2 a (PGF2 a -III)。简而言之，在C-18SPE柱上提取IOml尿等份试样，通过加入放射活性示踪剂(氚标记的PGF2 a-III)验证回收情况。在氮气下干燥洗出液、重悬于Iml EIA洗脱缓冲液(Cayman Chemical)并使用针对 PGF2 a-III 的特异性 EIA 试剂盒(Cayman Chemical)进行测定。就回收和肌酸酐排泄校正PGF2 a-III的浓度，并表达为皮克每毫升(pg/ml)肌酸酐。人血清中的检测对于SDS-PAGE和western印迹分析,根据以下步骤制备待测样品I)免疫沉淀血清样品； 2)从样品中除掉不需要的抗体；3)以针对gp91ph°x的特异性单克隆或多克隆抗体温育步骤2)的样品；4)回收步骤3)中形成的抗体/gp9 Iphox ；5)通过SDS-PAGE和western印迹分析步骤4)中获得的样品。按照如下描述免疫沉淀人血清gp91ph°x。以来自Santa Cruz Biotechnology, Inc.
(目录号sc-74514)的针对gp91ph°x的单克隆抗体在4°C过夜温育血清样品，该抗体识别蛋白肽 QTAESLAVHNITVCEQKISEWGKIKECPIPQFAGNPPMTWKWIV GPMFLYLCERLVRFffR (SEQ ID NO:2)，该肽对应于人肽的氨基酸序列231-290。该方法的步骤2)如下进行。以IX PBS (磷酸盐缓冲盐水)洗涤琼脂糖缀合的蛋白G (code 17-6002-35GE Healthcare) 3 次通过将 Iml 缓冲液加入至 IOOu I 中并在 12，OOOg离心20分钟而进行。弃掉上清液，将沉淀物与500 的PBS/BSA溶液(BSA =牛血清白蛋白)一起温育。将步骤I)中制备的200ml免疫沉淀的血清与800 u IRIPA缓冲液(SigmaChemicals)和50 琼脂糖缀合的蛋白G在4°C 一起温育I小时，恒速搅拌。然后将样品在12，OOOg离心20分钟。由此制备的上清液不含不想要的抗体，并用于分离免疫复合物(步骤3)。向500 ill该上清液中加入25 u I如上所述的针对gp91ph°x的特异性单克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology),并在4°C温育I小时,恒速搅拌。按照如下描述制备对照样品。a)通过将10 U I同型抗体加入至500 U I样品而制备第一对照样品；b)第二对照样品仅含上清液；c)通过将10 U I针对gp91ph°x的单克隆抗体加入至500 U I RIPA缓冲液中而制备
第三对照样品。通过将50 U I琼脂糖缀合的蛋白G加入到所有样品中并在4°C温育I小时而进行免疫复合物的沉淀。然后将样品在12，OOOg离心20分钟。以RIPA缓冲液洗涤沉淀物3次，以PBS洗漆I次,每次均在12，OOOg离心20分钟并弃上清。然后通过在ImmunoPure蛋白A缀合的树脂(Santa Cruz Biotechnology, Inc.)上进行亲和色谱而分离由此形成的免疫
复合物。将由此获得的样品在_20°C过夜储存，然后通过SDS-PAGE和免疫印迹法进行分析。使用Bradford测验法(FLUKA)测定蛋白浓度之后，将130 蛋白/样品重悬于30 yl含有2-巯基乙醇的Laemmli样品缓冲液中并煮沸5分钟，以使珠子从免疫复合物上分离。根据标准方法在10 %聚丙烯酰胺凝胶上通过电泳法分离由此溶解的样品。分离之后,根据本领域技术人员已知的标准程序将凝胶印至Immobilon(Biorad)膜，通过Ponceau-S red (Sigma Chemicals)使印迹膜显色,随后以IX洗漆缓冲液(4X洗漆缓冲液=NaCl 32g，KCl 8g, Trisl2, lg, 1000ml H2O ; IX 洗涤缓冲液250ml 4X 洗涤缓冲液，750ml H20,0. 5% Tween 20，白蛋白0. I %，pH7. 5)洗涤4次以脱色。最后，以IX洗涤缓冲液+5%白蛋白封闭该膜。以洗涤缓冲液洗涤5分钟、洗涤5次之后，以Santa Cruz的针对gp9Iphox的单克隆抗体(2 y g/ml)在4°C过夜温育该膜。以洗涤缓冲液再洗涤5次(每次10分钟)以后，将膜与经2 y g/ Ul辣根过氧化物酶缀合的针对小鼠IgG的多克隆山羊二抗(山羊抗小鼠IgG-HRP ；Santa Cruz)在室温温育I小时。温育之后，再次以洗涤缓冲液洗涤该膜5次，然后在暗室中暴露于4ml ECL (2ml氧过氧化物+2ml鲁米诺/增强剂；Biorad)3分钟。最后,将膜(membrane)与化学发光膜(chemiluminescence film) (Sigma, 13x18cm)接触5分钟。然后通过本领域技术人员已知的方法使用Sigma显色和固定溶液使膜(film)显色。通过光密度测定法在NIHimage I. 62分析仪中评估所获得的条带，数值表示为任意单位(A. U.)。用于评估是否存在的来自全血■的血■小板制备物
为了从HC和HS患者获得富含血小板的血浆(PRP)，将样品在180g离心15分钟。为了避免白细胞污染，仅收集上面75%的PRP。将血小板沉淀物悬浮于pH为7. 4的HEPES缓冲液中(2xl08血小板/mL，除非另有指明)并根据待进行的实验类型进行差别化处理。用于评估是否存在的来自全血■的人多形核白细胞制备物通过葡聚糖增强沉降红细胞、Ficoll-Histopaque密度离心、以蒸懼水裂解剩余的红细胞并以Hank平衡盐溶液(HBSS)洗涤细胞(在不存在任何二价阳离子的情况下)，从获自健康志愿者(n = 5，健康受试者)的新鲜制备的EDTA血液分离多形核白细胞(PMN)。最后，将细胞沉淀物悬浮于Iml HBSS中并以10 ii M佛波醇12-肉豆蘧酸酯13-醋酸酯(PMA)刺激或不刺激。为了评估PMN中的sgp91ph°x，通过如上所述的ELISA方法分析上清液。用于评估是否存在的来自全血■的淋巴细胞/单核细胞制备物在肝素化管中收集血液样品(10IU/ml)。以聚蔗糖泛影酸钠溶液、(1.077g/ml密度和 280m0sm渗透性)(Lymphoprep ；Nycomed, Oslo, Norway)在 20°C、800g 离心来自健康志愿者(n = 5，健康受试者)的血液之后分离淋巴细胞/单核细胞。收集淋巴细胞/单核细胞的细胞层，在冷的补充了 I %胎牛血清和2mmol/l EDTA (Sigma-Aldrich, Milano, Italy)的磷酸盐缓冲盐水(PH7. 2)中洗涤细胞2次。以脂多糖(100ng/ml) (LPS)刺激或不刺激细胞悬浮液，通过如上所述的ELISA方法测定上清液中的sgp91含量。测定血小板上Rpgiete之表达为了测定血小板上的gp91ph°x之表达，将50iU稳定化的全血(见上文)分别与5 U I针对gp91ph°x的单克隆抗体(20 ii g/ml ； Santa Cruz)和5 针对CD61的PE缀合的单克隆抗体(Coulter) (20 u g/ml)温育 30 分钟，如 Martino F. et al.，PEDIATRICS (2008)(见上文)所描述。然后，将与针对gP91ph°x的单克隆抗体温育后的样品与针对小鼠的FITC缀合的IgG 二抗一起温育。温育之后，加入Iml IX PBS以进行细胞荧光分析。以相同的f/p比例的FITC与PE，以非特异性抗-小鼠IgG-FITC和IgGl-PE制备样品，进行同型对照。在预测试中确定所使用的单克隆抗体的足够浓度(未显示)。细胞荧光分析所有的样品均在稀释后15分钟之内进行分析。使用Epics XL-MCL细胞计数器(Coulter, Milan Italy)在525nm检测FITC荧光，在575nm检测PE荧光。所有的参数均以4-对数放大器归组。
通过突光补偿平衡光谱重叠，如预测试中所定义。使用Flow-Chek Fluorospheres检查细胞计数器设置情况。根据它们的CD61藻红蛋白荧光和前向散射特性通过逻辑门鉴定血小板和血小板-血小板聚集物。在每个受试者的第一同型对照中设定0. 5%的FITC阳性事件的阈值。测定了 50 000个事件之后自动停止分析。检验内和检验间变异系数分别是 I. 0%和 0. 2%。统计学分析类别变量表示为百分率，连续变量显示为平均 值土SD (标准偏差)。通过X 2检验测试类别变量的独立性。通过Student T检验进行HC患者与健康受试者之间的比较，在非均一变量的情况下，视需要使用非参数检验(Kolmogorov-Smirnov的(Z)检验)进行重复，如Levene检验所验证。应用Bonferroni校正以考虑由于多个测验造成的I型误差的增加。通过Pearson检验进行校正分析。P值> 0. 05被认为是统计上显著的。分析来自临床研究的数据以验证治疗对于gp91ph°x、总胆固醇和尿异前列烷的效应，以受试者(治疗组)之间的因子和内部因子(2个时间点治疗0天和治疗开始后30天)应用MANOVA分析。所考虑的协变量是两个组(通过膳食治疗和通过膳食+阿托伐他汀治疗)之间的年龄、性别和血压收缩压和舒张压方面的可能的偶然差异。使用Windows SPSS 13. 0软件进行统计分析。样本容量的计算-如上所述，临床研究中登记了所有那些符合所有的包括/排除标准的所有患者。通过用于独立组的双尾Student T检验计算对照患者的数目(n = 20),并考虑下列因素-待测的gp91ph°x中的临床相关差异(d)为彡100A. U.(任意单位)；——组间均一标准偏差SD = 50A. U.；——I型误差的概率a = 0.05，效力1-b = 0.90。这些假设得出样本容量计算为n = 19/组。关于治疗干预组，通过用于样品的双尾Student T检验计算最小样本容量，考虑下列因素——待测的gp91ph°x水平中的临床相关差异(d)为50A. U.；——组间均一标准偏差SD = 50A. U.；——I型误差的概率al/4 = 0.05，效力l_b = 0.90。这些假设得出样本容量计算为n = 8/组。结果图I中显示了通过以SDS-PAGE分离来自3个健康受试者血清的免疫沉淀物而获得的结果。在所分析的所有血清样品中，105kDa的条带均以背景存在。与此相反，91kDa的条带被针对gp91ph°x的SEQ ID NO 2的肽的Santa Cruz单克隆抗体特异性识别。表I中显示了参与临床研究的受试者的人口特征和临床特征以及所获得的实验室结果。涉及的两组患者即高胆固醇血患者(HC)和健康受试者(HS)未显示出年龄、性别、体重指数(BMI)、吸烟习惯、空腹葡萄糖水平和血液舒张压和收缩压方面的相关差异。如所预期，高胆固醇血患者显示出显著较高的血清总胆固醇(TC)、LDL胆固醇(LDL-C)和甘油三酯(TG)水平(p < 0.001)。相对于健康受试者，高胆固醇血患者中的HDL胆固醇水平(HDL-C)显著较闻。复I临床研究中登记的高胆固醇血患者和健康受试者的临床参数
*数据表示为平均值土 SD** BMI=体重指数M. F=平均荧光HC患者显示出增强的氧化应激，如基于尿异前列烷水平(表1，图2D)、从增加的血清gp9Iphox (sgp9Iphox)(相对于对照样品)(见表I ;图2A和B)以及从血小板gp9Iphox水平(表I ;图2C)所判断。根据双变量分析，sgp91ph°x显示出与血清胆固醇水平之间的显著相关性(Rs = 0. 52，p < 0. 001)以及与尿异前列烷水平之间的显著相关性(Rs = 0. 57，p =
0.05)。异前列烷的排泄也显示出与血清胆固醇水平的显著相关性(Rs = 0.59，p
<0. 001)。就临床干预研究而言，随机被分为接受膳食治疗(组A)和随机被分为接受膳食+阿托伐他汀(IOmg/膳食；组B)的患者在时间为0时显示出相似的总胆固醇水平、sgp91ph°x和尿异前列烷水平(表2和图3)。轰I临床研究随机被分为接受膳食治疗(组A)或膳食+阿托伐他汀(组B)的HC患者的基础参数____
参数组A(n=15)组B(n = 15) P值
*数据表示为平均值土 SD在治疗30天结束时，组B显示出sgp91ph°x的显著降低(从211±68至154±43A.U.，p = 0.035)(数据未显示)以及尿异前列烷水平的显著降低(从383±51至241±58pg/mg肌酸酐，p < 0. 001)(图3D)和血清总胆固醇的显著降低(从276±46至208±38mg/dl，p < 0. 001)(数据未显示)。与此相反,组A仅显示出总胆固醇水平的微弱下降(从 280±31 至 261±15mg/dl，p = 0. 045)。数据的MANOVA分析确认了治疗时间与组变量之间相互作用的显著性，说明不同的治疗对于sgp91ph°x之存在[F(l，21) = 5，6，p = 0.02]、对于尿异前列烷[F(l，21) =66，Lp = 0.01]以及对于总胆固醇[F(l，21) = 9,6, p = 0.01]的显著效应。未发现治疗时间与其它协变量例如年龄、吸烟习惯、性别、血压等之间的显著相关性。实施例2:使用本发明的ELISA检验法测定以阿托伐他汀进行的临床研究中的SgpQllto通过本发明的夹心式ELISA测验法在临床研究中的对照与HC患者中发现了sgp9Iphox与尿异前列烷之间的关联。所测样品是来自实施例2的临床研究的相同采样的血清，在使用前储存于_80°C。gp9Iphrai 的肽 LNFARKRIKNPEGGLC (SEQ ID NO :1)或 AERIVRGQTAESLAVHNITVCEQKISEffGKlKECPIPQFAGNPPM(SEQ ID NO :3)分别用作标准物。以包被缓冲液(目录号C3041，Sigma Chemicals)按I : 100稀释如上文描述的针对SEQ ID NO 1的专利多克隆一抗和针对SEQ ID NO 3的单克隆一抗(即本发明的专利抗体，来自于2010年6月10日保藏于ATCC的杂交瘤，保藏号为SD-6311)，将IOOiU该一抗溶液置于96孔ELISA板中，放置于室温(RT)I小时。温育之后，除掉板中每个孔中的内容物，以洗涤缓冲液(Tris 缓冲的盐水 50mM, pH8. O，Tween 20 ;目录号 T9039, Sigma Chemicals)洗涤孔3次。然后，将含有1% BSA(目录号T6789, Sigma Chemicals)的200 U I饱和缓冲液加入至孔中，于室温放置30分钟。然后以如上所述的洗涤缓冲液洗涤孔3次。然后将IOOii I标准物或待测样品加入到孔中并在室温温育I小时。通过使用浓度渐增的gp9 Iphox的SEQ ID NO : I的肽或SEQ ID NO : 3的肽(即64pg/ml ；32pg/ml ；16pg/ml ;8pg/ml,通过在缓冲液中稀释而获得)并温育I小时而获得标准曲线。见图4，图板A和图板B。然后将孔中内容物吸出并以如上所述的洗涤缓冲液洗涤3次。以包被缓冲液按照I : 100稀释IOOiU山羊-抗-兔子IgG-HRP 二抗(Santa Cruz,目录号sc2004)或山羊-抗-小鼠IgG-HRP 二抗(Santa Cruz,目录号sc 2060),然
后在室温温育I小时。吸出孔中的内容物之后并以如上所述的洗涤缓冲液洗涤3次以后，将IOOiU底物(Santa Cruz,目录号SK-4400)加入到孔中，在室温放置30分钟。在温育结束后，向孔中加A 100 u IH2SO4 2M (Merck,目录号30148297)。然后，使用分光光度计在450nm读取所显示的颜色。通过使用如上所述的以gp91ph°x肽获得的合适的标准曲线来计算样品的最终浓度。表3和4显示了如上所述的用于进行ELISA测验的步骤，分别使用本发明的多克隆抗体和单克隆抗体。表3
步骤__样品/抗体__测验条件_
以一抗温育抗-gp91phox pAb*__100(il 4jig /ml/孑U lh, RT
样品__IOOial 血清__lh, RT_
二抗IOOial山羊抗-兔子100(il 1:2000稀释抗体，Ih,
IgGl-HRP (Santa Cruz RT__sc-2004)__
显示TMB (Santa Cruz405nm/450nm, 15 分钟
_ sk-4400)__
0阈值建立为0.015 pg/ml_
p Ab* =多克隆抗体
RT=室温_^4步驟__样品/抗体__测验条件
以一抗温育抗-gp91phox mAb*IOOfJ 4(ig/ml/孔，lh,
___RT_
样品__100|il 血清__lh, RT_
权利要求
1.通过测定作为氧化应激标志物的可溶性gp91ph°x的水平而体外检测NADPH氧化酶之激活的方法，该方法在选自血清、血浆、细胞培养物上清液和细胞裂解物的生物液体中进行，所述方法包括以下步骤 (i)将生物液体与针对gp91ph°x或其对应肽的抗体接触，所述肽优选为选自SEQID NO:I的肽或SEQ ID NO : 3的肽及其相应混合物； (ii)检测抗体/gp91ph°x复合物或抗体/gp91ph°x肽复合物的形成； 所述方法可选地包括以下另外步骤 (iii)使用gp91ph°x的标准物制备物、优选用于引发抗体的肽的制备物构建校正曲线，所述肽选自SEQ ID NO 1的肽和SEQ ID NO 3的肽；和 (iv)使用步骤(iii)的校正曲线计算样品中的gP91ph°x或其对应肽的浓度。
2.用于评价治疗法的有效性的方法，所述治疗法是例如使用抗炎试剂或抗高血糖试剂治疗患有关节炎或糖尿病的患者中的败血病的治疗法，或用于治疗心血管疾病、例如高血压、动脉粥样硬化、心脏肥大和心肌梗塞的治疗法，或以他汀类药物治疗高胆固醇血患者的治疗法,所述方法包括通过权利要求I的方法检测NADPH氧化酶的激活中的变化。
3.用于检测NADPH氧化酶之激活的gp9Iphrai的细胞外部分。
4.用于检测氧化应激的选自SEQID NO :1和SEQ ID NO :3的肽序列或包括它们的肽序列。
5.编码权利要求3的肽的核苷酸序列。
6.针对权利要求3的肽的多克隆或单克隆抗体。
7.根据权利要求5的单克隆抗体，其获自于2010年6月10日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)的保藏号为SD-6311的杂交瘤。
8.于2010年6月10日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)的保藏号为SD-6311的杂交瘤。
9.用于实施权利要求I或2的方法的试剂盒，其包含来自杂交瘤SD-6311的单克隆抗体。
10.权利要求9的试剂盒，还包含常规用于ELISA方法的试剂。
11.生物液体中的可溶性gp91ph°x蛋白或其对应肽用作氧化应激的标志物的用途，其中所述生物液体选自血清、血浆、细胞培养物上清液和细胞裂解物。
12.权利要求10的用途，其中所述肽选自SEQID NO 1的肽和SEQID NO 3的肽以及对应的肽片段和包含肽序列。
13.权利要求11-12的用途，所述用途用于评价治疗法的有效性，所述治疗法是例如使用抗炎试剂或抗高血糖试剂治疗患有关节炎或糖尿病的患者中的败血病的治疗法，或用于治疗心血管疾病、例如高血压、动脉粥样硬化、心脏肥大和心肌梗塞的治疗法，或以他汀类药物治疗高胆固醇血患者的治疗法。
14.针对gp91ph°x或其对应肽的多克隆或单克隆抗体用于检测所述蛋白在生物液体中的存在以检测受试者或细胞培养系统中的氧化应激的用途，其中所述生物液体选自血清、血浆、细胞培养物上清液和细胞裂解物。
15.权利要求14的用途，其中所述单克隆抗体是来自杂交瘤SD-6311的单克隆抗体。
全文摘要
本发明涉及通过测定生物液体中的gp91phox蛋白水平而检测NADPH氧化酶之激活的体外方法，所述蛋白作为氧化应激的标志物。该方法用于测定代谢障碍病症、例如糖尿病、高胆固醇血症和高脂血症，心血管疾病、例如高血压、动脉粥样硬化、心脏肥大和中风，以及在包括败血病的临床病况以及具有强炎性成分的疾病中的氧化应激水平。
文档编号G01N33/50GK102741692SQ201080035389
公开日2012年10月17日 申请日期2010年6月11日 优先权日2009年6月12日
发明者F·维奥利, P·皮尼亚泰利 申请人:碧欧斯国际有限责任公司