专利名称：心肌肌钙蛋白半定量检测试纸及制备方法
技术领域：
本发明涉及一种心肌肌钙蛋白半定量检测试纸。
背景技术：
心脑血管疾病是危害人类生命和健康的第一杀手，发病趋势也在逐年上升，美国急诊部门就有4. 5亿急性心肌梗塞(AMI)病人，有4亿病人被确诊为急性心肌梗塞，其中 2-3%的人真正有AMI，并且由于AMI的症状的多样性，合并症躲在临床存在着相当大的误诊和漏诊，有些心肌损伤因为不典型而被医生和患者忽视，而没有及时救治，出现很多的生命危险。急性心肌梗死发病急，死亡率高，AMI的早期诊断和及时救治对降低AMI死亡率非常重要。肌钙蛋白是由肌钙蛋白I，T，C三种亚基组成，在肌肉运动中起重要调节作用。当心肌受到损失后，心肌肌钙蛋白复合物释放到血液中，在三种亚基中，肌钙蛋白I( CTnI)是唯一存在心肌细胞中，迄今为止诊断AMI灵敏度和特异性最高的血清生化指标，被广泛研究作为心肌损伤的确定性标志物，文献表面，正常人血液中的cTnl水平在0. 5ng/ml以下， 发生心肌梗死后会在4-6小时内上升，所以0、ng/ml WcTnI浓度的定量对知道医生用药，和病人就诊非常重要。心肌肌钙蛋白I常规检测方法有放射性免疫法，高效液相色谱法，电化学分析法， 蛋白分析仪，ELISA诊断试剂盒和免疫层析试纸条等，这些方法有的存在放射性污染，需要专业大型仪器，耗时长，需要专业人员，不能定量等缺点。在临床上广泛应用具有一定局限， 不易广泛推广，也不适合家庭使用。国内现有类似的心肌肌钙蛋白检测方法的相关专利，申请号200310119332. 3、名称为“人体心肌肌钙蛋白I的快速测定的方法”的专利，它提供的一种快速测定心肌肌钙蛋白I的方法，但是该方法的步骤繁琐，而且还需要专业设备才能测定含量。申请号CN201020185781.3的专利虽能定量，但是制备过程繁杂。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服当前胶体金免疫层析试纸条在实际推广使用中只能定性不能定量检测的不足，提供一种不要特定的仪器和专业设备，就能快速评定检测结果，并对检测结果进行半定量水平的测定，同时提供该试纸的制备方法。为解决上述技术问题，本发明的一种心肌肌钙蛋白半定量检测试纸，主要由样品垫，结合垫，吸水垫，底板，硝酸纤维膜五部分组成，其特征在于所述硝酸纤维膜上分别划有两条平行的抗体捕获线，靠近结合垫的一条含有经过确定了浓度的第一抗心肌肌钙蛋白 I单克隆抗体，作为检测线，另一条含有经确定了浓度的羊抗兔IgG抗体，作为标准浓度显色对照线，两条线相距4-7mm ；所述结合垫喷有胶体金或彩色乳胶标记的第二抗心肌肌钙蛋白I单克隆抗体和金标兔IgG两种物质。优选的，所述硝酸纤维膜与上部的吸水垫，硝酸纤维膜与下端的结合垫，结合垫与下部的样品垫之间分别部分重叠交接，所述重叠宽度为l_4mm。
4
所用的胶体金或彩色乳胶标记的第二抗心肌肌钙蛋白I单克隆抗体的金颗粒或乳胶大小在20nm— 120nm之间。进一步优选的，分别调整所述羊抗兔IgG抗体、抗心肌肌钙蛋白I单克隆抗体、金标心肌肌钙蛋白I单克隆抗体和金标兔IgG的浓度，在检测样品时，当样品中的心肌肌钙蛋白I激素浓度为2ng/ml时，检测线与标准浓度显色对照线的红颜色深浅相同；当样品中的心肌肌钙蛋白I激素浓度低于2ng /ml时，检测线的红色浅于标准浓度显色对照线的红色； 当样品中心肌肌钙蛋白I激素浓度高于2ng /ml时，检测线的红色深于标准浓度显色对照线的红色。一种与权利要求4所述的心肌肌钙蛋白半定量检测试纸配合使用的比色卡，该比色卡中含有多种红色梯度的红色块，每种深浅的红色块，对应用心肌肌钙蛋白I半定量检测试纸检测不同浓度心肌肌钙蛋白I抗原检测所显示的红色；通过对照比色卡，可以半定量确定检测样品中的心肌肌钙蛋白I的浓度。本发明的检测方法为将血液等样品滴4-5滴到样品垫上，含心肌肌钙蛋白I抗原的血液通过样品垫的毛细作用，向硝酸纤维膜方向移动，经过金标结合垫时，与金标结合垫上的抗心肌肌钙蛋白I单克隆抗体特异性结合，并使结合物一起向硝酸纤维膜移动，当到达硝酸纤维膜上包被有抗心肌肌钙蛋白I单克隆抗体的检测线时，发生双抗夹心特异性结合，样品中的抗原和金标的抗心肌肌钙蛋白I单克隆抗体被包被在硝酸纤维膜的抗心肌肌钙蛋白I单克隆抗体固定，从而使检测线显示胶体金的红色，其检测线的红色深浅与样品中的心肌肌钙蛋白I抗原浓度程正比。未被检测线固定的金标心肌肌钙蛋白I单抗和心肌肌钙蛋白I激素抗原结合物或金标心肌肌钙蛋白I单抗继续沿硝酸纤维膜上移，达到质控线时，金标心肌肌钙蛋白I单抗不与质控线上的羊抗兔IgG抗体反应，而是定量的金标兔 IgG与质控线羊抗兔反应，而被质控线固定，显示红色，无论样品中是否含有心肌肌钙蛋白 I抗原，或抗原的浓度如何变化，质控线始终显色，且色值固定，如果质控线不显色，说明试纸条无效。本发明还提供上述心肌肌钙蛋白半定量检测试纸的制备方法，包括以下步骤 选择两株抗心肌肌钙蛋白I鼠源性特异单克隆抗体，即抗心肌肌钙蛋白I单抗1和抗
心肌肌钙蛋白I单抗2;
选择抗心肌肌钙蛋白I单抗1作为胶体金标记抗体，使用柠檬酸钠还原法制备为 20nm^l20nm大小的纳米金颗粒，10000RPM/MIN离心10分钟，制备为储备液，将胶体金标记单抗，并加入聚乙二醇PEG，牛血清白蛋白BSA做稳定剂；
将标记号的金标抗体1，喷聚酯膜或玻璃纤维纸，低温干燥，制得金标结合垫； 将玻璃纤维膜浸泡在磷酸盐缓冲液PBS加表面活性剂的溶液中5分钟，再捞出30度左右烘干，制得样品垫；
将2cm宽的硝酸纤维膜粘在PVC片材中间位置，并定量喷涂抗心肌肌钙蛋白I单抗2 和定量的羊抗兔抗体两条相距5mm的Imm宽的条带，低温干燥10小时；
裁剪一定宽度的吸水纸，黏贴在PVC片材上硝酸纤维素膜的上部，并交叠硝酸纤维膜 l-3mm ；
将金标结合垫裁剪成5mm-13mm左右的条带，黏贴在PVC片材上硝酸纤维膜的下部，交叠硝酸纤维膜l_3mm ；将样品垫裁剪成25mm-30mm宽的条带，再黏贴在金标结合垫的下部，交接金标结合垫 3mm-5mm ；
再用40mm左右的带MAX线的不干胶，粘在金标结合垫和样品垫上； 用切割机将上面制得的大板，切成2. 5mm-6mm的条带，即制备成了所述心肌肌钙蛋白半定量检测试纸，然后用铝箔袋密封干燥备用。本发明心肌肌钙蛋白定量检测试纸的制备方法简单、成本低，检测使用方便、能够快速简便，半定量的灵敏检测人体血液样本中的心肌肌钙蛋白I的含量，适合家庭使用和推广。
下面结合附图和具体实施方式
对本发明的技术方案作进一步具体说明。图1为本发明心肌肌钙蛋白定量检测试纸的主视图。图2为本发明心肌肌钙蛋白定量检测试纸的侧视图。图3为心肌肌钙蛋白定量检测试纸配合使用的比色卡主视图。
具体实施例方式结合图1、2所示，本发明心肌肌钙蛋白定量检测试纸主要由样品垫01，结合垫 02，吸水垫06，底板07，硝酸纤维膜04五部分组成，硝酸纤维膜04上分别划有两条平行的抗体捕获线，靠近结合垫的一条含有经过确定了浓度的第一抗心肌肌钙蛋白I单克隆抗体，作为检测线03，另一条含有经确定了浓度的羊抗兔IgG抗体，作为标准浓度显色对照线05，也称为质控线，两条线相距4-7mm ；结合垫02上喷有胶体金标记的第二抗心肌肌钙蛋白I单克隆抗体和金标兔IgG两种物质。硝酸纤维膜04与上部的吸水垫06，硝酸纤维膜04与下端的结合垫02，结合垫02与下部的样品垫06之间分别部分重叠交接，重叠宽度分别为l-4mm。所用的胶体金标记的第二抗心肌肌钙蛋白I单克隆抗体的金颗粒大小为 20nm—120nm。分别调整所述羊抗兔IgG抗体、抗心肌肌钙蛋白I单克隆抗体、金标心肌肌钙蛋白 I单克隆抗体和金标兔IgG的浓度，在检测样品时，当样品中的心肌肌钙蛋白I浓度为2ng/ ml时，检测线与标准浓度显色对照线的红颜色深浅相同；当样品中的心肌肌钙蛋白I激素浓度低于2ng /ml时，检测线的红色浅于标准浓度显色对照线的红色；当样品中心肌肌钙蛋白I浓度高于2ng /ml时，检测线的红色深于标准浓度显色对照线的红色。心肌肌钙蛋白半定量检测试纸的制备方法，包括以下步骤
购买心肌肌钙蛋白I免疫小鼠，分别得到抗心肌肌钙蛋白I鼠源性特异单克隆抗体两株，抗心肌肌钙蛋白I单抗1和抗心肌肌钙蛋白I单抗2。选择抗心肌肌钙蛋白I单抗2 作为胶体金标记抗体，使用柠檬酸钠还原法制备最20nnTl20nm大小，适合标记该抗体的纳米金颗粒。10000RPM/MIN离心10分钟，制备储备液，将胶体金标记单抗，并加入PEG，BSA做稳定剂。将标记号的金标抗体1，喷聚酯膜或玻璃纤维纸。低温干燥，制的金标结合垫。将玻璃纤维膜浸泡在PBS加表面活性剂的溶液中5分钟，再捞出30度左右烘干，制得样品垫。 将2cm宽的硝酸纤维膜粘在PVC片材中间位置，并定量喷涂抗心肌肌钙蛋白I单抗2和定量的羊抗兔抗体两条相距5mm的约Imm宽的条带。低温干燥10小时。裁剪一定宽度的吸
6水纸，黏贴在PVC片材上，硝酸纤维素膜的上部，并交叠硝酸纤维膜l-3mm。将金标结合垫裁剪成5mm-13mm左右的条带，黏贴在PVC片材上，硝酸纤维膜的下部，交叠硝酸纤维膜l_3mm 左右。将样品垫裁剪成25mm-30mm宽的条带，再黏贴在金标结合垫的下部，交接金标结合垫 3mm-5mm左右。再用40mm左右的带MAX线的不干胶，粘在金标结合垫和样品垫上，防止其脱落。用切割机将上面制得的大板，切成2. 5mm-6mm左右的条带，即制备成了半定量检测人心肌肌钙蛋白I半定量检测试纸条。用铝箔袋密封干燥备用。在检测前将铝箔包装袋拿出，室温放置5min左右，取出试纸，将样品垫下部浸于样品溶液中，不超过MAX线，5秒钟拿出，水平放置，5分钟肉眼观察检测线和标准质控线。如果检测线红色大于质控线，说明样品中肌钙蛋白I浓度高于2ng/ml，样品的来源人有心肌损伤的可能。如果检测线红色浅于质控线，说明样品中的肌钙蛋白I浓度低于 2ng/ml。如果想知道样品中心肌肌钙蛋白I的具体浓度，可以将检测线的显色结果与色卡对照，色卡中颜色与检测线相近的色块值，即为样品中肌钙蛋白I的浓度。即能快速，方便， 快捷的检测样品中肌钙蛋白I的具体浓度，估量出心肌损伤程度。本发明制备的心肌肌钙蛋白I半定量分析检测层析试纸条和与ELISA试剂盒，对选取157份武汉市内九家医院的心梗急诊部的血清样本进行了检测，结果如下
心肌肌钙蛋白I半定量分析检测层析试纸条142份阳性，15阴性。ELISA试剂盒141份阳性，16份阴性。心肌肌钙蛋白I半定量分析检测层析试纸条检测结果与ELISA试剂盒检测结果总符合率为99. 4%。最后所应说明的是，以上具体实施方式
仅用以说明本发明的技术方案而非限制， 尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
权利要求
1.一种心肌肌钙蛋白半定量检测试纸，主要由样品垫，结合垫，吸水垫，底板，硝酸纤维膜五部分组成，其特征在于所述硝酸纤维膜上分别划有两条平行的抗体捕获线，靠近结合垫的一条含有经过确定了浓度的第一抗心肌肌钙蛋白I单克隆抗体，作为检测线，另一条含有经确定了浓度的羊抗兔IgG抗体，作为标准浓度显色对照线，两条线相距4-7mm ；所述结合垫喷有胶体金或彩色乳胶标记的第二抗心肌肌钙蛋白I单克隆抗体和金标兔IgG两种物质。
2.根据权利要求1所述的心肌肌钙蛋白半定量检测试纸，其特征在于，所述硝酸纤维膜与上部的吸水垫，硝酸纤维膜与下端的结合垫，结合垫与下部的样品垫之间分别部分重叠交接，所述重叠宽度为l_4mm。
3.根据权利要求1所述的心肌肌钙蛋白半定量检测试纸，其特征在于，所用的胶体金或彩色乳胶标记的第二抗心肌肌钙蛋白I单克隆抗体的金颗粒或乳胶大小在20nm—120nm 之间。
4.根据权利要求1-3之一所述的心肌肌钙蛋白半定量检测试纸，其特征在于，分别调整所述羊抗兔IgG抗体、抗心肌肌钙蛋白I单克隆抗体、金标心肌肌钙蛋白I单克隆抗体和金标兔IgG的浓度，在检测样品时，当样品中的心肌肌钙蛋白I激素浓度为2ng/ml时，检测线与标准浓度显色对照线的红颜色深浅相同；当样品中的心肌肌钙蛋白I激素浓度低于 2ng /ml时，检测线的红色浅于标准浓度显色对照线的红色；当样品中心肌肌钙蛋白I激素浓度高于2ng /ml时，检测线的红色深于标准浓度显色对照线的红色。
5.一种与权利要求4所述的心肌肌钙蛋白半定量检测试纸配合使用的比色卡，该比色卡中含有多种红色梯度的红色块，每种深浅的红色块，对应用心肌肌钙蛋白I半定量检测试纸检测不同浓度心肌肌钙蛋白I抗原检测所显示的红色；通过对照比色卡，可以半定量确定检测样品中的心肌肌钙蛋白I的浓度。
6.一种根据权利要求5所述的心肌肌钙蛋白半定量检测试纸的制备方法，其特征在于包括以下步骤选择两株抗心肌肌钙蛋白I鼠源性特异单克隆抗体，即抗心肌肌钙蛋白I单抗1和抗心肌肌钙蛋白I单抗2;选择抗心肌肌钙蛋白I单抗1作为胶体金标记抗体，使用柠檬酸钠还原法制备为 20nm^l20nm大小的纳米金颗粒，10000RPM/MIN离心10分钟，制备为储备液，将胶体金标记单抗，并加入聚乙二醇PEG，牛血清白蛋白BSA做稳定剂；将标记好的金标抗体1，喷聚酯膜或玻璃纤维纸，低温干燥，制得金标结合垫；将玻璃纤维膜浸泡在磷酸盐缓冲液PBS加表面活性剂的溶液中5分钟，再捞出30度左右烘干，制得样品垫；将2cm宽的硝酸纤维膜粘在PVC片材中间位置，并定量喷涂抗心肌肌钙蛋白I单抗2 和定量的羊抗兔抗体两条相距5mm的Imm宽的条带，低温干燥10小时；裁剪一定宽度的吸水纸，黏贴在PVC片材上硝酸纤维素膜的上部，并交叠硝酸纤维膜 l-3mm ；将金标结合垫裁剪成5mm-13mm左右的条带，黏贴在PVC片材上硝酸纤维膜的下部，交叠硝酸纤维膜l_3mm ；将样品垫裁剪成25mm-30mm宽的条带，再黏贴在金标结合垫的下部，交接金标结合垫3mm-5mm ；再用40mm左右的带MAX线的不干胶，粘在金标结合垫和样品垫上； 用切割机将上面制得的大板，切成2. 5mm-6mm的条带，即制备成了所述心肌肌钙蛋白半定量检测试纸，然后用铝箔袋密封干燥备用。
全文摘要
本发明涉及一种心肌肌钙蛋白半定量检测试纸，主要由样品垫，结合垫，吸水垫，底板，硝酸纤维膜五部分组成，硝酸纤维膜上分别划有两条平行的抗体捕获线，靠近结合垫的一条含有经过确定了浓度的第一抗心肌肌钙蛋白I单克隆抗体，作为检测线，另一条含有经确定了浓度的羊抗兔IgG抗体，作为标准浓度显色对照线，两条线相距4-7mm；结合垫喷有胶体金或彩色乳胶标记的第二抗心肌肌钙蛋白I单克隆抗体和金标兔IgG两种物质。本发明心肌肌钙蛋白定量检测试纸的制备方法简单、成本低，检测使用方便、能够快速简便，半定量的灵敏检测人体血液样本中的心肌肌钙蛋白I的含量，适合家庭使用和推广。
文档编号G01N33/532GK102207507SQ20111007176
公开日2011年10月5日 申请日期2011年3月24日 优先权日2011年3月24日
发明者周军, 王健斌, 龚贻洲 申请人:武汉璟泓万方堂医药科技有限公司