专利名称：一种高效提取土壤样品中磷脂脂肪酸的方法
技术领域：
本发明涉及一种从盐碱地土壤中提取磷脂脂肪酸(PLFA)的方法。
背景技术：
磷脂脂肪酸(PLFA)提取技术的发展，首先是脂类物质提取技术的发展。早在20世纪60年代以前，科学家们就在尝试着建立测定食品中脂类物质的方法，但是，当时的方法并不十分令人满意，存在着提取时间长、提取剂消耗大和只能提取部分脂类等缺点。1956年，Bligh和Dyer首次提出了一个简单、快速地提取鱼类中脂类物质的方法,但是，Blight和Dyer的方法在当时仅限于食品，特别是鱼类的磷脂提取中，并未被应用于土壤。并且，这 个方法只能确定总脂类的含量，而如果只知道总脂类的含量，不能达到对土壤微生物群落结构进行分析的目的。White和Tunlid等在20世纪70年代末和80年代初发展了磷脂脂肪酸分析技术。White等分析了河口和海底沉积物中磷脂的含量，并与ATP和DNA合成等表沉积物微生物量的方法进行了比较，认为磷脂可以作为表征微生物生物量的一个指标。同时，还提出了该方法可以根据脂类物质的组成，对微生物群落结构进行分析。但是，他们并未对具体的脂肪酸进行测定。Tunlid等在《加拿大微生物学杂志》上发表的文章具有现代PLFA分析技术的雏形。他们利用磷脂脂肪酸技术对油菜根际微生物生物量和群落结构进行了定量分析，促进了 PLFA在土壤环境学中的应用。但上述磷脂脂肪酸分析技术存在诸多的不足，在以往的方法中采用购买SPE柱(Supelco公司)，消耗的溶剂虽少，然而，商业SPE柱相对较贵，购买过程复杂，对饱和脂肪酸收集效率较低，因此本发明中的自制柱可以在降低试验成本的基础上提高收集效率，适用于大批量土壤样品的分析。
发明内容
本发明旨在提供一种从盐碱地土壤中提取磷脂脂肪酸的方法。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案(I)称取盐碱地土壤，加入Bligh. Dyer提取液，避光震荡，离心处理并取上清液；
(2)在上清液中加入柠檬酸和氯仿，室温避光过夜，并收集下层氯仿，氮气吹干，冷冻保存；
(3)将所述氯仿溶液加入到硅胶柱，进行柱层析，得到磷脂脂肪酸。其中，柱层析采用的硅胶柱的制备方法为，(I)称取200-300目硅胶，加入氯仿并充分搅拌，所述硅胶与氯仿的重量比为I : 2; (2)装柱；(3)待沉降完成后，加入氯仿，并用双联球或气泵加压，直至流速恒定，柱床被压缩至9/10体积。进一步地，在柱层析分离步骤中，依次加入3-10cm的氯仿，IOcm左右的丙酮以及3-10cm甲醇，进行磷脂脂肪酸的提取。进一步地，盐碱地土壤加入Bligh. Dyer提取液后，可以避光震荡3个小时，然后以3600rpm的速度离心25分钟。
进一步地，上清液中加入的柠檬酸体积为4. 8ml，加入的氯仿体积为4. 8ml。通过本发明提供的提取方法，可以提高磷脂脂肪酸的收集效率，降低试验成本。通过本发明提供的磷脂脂肪酸提取方法，可有效滤除脂性醇、糖脂和中性脂等杂质，经过压实后的柱子可以更充分地与硅烷醇中的活性位点接触而被吸附，从而得到相对较高的含量。
具体实施例方式本发明涉及到一种提取磷脂脂肪酸的方法。本发明利用自制硅胶柱来提取土壤总磷脂脂肪酸，其收集效率高、工艺简单、成本低廉。具体地说，本发明采用的技术方案如下I.称取6g盐碱地土壤，放入50ml离心管。加入20ml Bligh. Dyer提取液，避光震 荡3小时左右，然后3600rpm离心25分钟，取上清液。同样方法加18ml Bligh. Dyer提取液，震荡后，再次离心，合并两次提取液，过滤至150ml三角瓶中，加入4. 8ml柠檬酸和4. 8ml氯仿，室温避光过夜。用甲醇或乙醇润洗氮吹仪针头，第二天收集下层氯仿相于IOml试管中，N2吹干。-20°C保存。2.先用丙酮清洗玻璃管柱，然后用氯仿润洗。将氯仿浸泡的硅胶加入柱中(氯仿压柱，使硅胶柱长8cm左右)，三角瓶收集废液，依次加入5cm左右的氯仿(滤出中性磷脂)，IOcm左右的丙酮(滤出醣酯类)，待丙酮消失后，加入IOcm甲醇(磷脂)，20ml试管收集甲醇液，N2吹干。-20°C保存。硅胶柱制作过程(I)称量。200-300目硅胶，称30-70倍于上样量；如果极难分，也可以用100倍量的硅胶。(2)搅成匀浆。加入干硅胶体积一倍的氯仿用玻璃棒充分搅拌。(3)装柱。将柱底用玻璃纤维塞紧(或玻璃柱自带过滤纤维也可)，加入约1/3体积氯仿，打开柱下活塞，将匀浆一次倾入玻璃柱内。随着沉降，会有一些硅胶沾在玻璃管壁内，用氯仿将其冲入柱中。(4)压实。沉降完成后，加入更多的氯仿，用双联球或气泵加压，直至流速恒定。柱床约被压缩至9/10体积。进行这一步可使分离度提高很多，且可以避免过柱时由于柱床萎缩产生开裂，这一步骤可使总的分离效率提高7.8%，其中表征细菌的16:0、il6:0、18:00饱和脂肪酸产量提高了 36.8%。表征真菌的18:lw9、18:2w6，9以及表征甲烷氧化菌的18:lw8的不饱和脂肪酸产量提高了 5. 3%，放线菌没有显著变化。(5)上样。湿法上样。上样后，加入一些洗脱剂，再将一玻璃纤维塞至接近硅胶表面。然后加入大量洗脱剂，也不会冲坏硅胶表面。(6)过柱和收集。柱层析实际上是在扩散和分离之间的权衡。太低的洗脱强度并不好，推荐用梯度洗脱。收集的例子IOmg上样量，Ig硅胶(200-300目)，0. 5ml收一馏分；l-2g上样量，50g硅胶(200-300目),20-50ml收一馏分。采用这种方法得到的自制柱，分离到更多的饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸。硅烷醇(硅胶活化后产生的活性部位)包含有-0H，与硅原子可以直接绑定。硅烷醇与脂质的极性基团相结合，从而绑定滞留了脂质分子，脂质的非极性基团在分离纯化过程中几乎不起什么作用。当磷脂经过硅胶时，极性较小的不饱和脂肪酸在松散的自制柱中与活性位点接触的可能性就减小，从而更容易被淋洗出，相反的，当它们经过压实后的自制柱时，有更多机会与活性点接触而被吸附，从而得到相对较高的含量。3.吹干样加入Iml甲醇甲苯(I I)液和Iml 0. 5% KOH无水甲醇，37°C水浴30分钟，冷却至室温，每个样品中加入IOml乙酸中和，再加入2ml氯仿正己烷(I 4)和2ml超纯水，静置30分钟分层，取上清液于IOml试管中，N2吹干。-20°C保存。4.每个样品中加入I. 5ml内标，溶解后，注射器吸入，微孔过滤器过滤至GC/MS自动进样瓶中，上机待测。
通过实验证实，经过本发明提供的提取方法，磷脂脂肪酸的分离效率提高了7.8%，其中表征细菌的16:0、il6:0、18:00饱和脂肪酸产量提高了 36.8%。表征真菌的18:lw9U8:2w6,9以及表征甲烷氧化菌的18:lw8的不饱和脂肪酸产量提高了 5.3%。
权利要求
1.一种从盐碱地土壤中提取磷脂脂肪酸的方法，其特征在于包括以下步骤(1)称取盐碱地土壤，加入Bligh.Dyer提取液，避光震荡，离心处理并取上清液； (2)在所述上清液中加入柠檬酸和氯仿，室温避光过夜，并收集下层氯仿，氮气吹干，冷冻保存； (3)将所述收集物溶解于氯仿后加入到硅胶柱，进行柱层析分离，得到磷脂脂肪酸，其特征在于，所述硅胶柱的制备方法为a.称取200-300目硅胶，加入氯仿并充分搅拌，所述硅胶与氯仿的重量比为I: 2; b.装柱； c.待沉降完成后，加入氯仿，并用双联球或气泵加压，直至流速恒定，柱床被压缩至9/10体积。
2.根据权利要求I所述的取上清液，其特征在于，避光震荡3个小时，以3600rpm的速度离心25分钟。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中加入的柠檬酸的体积为4.8ml,加入的氯仿体积为4. 8ml。
4.根据权利要求I所述的柱层析分离，其特征在于，依次加入3-10cm的氯仿，IOcm左右的丙酮以及3-10cm甲醇。
全文摘要
本发明提供一种从盐碱地土壤中提取磷脂脂肪酸的方法，包括以下步骤(1)称取盐碱地土壤，加入Bligh.Dyer提取液，避光震荡，离心处理并取上清液；(2)在上清液中加入柠檬酸和氯仿，室温避光过夜，并收集下层氯仿，氮气吹干后冷冻保存；以及(3)将收集物溶解于氯仿后加入到自制硅胶柱，进行柱层析分离，得到磷脂脂肪酸。通过本发明提供的磷脂脂肪酸提取方法，可有效滤除脂性醇、糖脂和中性脂，经过压实后的柱子可以更充分的与硅烷醇中的活性位点接触而被吸附，从而得到相对较高的含量，通过实验我们发现磷脂脂肪酸总量的分离效率提高了7.8％。
文档编号G01N1/40GK102798566SQ201110133719
公开日2012年11月28日 申请日期2011年5月23日 优先权日2011年5月23日
发明者李明, 孙兆军, 王金枝, 姜丽丽, 王艳芬 申请人:中国科学院研究生院