专利名称：一种检测食品中腐败菌氨基酸脱羧酶活性的方法
技术领域：
本发明属于农产品技术研究领域，具体涉及食品中腐败菌氨基酸脱羧酶活性的检测方法。
背景技术：
生物胺是由于微生物的活动使得某些氨基酸发生脱羧化而产生的一类低分子有机碱。适量的生物胺有助于人类及动物的正常生理功能，然而人体器官内生物胺含量过度增加则会干扰神经、胃肠道系统以及血压的正常功能。某些生物胺还是亚硝胺的前体，后者具有致癌效应，因此消费者摄入较多的生物胺会对健康带来不良影响。肉制品中的某些腐败微生物会在氨基酸脱羧酶的作用下使得游离氨基酸发生脱羧反应形成生物胺，从而给产品的安全性带来隐患。只有弄清产生生物胺的主要微生物组成，才能有针对性地采取保鲜措施，控制生物胺的累积。
发明内容
本发明的目的是提供一种食品中腐败菌氨基酸脱羧酶活性的快速检测方法。本发明包括以下步骤
1)从食品中分离出腐败菌，经发酵取得菌株发酵液，将菌株发酵液按照1%接种量接种到含有氨基酸的液体培养基中，取得生物胺检测用腐败菌发酵液，再通过离心取得无菌体的上清，在上清和生物胺混合标准溶液中分别加入Na2HPCV NaOH和丹磺酰氯溶液，然后在 55°C水浴避光条件下分别取得腐败菌生物胺的衍生样品和标准生物胺的衍生样品；
2)将G60硅胶板在105°C下活化；
3)将由氯仿、乙醚和三乙胺混合制成的展开剂预饱和；
4)使用自动点样台点样，腐败菌生物胺的衍生样品和标准生物胺的衍生样品的上样量为2PL，间隔1.5cm，待样点干燥后，置入展开槽内，待展开剂扩展到距样点17cm处取出，通风厨内干燥，在366nm紫外灯下使用自动凝胶成像分析分别拍照，通过比对，根据Rf值确定样品中生物胺的种类，判断菌株的氨基酸脱羧酶活性。本发明提供了一种食品中腐败菌菌株氨基酸脱羧酶活性的快速检测方法，该方法具有以下的优点
(1)方便快捷，成本较低，需要的配套设备较低，普通实验室以及食品企业的品控部门都可以进行该试验。(2)各种生物胺的分离效果较好，并且对生物胺的检测限同高效液相色谱的检测限可媲美，可以准确实现对生物胺的定性检测。本发明所述含有氨基酸的液体培养基是将L-赖氨酸盐酸盐、L-酪氨酸二钠盐、 L-苯丙氨酸、L-组氨酸盐、L-精氨酸、L-鸟氨酸盐酸盐和L-色氨酸加入选择性培养基中灭菌取得，其中每IOOOmL选择性培养基中加入的L-赖氨酸盐酸盐、L-酪氨酸二钠盐、L-苯丙氨酸、L-组氨酸盐、L-精氨酸、L-鸟氨酸盐酸盐和L-色氨酸分别为lg。
本发明所述生物胺检测用腐败菌发酵液的取得方法是将筛选好的菌株的在其适宜的培养基中划线培养，等单菌落长出后挑选单菌落到不含氨基酸前体的液体培养基中， 适温下培养1 后，再按照1%接种量转接到含有氨基酸的液体培养基中，适温下培养4飞天后获得。本发明中，将生物胺检测用腐败菌发酵液在低温条件下IOOOOrpm离心5min，取无菌体的上清，并将该上清500μ 和生物胺混合标准溶液分别与500μ 0. 25mol/L的Na2HPO4, 50μ 4mol/L的NaOH，ImL 2. 5mg/L的丹磺酰氯溶液加入离心管，然后在离心管外边包上锡箔纸避光，放入到55°C水浴锅中避光衍生lh，分别取得腐败菌生物胺的衍生样品和标准生物胺的衍生样品，并将分别取得腐败菌生物胺的衍生样品和标准生物胺的衍生样品置于 4°C保存。本发明所述氯仿、乙醚和三乙胺的混合投料体积比为8 1 2。
图1为不同浓度的混合生物胺标准品的衍生样品的薄层层析检测后的紫外成像图。图2为部分单一生物胺标准品的衍生样品的薄层层析检测后的紫外成像图。图3为腐败菌发酵液中生物胺衍生样品的薄层层析检测后的紫外成像图。图4为盐水鸭样品中某些腐败菌发酵液中生物胺检测的高效液相色谱图。图5为盐水鸭样品中某些腐败菌发酵液中生物胺检测的高效液相色谱图。图6为本发明的操作步骤图。
具体实施例方式下边结合图6对本发明提出的一种食品中腐败菌菌株氨基酸脱羧酶活性的快速检测方法进行详细的说明。一、普通需氧菌的检测
1、准确称取色胺、2-苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺和精胺的标准品各50mg， 用0. 4mol/L的高氯酸(HClO4)定容到50mL，配成lmg/mL储备液备用。分别取以上标准品储备液，用 0. 4mol/L HClO4 配制成质量浓度分别为 2. 5Pg/mL、5. OPg/mLUO. (^g/mL、25. 0μδ/ mL、5(^g/mL、lOOPg/mL的生物胺混合标准溶液。将制得的不同浓度的生物胺混合标准溶液置于各离心管，在各离心管中加入 500μ 0. 25mol/L 的 Νει2ΗΡ04、50μ 4mol/L 的 NaOH 和 ImL 2. 5mg/L 的丹磺酰氯溶液，在各离心管外边包上锡箔纸避光，放入到55°C水浴锅中避光衍生lh，取得标准生物胺的衍生样品，然后将标准生物胺的衍生样品置于4°C避光保存备用。2、无菌条件下从每只盐水鸭中取5g鸭脖和鸭翅肉，15g鸭胸肉，IOg鸭腿肉及IOg 鸭背肉，共40克混合捣碎，每个盐水鸭的鸭肉作为一个试验样品。无菌条件下取25g样品加入225mL灭菌生理盐水(含lg/L蛋白胨、9g/LNaCl)摇床振摇30min后，取ImL上清液依次进行10倍梯度稀释，选择合适的稀释度涂布于平板计数(PCA)培养基中，于37°C下培养48h，挑选特征性菌落进行划线分离，然后将纯化好的菌落接种到PCA液体培养中，37 V 220rpm振荡培养12h，取得菌株发酵液。
3、分别称取0. Ig的L-赖氨酸盐酸盐、L-酪氨酸二钠盐、L-苯丙氨酸、L-组氨酸盐、L-精氨酸、L-鸟氨酸盐酸盐和L-色氨酸，并分别加入到IOOmL PCA液体培养基中灭菌， 取得含有氨基酸的PCA液体培养基。将上述步骤2培养好的菌株发酵液按照1%接种量接种到含有氨基酸的PCA液体培养基中，220rpm振荡培养4到6天，取得发酵液。4、将步骤3获得的发酵液低温下IOOOOrpm离心5min，取无菌体的上清500μ ， 加入到 IOmL 离心管中，再加入 500μ 0. 25mol/L 的 Na2HPO4,50μ 4mol/L 的 NaOH 和 ImL 2. 5mg/L的丹磺酰氯溶液，在离心管外边包上锡箔纸避光，放入到55°C水浴锅中避光衍生 lh，得到腐败菌生物胺的衍生样品，然后将腐败菌生物胺的衍生样品置于4°C避光保存。5、预先配好由氯仿、乙醚和三乙胺以体积比例为8 1 2混合成的展开液。先将G60硅胶板(5cm*10cm)在105°C下活化lh。将配好的25mL展开剂倒入展开缸中预饱和0.釙。使用自动点样台点样，取步骤4制成的腐败菌生物胺的衍生样品和步骤1制成的标准生物胺的衍生样品分别上样，上样量为2PL，间隔1.5cm，待样点干燥后，置入展开槽内，待展开剂扩展到距样点17cm处取出，通风厨内干燥，在366nm紫外灯下观察，然后使用自动凝胶成像分析分别拍照。通过比对，确定菌株发酵中生物胺的种类，从而判断菌株的氨基酸脱羧酶活性。二、厌氧乳酸菌的检测
1、准确称取色胺、2-苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺和精胺的标准品各50mg， 用0. 4mol/L的高氯酸(HClO4)定容到50mL，配成lmg/mL储备液备用。分别取以上标准品储备液，用 0. 4 mol/LHC104 配制成质量浓度分别为 2. 5Pg/mL、5. OPg/mLUO. (^g/mL、25. 0μδ/ mL、5(^g/mL、lOOPg/mL的生物胺混合标准溶液。将制得的不同浓度的生物胺混合标准溶液分别加入500μ 0. 25mol/L的Na2HP04、 50μ 4mol/L的NaOH和ImL 2. 5mg/L的丹磺酰氯溶液，在离心管外边包上锡箔纸避光，放入到55°C水浴锅中避光衍生lh，取得标准生物胺的衍生样品，然后将标准生物胺的衍生样品置于4°C避光保存备用。2、无菌条件下从每只盐水鸭中取5g鸭脖和鸭翅肉，15g鸭胸肉，IOg鸭腿肉及IOg 鸭背肉，共40克混合捣碎，每个盐水鸭的鸭肉作为一个试验样品。无菌条件下取25 g样品加入225mL灭菌生理盐水(含lg/L蛋白胨、9g/LNaCl)摇床振摇30min。取1 mL上清液依次进行10倍梯度稀释，选择合适的稀释度涂布于乳酸菌选择性培养基(MRS)中，于30°C厌氧培养48h，挑选特征性菌落进行划线分离，然后将纯化好的菌落接种到MRS液体培养中， 30°C培养12h，取得菌株发酵液。3、分别称取0. Ig的L-赖氨酸盐酸盐、L-酪氨酸二钠盐、L-苯丙氨酸、L-组氨酸盐、L-精氨酸、L-鸟氨酸盐酸盐和L-色氨酸，并分别加入到IOOmLMRS液体培养基中灭菌， 取得含有氨基酸的MRS液体培养基。将步骤2培养好的菌株发酵液按照1%接种量接种到含有氨基酸的MRS液体培养基中，30°C培养4到6天，取得发酵液。4、将步骤3获得的发酵液低温下IOOOOrpm离心5min，分别取无菌体的上清 500μ ，再加入 500μ 0. 25mol/L 的 Νει2ΗΡ04、50μ 4mol/L 的 NaOH 禾口 ImL 2. 5mg/L 的丹磺酰氯溶液，在离心管外边包上锡箔纸避光，放入到55°C水浴锅中避光衍生Ih得到腐败菌生物胺的衍生样品，然后将腐败菌生物胺的衍生样品置于4°C避光保存。5、预先配好由氯仿、乙醚和三乙胺以体积比例为8 1 2混合成的展开液。先将G60硅胶板(5cm*10cm)在105°C下活化lh。将配好的25mL展开剂倒入展开缸中预饱和0.证。使用自动点样台点样，取步骤4 和步骤1分别制成的样品分别上样，上样量为2PL，间隔1. 5cm，待样点干燥后，置入展开槽内，待展开剂扩展到距样点17cm处取出，通风厨内干燥，在366nm紫外灯下观察，然后使用自动凝胶成像分析分别拍照。通过比对，根据Rf值确定菌株发酵液中生物胺的种类，从而判断菌株的氨基酸脱羧酶活性。图1至5的分析
图1为不同浓度的生物胺混合标样的TLC检测结果，其中，泳道1到6代表混合标样中各生物胺浓度分别为 0. 5Pg/mL、l. 0Pg/mL、2. 0Pg/mL、5. OPg/mLUO. OPg/mL 和 20. OPg/mL， 上样量为2PL。腐胺(Put)；尸胺(Cad)；亚精胺(Spd)；精胺(Spm)；酪胺(Tyr) ；2-苯乙胺 (Phe)0由图1可见当展开剂氯仿、乙醚、三乙胺比例为8 1 2时，可以将这8种生物胺较为明显的分离出来。每个生物胺的检测限值不同，腐胺的检测限值最低。图2为部分单一生物胺标准品的TLC分析结果，其中，1为腐胺(Put) ；2为尸胺 (Cad);3为亚精胺(Spd);4为精胺(Spm);5为酪胺(Tyr);6为2-苯乙胺(Phe)。各单标质量浓度为5(^g/mL，上样量为2PL。由酪胺的标准品检测也可知，酪胺检测后存在两个亮点。由图2可见当展开剂氯仿、乙醚、三乙胺比例为8:1:2时的单一生物胺标准品的薄层层析分析结果，通过该结果可以确定各生物胺表示的亮点所处的位置。图3为品中生物胺的检测结果，从1到6分别对应的是6株乳酸菌发酵液中生物胺的检测结果。由图3可见通过比对Rf值，确定样品1和样品3分别含有酪胺和苯乙胺，判断菌株具备酪氨酸脱羧酶活性和苯丙氨酸脱羧酶活性；样品4和5含有酪胺，判断菌株具备酪氨酸脱羧酶活性；而样品2和6不含有生物胺，判断菌株不具备氨基酸脱羧酶活性。其中样品2和6中存在的亮点为发酵液其他物质的干扰。通过HPLC对处理液中的生物胺进行检测，验证了本发明获得的结果。图4为样品1生物胺处理液的HPLC检测结果。由图4可见利用高效液相方法，采用C18谱柱柱，以乙腈和水为流动相梯度洗脱对样品1生物胺处理液进行检查，检测到了酪胺和苯乙胺，验证了图3薄层层析的检测结图5样品4生物胺处理液的HPLC检测结果。由图5可见利用高效液相方法，采用C18谱柱柱，以乙腈和水为流动相梯度洗脱对样品4生物胺处理液进行检查，检测到了酪胺，验证了图3薄层层析的检测结果。
权利要求
1.一种检测食品中腐败菌氨基酸脱羧酶活性的方法，其特征在于包括以下步骤1)从食品中分离出腐败菌，经发酵取得菌株发酵液，将菌株发酵液按照1%接种量接种到含有氨基酸的液体培养基中，取得生物胺检测用腐败菌发酵液，再通过离心取得无菌体的上清，在上清和生物胺混合标准溶液中分别加入Na2HPCV NaOH和丹磺酰氯溶液，然后在 55°C水浴避光条件下分别取得腐败菌生物胺的衍生样品和标准生物胺的衍生样品；2)将G60硅胶板在105°C下活化；3)将由氯仿、乙醚和三乙胺混合制成的展开剂预饱和；4)使用自动点样台点样，腐败菌生物胺的衍生样品和标准生物胺的衍生样品的上样量为2PL，间隔1.5cm，待样点干燥后，置入展开槽内，待展开剂扩展到距样点17cm处取出，通风厨内干燥，在366nm紫外灯下使用自动凝胶成像分析分别拍照，通过比对，根据Rf值确定样品中生物胺的种类，判断菌株的氨基酸脱羧酶活性。
2.根据权利要求1所述检测食品中腐败菌氨基酸脱羧酶活性的方法，其特征在于所述含有氨基酸的液体培养基是将L-赖氨酸盐酸盐、L-酪氨酸二钠盐、L-苯丙氨酸、L-组氨酸盐、L-精氨酸、L-鸟氨酸盐酸盐和L-色氨酸加入选择性培养基中灭菌取得，其中每IOOOmL 选择性培养基中加入的L-赖氨酸盐酸盐、L-酪氨酸二钠盐、L-苯丙氨酸、L-组氨酸盐、 L-精氨酸、L-鸟氨酸盐酸盐和L-色氨酸分别为lg。
3.根据权利要求1所述食品中腐败菌氨基酸脱羧酶活性的方法，其特征在于所述生物胺检测用腐败菌发酵液的取得方法是将筛选好的菌株的在培养基中划线培养，等单菌落长出后挑选单菌落到不含氨基酸前体的液体培养基中，培养1 后，再按照1%接种量转接到含有氨基酸的液体培养基中培养4飞天后获得。
4.根据权利要求1所述检测食品中腐败菌氨基酸脱羧酶活性的方法，其特征在于将生物胺检测用腐败菌发酵液在低温条件下IOOOOrpm离心5min，取无菌体的上清，并将该上清500μ 和生物胺混合标准溶液分别与500μ 0. 25mol/L的Na2HPO4, 50μ 4mol/L的 NaOH, ImL 2. 5mg/L的丹磺酰氯溶液加入离心管，然后在离心管外边包上锡箔纸避光，放入到55°C水浴锅中避光衍生lh，分别取得腐败菌生物胺的衍生样品和标准生物胺的衍生样品，并将分别取得腐败菌生物胺的衍生样品和标准生物胺的衍生样品置于4°C保存。
5.根据权利要求1所述检测食品中腐败菌氨基酸脱羧酶活性的方法，其特征在于所述氯仿、乙醚和三乙胺的混合投料体积比为8 1 2。
全文摘要
一种检测食品中腐败菌氨基酸脱羧酶活性的方法，属农产品技术领域，先从食品中分离出腐败菌，经发酵取得菌株发酵液，再接种到含有氨基酸的液体培养基中，取得生物胺检测用腐败菌发酵液，再通过离心取得无菌体的上清，在上清和生物胺混合标准溶液中分别加入Na2HPO4、NaOH和丹磺酰氯，在水浴避光条件下分别取得腐败菌生物胺的衍生样品和标准生物胺的衍生样品；经点样干燥后，置入展开槽内，待展开剂扩展到距样点17cm处取出干燥，然后在紫外灯下使用自动凝胶成像分析分别拍照，通过比对，根据Rf值确定样品中生物胺的种类，判断菌株的氨基酸脱羧酶活性。本发明方便快捷，成本较低，可以准确实现对生物胺的定性检测。
文档编号G01N21/84GK102297864SQ20111013947
公开日2011年12月28日 申请日期2011年5月27日 优先权日2011年5月27日
发明者刘芳, 徐为民, 王道营, 诸永志, 陆鹏 申请人:江苏省农业科学院