专利名称：一种赖氨酸含量的测定方法
技术领域：
本方法涉及化学分析技术，具体涉及一种采用流动注射技术与紫外分光光度法联用以流动注射技术进样，用紫外分光光度法进行赖氨酸样品的定量分析。该方法不仅可用于食品、饲料及制药行业中的赖氨酸测定，更适合于赖氨酸及其相关产品生产过程中赖氨酸的在线监测及质量控制。
背景技术：
赖氨酸是人体和动物必需的一种碱性氨基酸，能促进发育、增强免疫功能，并有提高中枢神经组织功能的作用。由于谷物食品中的赖氨酸含量甚低，且在加工过程中易被破坏而缺乏，故称为第一限制性氨基酸。鉴于上述原因，赖氨酸广泛应用于食品、饲料及制药行业。在制药行业中主要作为营养剂及作为合成其它产品的原料或中间体，如与阿司匹林反应生成解热镇痛药赖氨匹林
坐寸ο随着赖氨酸的广泛应用，在生产应用中，必须采用科学有效的方法对赖氨酸进行监测。同时，从工业角度出发，特别是涉及含赖氨酸中间体的检测，还要求方法具有分析速度快，容易操作维护并且分析费用低廉的要求。目前，测定赖氨酸的方法有高效液相色谱法，高氯酸滴定法，茚三酮显色法及氨基酸分析仪法。其中，高效液相色谱法由于需进行柱前衍生，操作繁琐耗时，方法重现性欠佳，且仪器维护不方便，分析成本高；高氯酸滴定法要求样品在无水环境下进行，不适合进行含水产品中间体控制；茚三酮显色法与高效液相色谱法一样存在着操作繁琐耗时的弊端；氨基酸分析仪需专门仪器，成本过高，不适合于工艺在线监控。流动注射分析技术(FIA)是丹麦科学家于1974年创立的一项新的流动分析技术，是溶液自动在线处理及测定的现代分析技术。流动注射分析技术已经广泛应用于环境监测、医药和临床化验、工业在线分析等领域，同时也应用于化学反应动力学机理、络合物的形成过程及生化反应等理论研究。它所具有分析速度快，准确度和精密度高，设备和操作简单，通用性强，试样和试剂用量少等一系列优点，使得这一新兴分析技术特别适合于工艺在线监控及快速分析。本方法将流动注射技术与紫外分光光度法联用进行赖氨酸的检测，分析速度快，可达40样/小时，完全可以满足大批量特别是含赖氨酸中间体反应的监控要求。并且方法操作简便，仪器维护方便，同时由于方法的高通量，使得分析成本较其他方法显著降低，可用于工业化监控。并且，由于流动注射整套检测所需仪器紧凑简单的特点，本方法可用于涉及赖氨酸生产过程中的在线检测。流动注射技术所带来的连续进样技术，紫外分光光度法快速分析所带来的高通量，使得本方法特别适合于涉及赖氨酸工业生产中的在线、原位及实时监控，因而具有很高的应用前景。
发明内容
本发明提供了一种流动注射与紫外分光光度法联用测定赖氨酸含量的新方法。本发明提供了一种采用单通道流动注射技术和紫外分光光度法对赖氨酸进行定量分析的方法，流路图见图I。酸性缓冲盐介质作为载流以恒定流速流过紫外检测器形成基底响应。一定体积样品注射入载流中，并与载流混合后到达检测器，从而改变检测器的响应信号。由于样品引入载流的注射方法，样品在系统中的分散及与载流在系统中的混合，样品到达检测器的时间均可严格精确控制，故可对样品进行定量分析检测。为实施本发明的测定方法，所需设备包括进样系统、紫外检测器，以及对整个分析过程参数设置、试验数据采集及处理的自动化软件系统。所述的进样系统可采用仪器分析常规的进样系统，如HPLC的进样系统，也可采用流动注射进样系统。本发明检测的样品为含赖氨酸的食品、药品、合成中间体、饲料等，特别是含赖氨酸的药品及合成中间体。对照品用载流配制；样品溶液可直接进样，也可用载流稀释后进样分析。具体的，本发明的赖氨酸含量测定方法包括I)在包括有进样系统、紫外检测器的检测系统和可进行整个分析过程参数设置、试验数据采集及处理的自动化软件系统的分析仪器中(见图I);2)以酸性缓冲液为载流，酸性缓冲液选用pH为2. O 4. O的磷酸盐、醋酸盐、枸橼酸盐或其混合物的缓冲液等，缓冲液浓度为O. 01mol/L O. 2mol/L ；3)用紫外检测器进行检测，紫外检测波长为210±5nm ；4)用外标法绘制标准曲线以峰面积计算样品中赖氨酸含量。本发明人对选用O. 05mol/L的醋酸钠缓冲盐溶液(pH3. O)进行了以下因素考察I)流速影响在流动注射中，流速过慢，使得样品进样后扩散严重，经过检测器时，由于扩散被稀释，响应降低；流速过快，样品在检测器中驻留时间过短，响应降低。考察
0.2ml/min I. Oml/min流速,均可满足检测需要。试验发现，流速在O. 5ml/min L Oml/min范围内较好流速低于O. 5ml/min虽然峰高和峰面积较高,但是由于流速过低，扩散严重，更关键的是低流速增加了分析时间，降低了分析速度，影响了分析通量；流速大于
1.Oml/min时，在检测器中停留时间太短，响应低，对检测的灵敏度有影响(见图2)。综上,0.2ml/min 2. Oml/min 流速可满足检测,但优选 O. 5ml/min I. Oml/min,最优选O. 5ml/min，可在I. 5min内完成一次检查，既保证了分析速度，又兼顾了检测灵敏度。2)进样体积考察了 I 100 μ I进样体积对I. Omg/ml对照品溶液的峰高和峰面积影响(见图3)。在考察范围内，峰面积和进样量呈正比，但峰高在进样体积大于20ul后与进样体积不成线性。本发明以峰面积计算含量，样品的进样体积1-100μ I均可满足检测，优选1-20 μ 1，最优选20 μ I。3)线性范围在上述最佳条件下，测定了赖氨酸浓度与峰面积和赖氨酸浓度与峰高关系。结果表明，赖氨酸浓度在O. 0001 10mg/ml浓度范围内，与峰面积(见图4)和峰高(见图5)有良好线性关系。同时鉴于进样体积与峰面积有更好的线性关系(图3)，最终采用峰面积进行计算。
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浓度与峰面积回归方程为Y= 605. 7707Χ+50. 2117，R2 = O. 9994 ；浓度与峰高回归方程为Υ= 93. 9984Χ+7. 7479，R2 = O. 9994 ；4)精密度0. 0001mg/ml对照品溶液连续进样5次，峰面积和峰高的RSD分别为7. 87%和 7. 48% ；I. Omg/ml对照品溶液连续进样5次，峰面积和峰高的RSD分别为O. 55 %和O. 56%。5)定量限及检测限以10倍信噪比对应的浓度为定量限，得定量限浓度为O. 00002mg/ml ;以3倍信噪比对应的浓度为检测限，得检测限浓度为O. 000006mg/mL·本方法采用自动进样，工作站智能处理数据，分析一个样品仅仅需要I. 5分钟，与柱前衍生HPLC法分析一个样品需要40分钟相比，本方法分析时间更短，效率提高25倍。且本方法的赖氨酸在O. 0001 10mg/ml浓度范围内呈现良好线性，检测限浓度满足检测要求，精密度良好，因此对工厂生产中含赖氨酸的中间体检测，可快速知晓结果，方便下步工序投料，从而提高企业效率，降低企业成本。结合流动注射结构简单的特点，可用于涉及赖氨酸样品的实时，原位及无损监控。如食品、饲料及制药行业中的赖氨酸测定；赖氨酸及其相关产品生产过程中的在线监测及质量控制。
图I是流动注射检测赖氨酸含量的装置流路图。图2是载液流速对峰高、峰面积影响。
图3是赖氨酸溶液进样体积对峰高、峰面积影响。图4是赖氨酸溶液浓度-峰面积线性关系。
图5是赖氨酸溶液浓度-峰高线性关系。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明进行具体的描述。由技术常识可知，本发明可以通过其他的不脱离其精神实质或必要特征的实施方案来实现。因此，下列实施方案，就各方面而言，都只是举例说明，并不是仅有的。所有在本发明范围内或等同本发明的范围内的改变均被本发明包含。I、仪器及试剂I)仪器Agilent 1200HPLC，其中包括泵，自动进样器及紫外检测器，使用长度20cm,内径O. 17mm毛细管连接进样器出口至检测器入口。整个分析过程的采样，进样及数据采集和处理，均由Windows XP系统下的Chemstation工作站完成。2)试剂本试验样品赖氨酸样品溶液为合成赖氨匹林的中间体。pH2. O磷酸缓冲盐溶液称取磷酸氢二钠适量，制成浓度为O. Olmol/L水溶液，并用磷酸调节pH至2. O。pH3. O醋酸缓冲盐溶液称取醋酸钠适量，制成浓度为0. 05mol/L水溶液，并用醋酸调节pH至3. O。pH4. O枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲盐溶液取枸橼酸21. Og (或无水枸橼酸19. 2g)加
5水溶解至1000ml，71. 63g磷酸氢二钠加水至1000ml。上述两种溶液分别以61. 45 38.55
比例混合即得。所用试剂均为分析纯，水为纯化水。2、实验方法设定输液泵流速O. 5ml/min ;进样量20 μ I ;紫外检测器检测波长为210nm ;数据采集时间为I. 5分钟；开机并使基线稳定。用载流配制对照品线性溶液进样检测；样品溶液直接进样检测。如样品溶液超出线性范围，则需用载流稀释后再进样检测。对照品及样品分析完毕后，用外标法以峰面积进行定量分析计算求得样品溶液中赖氨酸含量。实施例I以PH2. O磷酸缓冲盐溶液为载流，采用上述实验方法，测得样品溶液中赖氨酸的含量，其结果为55.9%。实施例2以pH3. O醋酸缓冲盐溶液为载流，其余条件与实施例I相同，样品溶液中赖氨酸的含量为56. 3%。实施例3以pH4. O枸橼酸缓冲盐溶液为载流，其余条件与实施例I相同，样品溶液中赖氨酸的含量为56. 5% ο实施例4 (对比实施例)柱前衍生HPLC测样品溶液中赖氨酸含量柱前衍生HPLC方法采用安捷伦公司的氨基酸分析包方法衍生化试剂硼酸盐缓冲液，FMOC试剂OPA试剂(均购自安捷伦公司)；色谱柱安捷伦zorbax eclipse-AAA, 4. 6 X 150mm, 5 μ m ;结果实施例I, 2，3用三种缓冲盐溶液分别测定了赖氨匹林中间体中赖氨酸含量，与柱前衍生HPLC方法测得的结果相比并无明显差别，结果见下表。
实施例I实施例2实施例3实施例455. 9%56. 3%56. 5%55. 3%
权利要求
1.一种赖氨酸含量的测定方法，该方法包括，联用流动注射与紫外分光光度法，以PH2. O 4. O酸性缓冲盐溶液为载流，载流流速为O. 2ml/min 2. Oml/min,在包括有进样系统、紫外检测器和带有参数设置、试验数据采集及处理的自动化软件系统的分析仪器中检测，检测波长为210±5nm，用外标法绘制标准曲线以峰面积计算样品中赖氨酸含量。
2.根据权利要求I所述测定方法，其中所述的进样系统选自HPLC的进样系统，或流动注射进样系统，进样体积为I 100 μ I。
3.根据权利要求2所述测定方法，进样体积为I 20μ I。
4.根据权利要求I所述测定方法，紫外检测器的检测波长为210nm。
5.根据权利要求I所述测定方法，所述缓冲盐溶液选自磷酸盐、醋酸盐和枸橼酸盐溶液，浓度 O. Olmol/L O. 2mol/L。
6.根据权利要求I所述测定方法，所述载流的流速为O.5ml/min I. Oml/min。
7.根据权利要求I所述测定方法，所述进样系统采用HPLC进样系统，进样体积为I 20 μ I ;以ρΗ2· O 4. 0，浓度为O. 01mol/L O. 2mol/L的缓冲盐溶液为载流，流速O. 5ml/min ;紫外检测器的检测波长为210nm ;用外标法绘制标准曲线以峰面积计算样品中赖氨酸含量。
8.按照权利要求1-7任意一项所述的测定方法在赖氨酸含量测定中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种赖氨酸含量的测定方法，采用流动注射技术进样，紫外分光光度法测定样品中赖氨酸的含量。该方法分析速度快，通量高，精度及准确度好。本发明不仅可用于食品、饲料及制药行业中的赖氨酸测定，更适合于赖氨酸及其相关产品生产过程中赖氨酸的在线监测及质量控制。
文档编号G01N21/33GK102928374SQ20111023103
公开日2013年2月13日 申请日期2011年8月12日 优先权日2011年8月12日
发明者沈祥, 裴东, 谭俊杰 申请人:重庆药友制药有限责任公司