专利名称：一种AFP-IgM检测试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明涉及一种AFP-IgM检测试剂盒及检测方法。
背景技术：
肝细胞癌Ofepatocellular carcinoma，HCC)是常见的恶性肿瘤之一，每年在世界范围内约有100万新发的病例。其主要诱因为乙型(中国与东南亚地区)和丙型(欧洲) 肝炎病毒，早期缺乏典型的临床表现、恶性程度高，难以早期诊断，且预后较差。甲胎蛋白(AFP)在肝癌病人体内以两种形式存在即游离AFP(fAFP)和循环IgM 复合型AFP(AFP-IgM IC)。游离AFP又根据对植物凝集素(lectin)亲和力的不同分为 AFP-LU AFP-L2、AFP-L3三个亚型，其中AFP-L3可作为衡量肝癌细胞恶性程度的一个标志物。AFP作为诊断HCC的首选肿瘤标志物，在肝癌的诊断方面占据着主要的地位，自应用于临床以来使HCC诊断的准确性得到较大的提高，文献报道其敏感性为41 % 65 %，但也易受如慢性肝炎、肝硬化与妊娠等其他因素影响。对于早期HCC的诊断，AFP假阴性率可达 40%以上，进展期AFP的假阴性率为15% 20%，如何提高肝癌临床检出率是提高其生存率的关键因素。AFP-IgM复合物是近年发现的新型肝癌标志物，AFP-IgM与AFP之间存在很好的互补性。游离AFP和循环IgM复合型AFP不会发生交迭，AFP-IgM是一种补充血清标志物，两类标志物的联合检测有助于肝癌的诊断。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提高肝癌检出率。为此本发明提供了一种AFP-IgM检测试剂盒及检测方法，使用该试剂盒同时联合现有AFP检测技术能提高肝癌诊断准确度。本发明提供了一种检测患者体内AFP-IgM含量的试剂盒，包括下列试剂作为标准品的人免疫球蛋白IgM、作为标准品包被抗体的抗IgM抗体、作为检测样品包被抗体的抗 AFP抗体、作为酶标记检测抗体的抗IgM辣根过氧化物酶标记物(IgM-HRP)、作为显色剂的四甲基联苯胺溶液(TMB)、作为终止液的2M 溶液、包被缓冲液、洗涤缓冲液、稀释缓冲液。作为优选，标准品包被抗体IgM抗体为羊抗人IgM多克隆抗体，0. 2 μ g/ml，0. 3mL·作为优选，检测样品包被抗体抗AFP抗体为鼠抗人AFP单克隆抗体，0. 2 μ g/ml, 0. 3ml。作为优选，抗IgM辣根过氧化物酶标记物为兔抗人辣根过氧化物酶标记物， 0. 5mg/L,0. Iml。作为优选，包被缓冲液为PH9. 6 0. 05M碳酸盐缓冲液。该缓冲液可由Na2CO3 1. 59 克NaHC032. 93克，加蒸馏水至1000ml，调PH至9. 6制得。作为优选，洗涤缓冲液为PH7. 40. 15M磷酸盐缓冲溶液。该溶液可由KH2PO4 0.2 克、Nei2HPO4 · 12H20 2. 9 克、NaCl 8. 0 克、KCl 0. 2 克、0. 05% Tween-20 0. 5ml、加蒸溜水至1000ml，调 PH 至 7. 4 制得。作为优选，稀释缓冲液为牛血清白蛋白(BSA)与洗涤缓冲溶液配成质量分数 0. 1% (g/ml)使用或以羊血清、兔血清血清与洗涤缓冲溶液配成质量分数5 10% (g/ml) 使用。作为优选，四甲基联苯胺溶液可由2mg/ml四甲基联苯胺无水乙醇溶液0. 5ml、 PH5. 0底物缓冲液IOml、0. 75 % H2O2 32 μ 1制得，其中ΡΗ5. 0底物缓冲液可由0. 2Μ Na2HP0425. 7ml、0. IM 柠檬酸 24. 3ml，加蒸馏水 50ml 制得。本发明提供了一种使用上述试剂盒检测患者体内体内AFP-IgM含量的方法，具体方法是第一步包被(2)标准品孔用IgM抗体包被于酶标板孔内；(2)检测孔用AFP抗体包被于酶标板孔内；第二步洗涤酶标板孔，移去包被液；第三步通过倍比稀释建立标准品浓度梯度，标准品孔分别加入各个浓度的人免疫球蛋白IgM标准品；样品孔加入稀释的血清或血浆被检标本；并建立阴性、阳性对照，阴性对照为稀释缓冲液，阳性对照为阳性血清；37°C作用2小时，IgM标准品与包被的IgM抗体结合，被检标本中AFP及AFP-IgM与包被的AFP抗体结合；第四步洗涤酶标板孔，将未结合的多余样品去除；第五步每个凹孔加入兔抗人IgM辣根过氧化物酶标记物溶液，与复合物的IgM端
结合；第六步洗涤酶标板孔，去除多余的抗IgM-HRP ；第七步加入底物四甲基联苯胺溶液于每个凹孔，显色；第八步每个凹孔加终止剂；第九步观察记录结果，在450nm波长下用酶标仪测定OD值；第十步计算检测样品中AFP-IgM浓度，通过倍比稀释建立标准品浓度拟合曲线 y = ax+b, χ为标准品OD值，y为标准品浓度，获得a、b值；测得待测样品OD值为xl，则可计算待测样品浓度yi = aXl+b。作为优选，AFP-IgM含量的检测方法是第一步包被(1)标准品孔包被用包被缓冲液稀释羊抗人IgM多克隆抗体至0. 2 μ g/ml，96孔酶标板的凹孔加0. 3ml，4°C过夜，或37°C水浴3小时，贮存冰箱；(2)检测孔包被用包被缓冲液稀释鼠抗人AFP单克隆抗体至0. 2 μ g/ml，96孔酶标板的凹孔加0. 3ml，4°C过夜，或37°C水浴3小时，贮存冰箱；第二步每凹孔用洗涤缓冲液洗3次，每次5分钟，移去包被液；第三步通过倍比稀释建立标准品浓度梯度，为0μ g/L、2l·! g/L、4l·! g/L、8l·! g/L、 16μ g/L、32y g/L，标准品孔包括6孔，分别加入0. Iml各浓度的人免疫球蛋白IgM标准品， 于第五、第六孔各加浓度为32 μ g/L的标准品0. Iml ；样品孔加入0. Iml 5倍稀释血清或血浆被检标本；并建立阴性、阳性对照，阴性对照为稀释缓冲液，阳性对照为阳性血清；37°C 作用2小时；
血清或血浆被检标本5倍稀释一方面，降低了标本中其它因子的浓度，避免其对实验的干扰，增加试剂的特异性；另一方面，可使试剂与标本中的抗体/抗原达到最佳反应浓度，提高试剂的灵敏度，根据AFP-IgM在血清中的含量确定大概的稀释度。第四步每凹孔用洗涤缓冲液洗3次，每次5分钟，将未结合的多余样品去除；第五步加入酶标抗体，每凹孔加入0. Iml用稀释缓冲液稀释的兔抗人IgM辣根过氧化物酶标记物溶液，浓度为0. 5mg/L，37°C作用1小时；第六步每凹孔用洗涤缓冲液洗3次，每次5分钟，去除多余的抗IgM-HRP ；第七步加入0. Iml底物四甲基联苯胺溶液于每个凹孔，室温作用30分钟；第八步加终止剂，每凹孔加2M H2SO4O. 05ml ；第九步观察记录结果，在450nm波长下用酶标仪测定OD值；第十步计算检测样品中AFP-IgM浓度，通过倍比稀释建立标准品浓度拟合曲线 y = ax+b, χ为标准品OD值，y为标准品浓度，获得a、b值；测得待测样品OD值为xl，则可计算待测样品浓度yi = aXl+b。当血清中AFP-IgM含量大于等于25ug/L，可诊断为肝癌。通过ROC曲线对AFP-IgM 诊断肝癌的敏感度、特异度及准确度进行分析；不同参考值对应不同的敏感度、特异度以及准确度；根据不同的诊断目的并结合诊断效率确定参考值；确定25ug/L作为参考值是考虑了用该参考值诊断效率接近最高，并且敏感度较高，能与AFP形成互补。本发明的技术效果为，本发明的AFP-IgM试剂盒对肝癌的诊断较AFP试剂盒具有更高的敏感度，AFP-IgM更适合人群中肝癌的筛检实验，同时联合AFP-IgM试剂盒、AFP试剂盒对肝癌进行诊断将会提高对肝癌诊断准确度，两者具有很好的互补性。
图1 酶标抗体浓度曲线图2 AFP-IgM诊断肝癌ROC曲线
具体实施例方式实施例1试剂盒的使用方法第一步包被(1)标准品孔包被用包被缓冲液稀释羊抗人IgM多克隆抗体至0. 2 μ g/ml，96孔酶标板的凹孔加0. 3ml，4°C过夜，或37°C水浴3小时，贮存冰箱；(2)检测孔包被用包被缓冲液稀释鼠抗人AFP单克隆抗体至0. 2 μ g/ml，96孔酶标板的凹孔加0. 3ml，4°C过夜，或37°C水浴3小时，贮存冰箱；第二步每凹孔用洗涤缓冲液洗3次，每次5分钟，移去包被液；第三步通过倍比稀释建立标准品浓度梯度，为0μ g/L、2l·! g/L、4l·! g/L、8l·! g/L、 16μ g/L、32y g/L，标准品孔包括6孔，分别加入0. Iml各浓度的人免疫球蛋白IgM标准品， 于第五、第六孔各加浓度为32 μ g/L的标准品0. Iml ；样品孔加入0. Iml 5倍稀释血清或血浆被检标本；并建立阴性、阳性对照，阴性对照为稀释缓冲液，阳性对照为阳性血清；37°C 作用2小时；第四步每凹孔用洗涤缓冲液洗3次，每次5分钟，将未结合的多余样品去除；
第五步加入酶标抗体，每凹孔加入0. Iml用稀释缓冲液稀释的兔抗人IgM辣根过氧化物酶标记物溶液，浓度为0. 5mg/L，37°C作用1小时；第六步每凹孔用洗涤缓冲液洗3次，每次5分钟，去除多余的抗IgM-HRP ；第七步加入0. Iml底物四甲基联苯胺溶液于每个凹孔，室温作用30分钟；第八步加终止剂，每凹孔加2M H2SO4 0. 05ml ；第九步观察记录结果，在450nm波长下用酶标仪测定OD值；第十步计算检测样品中AFP-IgM浓度，通过倍比稀释建立标准品浓度拟合曲线 y = ax+b, χ为标准品OD值，y为标准品浓度，获得a、b值；测得待测样品OD值为xl，则可计算待测样品浓度yi = aXl+b。包被缓冲液为PH9. 6 0. 05M碳酸盐缓冲液。该缓冲液可由Na2CO3 1. 59克NaHCO3 2. 93克，加蒸馏水至1000ml，调PH至9. 6制得。洗涤缓冲液为PH7. 40. 15M PBS 溶液。该溶液可由 KH2PO4O. 2 克、Na2HPO4 · 12H20 2. 9 克、NaCl 8.0 克、KCl 0.2 克、0.05% Tween-200· 5ml、加蒸溜水至 1000ml，调 PH 至 7. 4制得。稀释缓冲液为牛血清白蛋白(BSA)与洗涤缓冲溶液配成质量分数0. 1% (g/ml)使用或以羊血清、兔血清等血清与洗涤缓冲溶液配成质量分数5 10% (g/ml)使用。四甲基联苯胺溶液可由2mg/ml四甲基联苯胺无水乙醇溶液0. 5ml、PH5. 0底物缓冲液 lOml.O. 75% H2O2 32 μ 1 制得，其中 ΡΗ5. 0 底物缓冲液可由 0. 2Μ Na2HP0425. 7ml、0. IM 柠檬酸24. :3ml，加蒸馏水50ml制得。使用的人免疫球蛋白IgM购自北京赛驰生物科技有限公司，产品编号009016，羊抗人IgM多克隆抗体购自北京赛驰生物科技有限公司，产品编号020003，鼠抗人AFP单克隆抗体购自上海博耀生物科技有限公司，兔抗人IgM辣根过氧化物酶标记物购自北京赛驰生物科技有限公司，产品编号030018。实施例2包被抗体浓度的确定用不同的抗体浓度0.01、0. 1,1. OUOy g/ml等进行包被后，分别按照实施例第 1-9步操作，记录阳性标本的OD值，见表1、表2。表1不同浓度标准品孔包被抗体对应的OD值
羊抗人IgM多克隆抗体浓度(pg/ml)测定OD值0.010.064
0.10.18910.185100.204
表2不同浓度样品孔包被抗体对应的OD值鼠抗人AFP单克隆抗体(pg/ml)测定OD值0.010.087
0.10.24510.251100.239 选择OD值较大而抗体用量较少的浓度作为包被抗体浓度，表1、表2结果表明标准品孔和样品孔合适的包被抗体浓度均为0. 1 μ g/ml，为保证抗体的足量，取0. 2 μ g/ml为包被抗体浓度。
实施例3酶标抗体浓度的确定将IgM标准品用0. 05M PH9. 6包被缓冲液稀释为10 μ g/ml，于聚苯乙烯96孔板内加0. lml，4°C过夜，次日以洗涤缓冲液洗涤3次。原始酶标抗体浓度为0. lmg/ml，用 BSA-PBS液依次稀释成1 50,1 100，1 200，1 400，1 800，分别加入反应孔中，每个稀释度二孔，每孔0. lml，37°C孵育1小时后洗涤。然后加底物液TMB，每孔0. Iml, 37°C 10 30分钟。以2MH2S040 . 05ml终止反应。读取各孔OD值(表3)，并以OD为纵座标，结合物浓度为横座标，绘制滴定曲线(见图1)。由曲线上查得OD值为1.0左右，且曲线斜率最大时的酶标抗体稀释度，即为该标记物的工作浓度，本实验结果酶标抗体浓度取0. 5 μ g/ml。表3
稀释倍数_酶标抗体浓度(μ§/ιη1)_测定OD值
1 50 21.358
1 100 11.126
1 200 0.50.876
1 4000.250.416
1 8000.1250.259实施例4参考值的确定通过ROC曲线(图2)对AFP-IgM诊断肝癌的敏感度、特异度及准确度进行分析； 不同cutoff值对应不同的敏感度、特异度(表4)；根据不同的诊断目的并结合诊断效率确定参考值；确定25ug/L作为参考值是考虑了用该参考值诊断效率接近最高，并且敏感度较高，能与AFP形成互补。表4中约登指数=敏感度+特异度-1，25ug/L对应的cutoff值约登指数最大。表 权利要求
1.一种检测患者体内AFP-IgM含量的试剂盒，包括下列试剂作为标准品的人免疫球蛋白IgM、作为标准品包被抗体的抗IgM抗体、作为检测样品包被抗体的抗AFP抗体、作为酶标记检测抗体的抗IgM辣根过氧化物酶标记物、作为显色剂的四甲基联苯胺溶液、作为终止液的2M 溶液、包被缓冲液、洗涤缓冲液、稀释缓冲液。
2.权利要求1所述的试剂盒，特征在于标准品包被抗体IgM抗体为羊抗人IgM多克隆抗体，0. 2μ g/ml，0. 3ml。
3.权利要求1所述的试剂盒，特征在于检测样品包被抗体抗AFP抗体为鼠抗人AFP单克隆抗体，0. 2μ g/ml，0. 3ml。
4.权利要求1所述的试剂盒，特征在于抗IgM辣根过氧化物酶标记物为兔抗人辣根过氧化物酶标记物，0. 5mg/L,0. 1ml。
5.权利要求1所述的试剂盒，特征在于包被缓冲液为PH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液。
6.权利要求1所述的试剂盒，特征在于洗涤缓冲液为PH7.4 0. 15M磷酸盐缓冲溶液。
7.权利要求1所述的试剂盒，特征在于稀释缓冲液为牛血清白蛋白与洗涤缓冲液配成质量分数0. 使用或以羊血清、兔血清与洗涤缓冲溶液配成质量分数5 10%使用。
8.权利要求1所述的试剂盒，特征在于四甲基联苯胺溶液由2mg/ml四甲基联苯胺无水乙醇溶液0. 5ml、PH5. 0底物缓冲液lOml.O. 75% H2O2 32 μ 1制得，其中ΡΗ5. 0底物缓冲液由 0. 2Μ Na2HPO4 25. 7ml、0. IM 柠檬酸 24. 3ml，加蒸馏水 50ml 制得。
9.权利要求1-8任一项试剂盒检测患者体内体内AFP-IgM含量的方法，包括下列步骤第一步包被(1)标准品孔用IgM抗体包被于酶标板孔内；(2)检测孔用AFP抗体包被于酶标板孔内； 第二步洗涤酶标板孔，移去包被液；第三步通过倍比稀释建立标准品浓度梯度，标准品孔分别加入各个浓度的人免疫球蛋白IgM标准品；样品孔加入稀释的血清或血浆被检标本；并建立阴性、阳性对照，阴性对照为稀释缓冲液，阳性对照为阳性血清；37°C作用2小时，IgM标准品与包被的IgM抗体结合，被检标本中AFP及AFP-IgM与包被的AFP抗体结合； 第四步洗涤酶标板孔，将未结合的多余样品去除；第五步每个凹孔加入兔抗人IgM辣根过氧化物酶标记物溶液，与复合物的IgM端结合；第六步洗涤酶标板孔，去除多余的抗IgM-HRP ； 第七步加入底物四甲基联苯胺溶液于每个凹孔，显色。 第八步每个凹孔加终止剂；第九步观察记录结果，在450nm波长下用酶标仪测定OD值。 第十步计算检测样品中AFP-IgM浓度，通过倍比稀释建立标准品浓度拟合曲线y = ax+b, χ为标准品OD值，y为标准品浓度，获得a、b值；测得待测样品OD值为xl，则可计算待测样品浓度Y1 = aXl+b。
10.权利要求9所述的AFP-IgM含量的检测方法，其特征是包括下列步骤 第一步包被(1)标准品孔包被用包被缓冲液稀释羊抗人IgM多克隆抗体至0.2 μ g/ml，96孔酶标板的凹孔加0. 3ml，4°C过夜，或37°C水浴3小时，贮存冰箱；(2)检测孔包被用包被缓冲液稀释鼠抗人AFP单克隆抗体至0.2 μ g/ml，96孔酶标板的凹孔加0. 3ml，4°C过夜，或37°C水浴3小时，贮存冰箱；第二步每凹孔用洗涤缓冲液洗3次，每次5分钟，移去包被液； 第三步通过倍比稀释建立标准品浓度梯度，为0yg/L、2yg/L、4yg/L、8yg/L、 16μ g/L、32y g/L，标准品孔包括6孔，分别加入0. Iml各浓度的人免疫球蛋白IgM标准品， 于第五、第六孔各加浓度为32 μ g/L的标准品0. Iml ；样品孔加入0. Iml 5倍稀释血清或血浆被检标本；并建立阴性、阳性对照，阴性对照为稀释缓冲液，阳性对照为阳性血清；37°C 作用2小时；第四步每凹孔用洗涤缓冲液洗3次，每次5分钟，将未结合的多余样品去除； 第五步加入酶标抗体，每凹孔加入0. Iml用稀释缓冲液稀释的兔抗人IgM辣根过氧化物酶标记物溶液，浓度为0. 5mg/L，37°C作用1小时；第六步每凹孔用洗涤缓冲液洗3次，每次5分钟，去除多余的抗IgM-HRP ； 第七步加入0. Iml底物四甲基联苯胺溶液于每个凹孔，室温作用30分钟； 第八步加终止剂，每凹孔加2M H2SO4 0. 05ml ； 第九步观察记录结果，在450nm波长下用酶标仪测定OD值； 第十步计算检测样品中AFP-IgM浓度，通过倍比稀释建立标准品浓度拟合曲线y = ax+b, χ为标准品OD值，y为标准品浓度，获得a、b值；测得待测样品OD值为xl，则可计算待测样品浓度J1 = aXl+b。
全文摘要
本发明涉及一种检测患者体内AFP-IgM含量的试剂盒，包括下列试剂作为标准品的人免疫球蛋白IgM、作为标准品包被抗体的抗IgM抗体、作为检测样品包被抗体的抗AFP抗体、作为酶标记检测抗体的抗IgM辣根过氧化物酶标记物、作为显色剂的四甲基联苯胺溶液、作为终止液的2M H2SO4溶液、包被缓冲液、洗涤缓冲液、稀释缓冲液。本发明还涉及使用该试剂盒检测人体内AFP-IgM含量的方法。本发明的AFP-IgM试剂盒对肝癌的诊断较AFP试剂盒具有更高的敏感度，更适合人群中肝癌的筛检实验，同时联合AFP-IgM试剂盒、AFP试剂盒对肝癌进行诊断将会提高对肝癌诊断准确度，两者具有很好的互补性。
文档编号G01N33/543GK102435733SQ20111023105
公开日2012年5月2日 申请日期2011年8月12日 优先权日2011年8月12日
发明者吴昌平, 徐斌, 蒋敬庭, 陆明洋 申请人:吴昌平, 徐斌, 蒋敬庭, 陆明洋