专利名称：小反刍兽疫病毒b-ELISA抗体检测试剂盒及制备方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其是病毒抗体检测领域。
背景技术：
小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus，PPRV)对绵羊和山羊的发病率和死亡率分别高达100%和90%，在发展中国家引起严重的社会经济问题，被世界动物卫生组织(OIE)列为重要动物疾病。该病首次报道在科特迪瓦，现发生在撒哈拉以南和赤道以北的多数非洲国家，中东到土耳其的几乎全部国家，在印度、南亚、西亚也广泛传播。2007 年7月，该疫病首次传入我国西藏地区。小反刍兽疫病毒抗体检测方法，世界动物卫生组织推荐使用的方法为病毒中和试验(VN)和竞争ELISA (c-ELISA)，一般条件下能区分小反刍兽疫和牛瘟病毒血清抗体，且由于c-ELISA特异性和敏感性更高，且适合于检测大量的样品，时间周期相对较短，因此广泛应用于小反刍兽疫病毒抗体检测。小反刍兽疫c-ELISA诊断试剂盒，国内尚未见商品化的相关产品，在国际上通用的为法国BIRAD实验室研制的小反刍兽疫c-ELISA试剂盒(Libeau. et al.，1995)，该诊断试剂盒也是我国小反刍兽疫疫病的主要诊断试剂。参考文献Libeau G, Prehaud C, Lancelot R, et al. Development of a competitive ELISA for detecting antibodies to the peste des petits ruminants virus using a recombinant nucleoprotein[J]. Res Vet Sci， 1995，58，50-55。在应用法国BIRAD实验室研制的小反刍兽疫c-ELISA诊断试剂盒在国内相应疫病的调查中，我们发现此试剂盒的购买每次均需要大批量的从国外订购，无小包装，经济成本较高，其试剂盒中的底物液等均需要现配置，操作较繁琐。
发明内容
本发明的目的在于提供一种针对核蛋白的特异性单抗而研制的抗体检测试剂盒。本发明的另一目的在于提供这种抗体检测试剂盒的制备方法。本发明所述的小反刍兽疫病毒b-ELISA抗体检测试剂盒主要包括分别放置的小反刍兽疫核蛋白抗原和小反刍兽疫单克隆抗体；所述的小反刍兽疫核蛋白抗原是由昆虫细胞表达的小反刍兽疫Nigeria75/1疫苗株核蛋白，核蛋白基因序列NCBI登录号为 X74443. 2，表达蛋白分子量约61. 3 kDa,由1578bp核酸组成，编码5 个氨基酸；所述的小反刍兽疫单克隆抗体是针对小反刍兽疫Mgeria75/1株核蛋白的特异性单克隆抗体，抗体免疫球蛋白重链和轻链分子量约^ku和^ku,染色体数目约99-104条，相对亲和力指数为 1. 0 mol/L0本发明所述的小反刍兽疫病毒b-ELISA抗体检测试剂盒包括分别放置的小反刍兽疫核蛋白抗原、小反刍兽疫单克隆抗体、稀释液、强阳性血清、弱阳性血清、阴性血清、HRP 羊抗鼠二抗、20倍浓缩洗涤液、底物液、终止液和酶链免疫吸附板；所述的小反刍兽疫核蛋
4白抗原是由昆虫细胞表达的小反刍兽疫Nigeria75/1疫苗株核蛋白，核蛋白基因序列NCBI 登录号为X74443. 2，表达蛋白分子量约61. 3 kDa,由1578bp核酸组成，编码5 个氨基酸；所述的小反刍兽疫单克隆抗体是针对小反刍兽疫Mgeria75/1株核蛋白的特异性单克隆抗体，抗体免疫球蛋白重链和轻链分子量约^ku和^ku,染色体数目约99-104条，相对亲和力指数为1. 0 mol/ ；所述的稀释液配方为=NaCl 8g，KH2PO4 0. 24g, Na2HPO4 1. 44g， KCl 0. 2g，牛血清白蛋白BSA 30 g，山羊PPRV阴性、Vero细胞抗体阳性血清10 mL，加蒸馏水至1000mL。 本发明所述的小反刍兽疫病毒b-ELISA抗体检测试剂盒各组成部分的体积或数量如下
权利要求
1.一种小反刍兽疫病毒b-ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于主要包括分别放置的小反刍兽疫核蛋白抗原和小反刍兽疫单克隆抗体；所述的小反刍兽疫核蛋白抗原是由昆虫细胞表达的小反刍兽疫Nigeria75/1疫苗株核蛋白，核蛋白基因序列NCBI登录号为 父74443.2，表达蛋白分子量约61.3 kDa，由1578bp核酸组成，编码5 个氨基酸；所述的小反刍兽疫单克隆抗体是针对小反刍兽疫Mgeria75/1株核蛋白的特异性单克隆抗体，抗体免疫球蛋白重链和轻链分子量约^ku和^ku,染色体数目约99-104条，相对亲和力指数为 1. 0 mol/L0
2.一种小反刍兽疫病毒b-ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于包括分别放置的小反刍兽疫核蛋白抗原、小反刍兽疫单克隆抗体、稀释液、强阳性血清、弱阳性血清、阴性血清、HRP 羊抗鼠二抗、20倍浓缩洗涤液、底物液、终止液和酶链免疫吸附板；所述的小反刍兽疫核蛋白抗原是由昆虫细胞表达的小反刍兽疫Nigeria75/1疫苗株核蛋白，核蛋白基因序列NCBI 登录号为X74443. 2，表达蛋白分子量约61. 3 kDa,由1578bp核酸组成，编码5 个氨基酸；所述的小反刍兽疫单克隆抗体是针对小反刍兽疫Mgeria75/1株核蛋白的特异性单克隆抗体，抗体免疫球蛋白重链和轻链分子量约^ku和^ku,染色体数目约99-104条，相对亲和力指数为1. 0 mol/ ；所述的稀释液配方为=NaCl 8g，KH2PO4 0. 24g, Na2HPO4 1. 44g， KCl 0. 2g，牛血清白蛋白BSA 30 g，山羊PPRV阴性、Vero细胞抗体阳性血清10 mL，加蒸馏水至1000mL。
3.如权利要求2所述的小反刍兽疫病毒b-ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于所述的检测试剂盒各组成部分的体积或数量如下
4.权利要求1所述的小反刍兽疫病毒b-ELISA抗体检测试剂盒的制备方法由以下步骤制备一、小反刍兽疫核蛋白抗原的制备利用昆虫杆状病毒表达载体pFastBacHTA表达小反刍兽疫疫苗株Ni ger ia75/1的 N基因，在获得表达的杆状病毒后，大量感染sf9细胞，反复冻融，SOOOrpm离心，取上清， 35000rpm离心，按离心前后体积300 :1，用PBS溶解沉淀蛋白，用0. 05mol/L PH为9. 6碳酸盐缓冲液 NaHCO3 1. 465g,Na2CO3 0. 795g 或 Na2CO3. IOH2O 1. 2g、水 500mL 稀释成 2. 9 μ g/ mL，分装即得；二、小反刍兽疫单克隆抗体的制备使用纯化的小反刍兽疫病毒免疫小鼠并取免疫小鼠的脾细胞，将所述脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在融合剂下融合后筛选获得杂交瘤细胞，收集杂交瘤细胞上清液制备抗小反刍兽疫单克隆抗体。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，尤其是病毒抗体检测领域。本发明所述的小反刍兽疫病毒b-ELISA抗体检测试剂盒包括分别放置的小反刍兽疫核蛋白抗原、小反刍兽疫单克隆抗体、稀释液、强阳性血清、弱阳性血清、阴性血清、HRP羊抗鼠二抗、20倍浓缩洗涤液、底物液、终止液和酶链免疫吸附板。本发明通过实验优化，确定了试剂盒中各组分的最佳配比条件。其试剂盒可用于动物小反刍兽疫病毒抗体的快速诊断、检测，尤其适合于小反刍兽疫流行病学调查时大量样本的抗体检测。本发明的小反刍兽疫b-ELISA检测方法，检测原理、实验操作程序等均不同于BIRAD实验室的c-ELISA检测方法，试剂盒包含的小反刍兽疫核蛋白抗原、小反刍兽疫单克隆抗体均为自行研制。组装试剂盒的检测敏感性、特异性等指标均与国际认可的BIRAD实验室的c-ELISA检测方法相同。
文档编号G01N33/535GK102419369SQ20111023694
公开日2012年4月18日 申请日期2011年8月18日 优先权日2011年8月18日
发明者叶玲玲, 吕建强, 周晓黎, 孙洁, 尹尚莲, 徐维加, 徐自忠, 杨俊兴, 杨建民, 祝贺, 艾军, 花群义, 董俊 申请人:云南出入境检验检疫局检验检疫技术中心, 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心