专利名称：沙丁胺醇半定量检测试剂卡的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种沙丁胺醇半定量检测试剂卡，属于免疫学技术领域。 技术背景
沙丁胺醇，又名舒喘宁，为选择性β2受体激动剂。对动物具有促进骨骼肌(瘦肉) 生长，减少脂肪蓄积等作用。常在猪、牛、鸡等畜禽的生产中非法用作促生长剂，可提高饲料转化率、增加瘦肉产量。但是，食品中沙丁胺醇的残留能引起心悸、头疼、目眩、呼吸困难，严重影响人们的健康。另外，检测沙丁胺醇残留的技术手段也相对滞后。因此，一些不法分子为谋取经济利益，在养殖场非法使用沙丁胺醇代替“瘦肉精”克伦特罗作为促生长剂。因此， 在抓紧源头控制沙丁胺醇非法使用的同时，必须加强其安全检测。
目前，检测沙丁胺醇的方法有气相色谱-质谱联用法(GC-MS)、高效液相色谱法 (HPLC)、液相色谱-质谱联用法(LC-MS)以及酶联免疫吸附法(ELISA)等。GC-MS、HPLC和 LC-MS方法准确可靠，但样品前处理繁琐，对仪器设备以及操作过程的要求较高，不适于生产、基层单位及现场检测。ELISA检测是一种基于抗原抗体反应和酶化学反应的检测方法， 具有快速、灵敏、操作简单和一次检测样品量大的特点，而且不需要复杂昂贵的的仪器设备，对操作者的专业要求也比较低。但该方法仍需酶标仪等设备，分析时间0. 5-3小时，难以在现场采用。
为进一步优化检测方法，使对沙丁胺醇的检测更方便、时间更短、成本更低，相关单位开展了沙丁胺醇胶体金检测试纸条研究，并有“沙丁胺醇快速检测试纸条”、“ β -兴奋剂沙丁胺醇、盐酸克伦特罗、莱克多巴胺三元检测试纸条及其制备方法”的报道，报道中所描述的技术只能定性检测，且组合线只有2条，不能进行定量检测。发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种能够快速、灵敏、简便地实现对沙丁胺醇进行半定量检测的沙丁胺醇半定量检测试剂卡。
本发明解决上述技术领域采取的技术方案一种沙丁胺醇半定量检测试剂卡，其包括外壳和设置在外壳内的试纸条；所述试纸条包括基层PVC板、粘贴在所述基层PVC板中央部位的检测反应部分、分别粘贴在所述检测反应部分左、右两端的胶体金垫和吸水垫，以及粘贴在所述胶体金垫左端的样品垫；所述检测反应部分为硝酸纤维膜，其表面从左到右依次设置有两条以上包有浓度依次降低的沙丁胺醇检测用偶合抗原的检测线以及一条包被有羊抗鼠IgG的质控线，所述胶体金垫为载有胶体金标记的沙丁胺醇单克隆抗体的玻璃纤维垫，所述吸水垫为吸水棉浆板，所述样品垫为引水玻璃纤维垫；所述外壳上设置有加样孔和观测窗，所述加样孔与试纸条的样品垫相对应，所述观测窗和试纸条的检测反应部分相对应。
所述沙丁胺醇检测用偶合抗原为沙丁胺醇与蛋白质类物质采用琥珀酸酐法和碳二亚胺法形成的偶合物。
所述蛋白质类物质为牛血清白蛋白或卵清白蛋白。
所述检测线之间的距离为2.5mm。
所述检测线上包被的沙丁胺醇检测用偶合抗原的浓度大于0. 3 μ g/mL,质控线上包被的羊抗鼠IgG的浓度为0. 1 μ g/mL。
本发明沙丁胺醇半定量检测试剂卡的有益效果1、特异性强本发明试剂卡采用了高质量的抗沙丁胺醇单克隆抗体，与莱克多巴胺、 异丙肾上腺素、去甲肾上腺素、土霉素、金霉素、氯霉素、磺胺二甲嘧啶等常用兽药无交叉反应。
2、准确性好本发明试剂卡能够半定量检测。可根据实际检测需要，检测试剂卡可半定量检测试剂卡检测限以上的任何浓度范围。用本试剂卡检测结果与气相色谱-质谱联用法(GC-MS)、高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱联用法(LC-MS)等仪器方法检测结果相关性完全符合要求。
3、可操作性强本发明试剂卡根据颜色变化判断结果，无需任何仪器设备，不需专业操作人员，适合现场检测。
4、检测速度快本发明试剂卡滴入检测样品后，3-5分钟即可观察结果。
图1为本发明试剂卡的结构示意图；图2为本发明试剂卡中试剂条的结构示意图。
在附图中1观测窗、2加样孔、3质控线、4检测线、5样品垫、6胶体金垫、7检测反应部分、8吸水垫、9基层PVC板。
具体实施方式
如图1和图2所示，本发明包括外壳和设置在外壳内的试纸条；所述试纸条包括基层PVC板、粘贴在所述基层PVC板中央部位的检测反应部分、分别粘贴在所述检测反应部分左、右两端的胶体金垫和吸水垫，以及粘贴在所述胶体金垫左端的样品垫；所述检测反应部分为硝酸纤维膜，其表面从左到右依次设置有两条以上包有浓度依次降低的沙丁胺醇检测用偶合抗原的检测线以及一条包被有羊抗鼠IgG的质控线，所述胶体金垫为载有胶体金标记的沙丁胺醇单克隆抗体的玻璃纤维垫，所述吸水垫为吸水棉浆板，所述样品垫为引水玻璃纤维垫；所述外壳上设置有加样孔和观测窗，所述加样孔与试纸条的样品垫相对应，所述观测窗和试纸条的检测反应部分相对应。
本发明试剂卡的制备方法为1、沙丁胺醇偶合抗原合成采用琥珀酸酐法，将160 mg沙丁胺醇加入20 mL甲醇中，使之溶解，旋转蒸发后加入30ml无水乙醇，室温搅拌4h，充分溶解后加入90 mg琥珀酸酐，磁力搅拌使之反应72 h得沙丁胺醇琥珀酸衍生物(Sal-HS)。称取(SAL_HS)40 mg溶于4 mL Tris-Hcl缓冲液中，充分溶解后缓缓加入碳二亚胺80mg，室温搅拌过夜。取BSA 20 mg溶于Tris-Hcl缓冲液中，充分溶解后，将BSA溶液逐滴加入上述反应液中，搅拌反应过夜。反应结束后，装入透析袋透析48h，期间换液(PBS) 6 9次，即成免疫抗原(Sal- BSA )。 检测抗原(Sal -OVA)的制备同免疫抗原。3/4页
2、沙丁胺醇单克隆抗体制备选择8周龄Balb/c小鼠，初次基础免疫采用颈背部皮下多点注射福氏完全佐剂与等体积免疫原SAL-BSA ；二次基础免疫采用颈背部皮下多点注射福氏不完全佐剂与等体积免疫原SAL-BSA。免疫间隔为2周。断尾取血分离血清，间接 ELISA检测小鼠血清抗体效价。选取最佳免疫小鼠，于融合前3d腹腔注射免疫原50 yg加强免疫。取对数生长期的小鼠SP2/0骨髓瘤细胞与免疫脾细胞，按常规方法进行融合。检测培养上清抗体效价，选择强阳性细胞进行克隆，采用有限稀释法连续亚克隆，直至100 % 阳性。得到稳定分泌高特异性、高效价、高亲和力抗体的杂交瘤细胞株，保存于液氮中。将克隆及扩大培养的杂交瘤细胞注入提前致敏的Balb/c小鼠腹腔，诱生腹水产生抗SAL单克隆抗体。腹水采用辛酸硫酸铵方法进行纯化，即得沙丁胺醇单克隆抗体。
3、胶体金溶液制备取IOOmL蒸馏水，煮沸5分钟，再加入已配好的质量浓度为的氯金酸(HA μ CL4) ImL和质量浓度为的柠檬酸三钠溶液1. 5mL，继续搅拌加热，直至出现透明的橙红色为止，冷却到室温，碳酸钾调节PH至8. 4，既为待标记的胶体金溶液。
4、胶体金标记沙丁胺醇单克隆抗体制备将沙丁胺醇单克隆抗体加入到步骤3中配置好的胶体金溶液中，抗体最终浓度为1-10μ g/mL，搅拌10分钟，加入质量浓度为10% 的牛血清白蛋白封闭，10000转/分离心20分钟，取沉淀物用金标稀释液稀释至原胶体金溶液体积的10%，制备沙丁胺醇单克隆抗体胶体金标记物。
5、样品垫处理将引水玻璃纤维浸入0. 01mol/L PH7. 4的PBS溶液2_3分钟，取出，60°C烘干，即为样品垫。
6、胶体金垫的制备和处理用载体玻璃纤维吸取步骤4制备好的胶体金标记沙丁胺醇单克隆抗体溶液，干燥，即为胶体金垫。
7、检测反应部分的制备和处理沙丁胺醇包被偶合抗原用点样仪喷涂包被在检测线上，本实施例设有A、B两条检测线，检测线宽1mm，A检测线距硝酸纤维膜的左边缘6mm， A、B两条检测线之间的间距2. 5mm，A检测线包被有浓度为0. 6 μ g/mL的沙丁胺醇偶联检测抗原，B检测线包被有浓度为0.4 μ g/mL的沙丁胺醇偶联检测抗原；质控线包被有浓度为 0. 1 μ g的羊抗鼠IgG抗体1条，宽1mm。
8、吸水垫处理吸水垫室温干燥。
9、试剂卡组装取基材PVC板，依次粘样品垫、胶体金垫、检测反应部分及吸水垫， 即成沙丁胺醇半定量检测试纸条，试纸条安放在外壳内即为试剂卡。
10、检测将尿样滴入检测孔中，3-5分钟观察颜色变化。当A、B两条检测线均呈颜色时，样品为阴性；当A检测线呈色，B线不呈色时，则样品中沙丁胺醇浓度大于0. 4μ g/ mL小于0. 6 μ g/mL ；当A、B均不呈色时，则样品中沙丁胺醇浓度小于0. 4 μ g/mL。A、B检测线设定的检测限可以是大于或等于5ng/mL的某一浓度。质控线始终显色，若不显色，则表明检测试剂卡失效。
本发明试剂卡检测原理为1、胶体金试纸条检测原理样品溶液通过试纸的样品垫吸收样品至胶体金垫，胶体金垫上有胶体金标记的抗沙丁胺醇单克隆抗体，如果检测样品中含有沙丁胺醇，并且浓度超过试纸条检测限，样品中的沙丁胺醇与胶体金标记的沙丁胺醇抗体反应形成结合物，结合物继续上移到检测线，因沙丁胺醇单克隆抗体只有一个结合位点，标金抗体与样品溶液中的沙丁胺醇结合后就不能与检测线上的抗原结合，检测线不呈色，检测结果为阳性；如果检5测样品中不含沙丁胺醇，或者浓度小于试纸条检测限，胶体金标记的沙丁胺醇抗体到达检测线时就会与检测部分包被抗原结合，检测线呈色，检测结果为阴性。无论样液中沙丁胺醇抗体是否与沙丁胺醇结合，样液上移到质控线时都会被包被在此处的羊抗鼠IgG抗体捕获，呈色，为试剂卡质控线。
2、试剂卡半定量检测原理检测线包被有浓度为大于0. 3 μ g/mL的沙丁胺醇偶联检测抗原2条线A、B，宽1mm，包被浓度依次降低；质控线包被有浓度为0. 1 μ g的羊抗鼠IgG 抗体1条，宽Imm ；当A、B两条检测线均呈颜色时，样品为阴性；当A检测线呈色，B线不呈色时，则样品中沙丁胺醇浓度大于B小于A ；当A、B均不呈色时，则样品中沙丁胺醇浓度小于B。A、B设定的检测限可以是大于或等于5ng/mL的某一浓度。质控线始终显色，若不显色，则表明检测试剂卡失效。
权利要求
1.一种沙丁胺醇半定量检测试剂卡，其特征在于其包括外壳和设置在外壳内的试纸条；所述试纸条包括基层PVC板(9)、粘贴在所述基层PVC板(9)中央部位的检测反应部分 (7)、分别粘贴在所述检测反应部分(7)左、右两端的胶体金垫(6)和吸水垫(8)，以及粘贴在所述胶体金垫(6)左端的样品垫(5)；所述检测反应部分(7)为硝酸纤维膜，其表面从左到右依次设置有两条以上包有浓度依次降低的沙丁胺醇检测用偶合抗原的检测线(4)以及一条包被有羊抗鼠IgG的质控线(3)，所述胶体金垫(6)为载有胶体金标记的沙丁胺醇单克隆抗体的玻璃纤维垫，所述吸水垫(8)为吸水棉浆板，所述样品垫(5)为引水玻璃纤维垫； 所述外壳上设置有加样孔(2)和观测窗(1)，所述加样孔(2)与试纸条的样品垫(5)相对应， 所述观测窗(1)和试纸条的检测反应部分(7)相对应。
2.根据权利要求1所述的沙丁胺醇半定量检测试剂卡，其特征在于所述沙丁胺醇检测用偶合抗原为沙丁胺醇与蛋白质类物质采用琥珀酸酐法和碳二亚胺法形成的偶合物。
3.根据权利要求2所述的沙丁胺醇半定量检测试剂卡，其特征在于蛋白质类物质为牛血清白蛋白或卵清白蛋白。
4.根据权利要求1所述的沙丁胺醇半定量检测试剂卡，其特征在于所述检测线(4)之间的距离为2. 5mm。
5.根据权利要求1所述的沙丁胺醇半定量检测试剂卡，其特征在于所述检测线(4)上包被的沙丁胺醇检测用偶合抗原的浓度大于0. 3 μ g/mL，质控线上包被的羊抗鼠IgG的浓度为 ο. ι μ g/mL。
全文摘要
本发明涉及一种沙丁胺醇半定量检测试剂卡，其包括外壳和设置在外壳内的试纸条；所述试纸条包括基层PVC板、粘贴在所述基层PVC板中央部位的检测反应部分、分别粘贴在所述检测反应部分左、右两端的胶体金垫和吸水垫，以及粘贴在所述胶体金垫左端的样品垫；所述检测反应部分为硝酸纤维膜，其表面从左到右依次设置有两条以上包有浓度依次降低的沙丁胺醇检测用偶合抗原的检测线以及一条包被有羊抗鼠IgG的质控线。本发明特异性强，准确性好，可根据实际检测需要，半定量检测试剂卡检测限以上的任何浓度范围。用本试剂卡检测结果与气相色谱-质谱联用法(GC-MS)、高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱联用法(LC-MS)等仪器方法检测结果相关性完全符合要求，不需专业操作人员，适合现场检测，检测速度快。
文档编号G01N33/577GK102507944SQ20111035225
公开日2012年6月20日 申请日期2011年11月9日 优先权日2011年11月9日
发明者吴萌, 张小兵, 李亚璞, 李君华, 李春生, 程华, 董超, 闫静辉, 陈英珠, 齐颖颖 申请人:河北省科学院生物研究所