专利名称：基于五邻体蛋白的favi抗体间接elisa检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及FAVI抗体间接ELISA检测试剂盒，尤其是一种基于五邻体蛋白的FAVI 抗体间接ELISA检测试剂盒。
背景技术：
I群禽腺病毒(f0Wl adenovirus group I，FAVI)归于腺病毒科禽腺病毒属，具有共同的群抗原，基于分子结构的差异可分为5个种(FAV A-E)，基于交叉中和试验结果可分为12个血清型(FAV1-12)。该群病毒包括常规的禽腺病毒(代表株为鸡胚致死孤儿)，在世界范围内广泛存在，较多的存在于禽类体内，而不发病。虽然FAVI不是引起发病的重要病原，但可与其他病原共同作用于家禽，具有继发性。近年来，由FAVI引起的包涵体肝炎、 心包积液综合征和砂囊糜烂的感染呈上升趋势，在国内外引起了广泛的关注。研究表明，该病与传染性法氏囊和传染性贫血有关。此外，该病既可经卵垂直传递污染鸡胚，也可经排泄物水平传播，这给防控该病带来了巨大的困难。目前，采用普通PCR法检测FAVI临床样品，耗时费力，无法快速处理和诊断大量样品；利用血清学检测方法，如中和试验，由于存在交叉反应而不能确切诊断，且需在动物、鸡胚或组织培养细胞等活体内进行；琼脂凝胶免疫扩散由于沉淀素扩散需孵育2天，拖延了诊断时间敏感性又低。因此，快速、准确、简便的诊断是防治该病的关键，特别是寻找一种优势抗原对其诊断具有相当重要的意义，也能为FAVI抗体监测和流行病学调查提供可靠保证。五邻体、六邻体和纤维蛋白是FAVI的三个主要结构蛋白，它们共同构成病毒核衣壳。其中，每个五邻体由基底和伸出表面的一根末端有顶球的纤维组成，有助于病毒黏附于细胞表面；五邻体还可与细胞表面的病毒受体结合，在病毒感染细胞过程中起着非常重要的作用。研究表明，当腺病毒纤维蛋白太短时，五邻体通过其Arg-Gly-Asp (RGD)序列与细胞表面的整联蛋白作用，介导腺病毒的侵入和内化。同时，五邻体保守性较好，能刺激机体产生抗体中和病毒体。因此，五邻体蛋白在FAVI的致病性、诊断、预防与控制等方面具有重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种快速、准确、简便、适于大批量检测的基于五邻体蛋白的FAVI抗体间接ELISA检测试剂盒，以便于I群禽腺病毒抗体的临床检测、流行病学调查和主动免疫效果检测。为解决上述技术问题本发明采用如下技术方案基于五邻体蛋白的FAVI抗体间接ELISA检测试剂盒，包括包被酶标板、阴性标准血清、阳性标准血清、羊抗鸡IgG酶标二抗、洗涤液、稀释液、底物液和终止液，包被酶标板以I群禽腺病毒五邻体重组蛋白作为包被抗原。I群禽腺病毒五邻体蛋白由序列表SEQ. ID. No. 1的截短的五邻体基因编码。
I群禽腺病毒五邻体重组蛋白来自大肠杆菌原核表达。包被酶标板是用包被液将包被抗原稀释至1 30 μ g/mL，加入96孔酶标板， 100 μ L/孔，置于37°C温育Ih后，4°C过夜；用PBST洗板3次，拍干，用封闭液封闭酶标板， 37°C温育lh，用PBST洗板3次，拍干制得；封闭液为5%脱脂奶；包被液为pH 9. 6的碳酸盐缓冲液。羊抗鸡IgG酶标二抗是以辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡IgG。阴性标准血清是SPF鸡胚孵育所产2 5日龄雏鸡的血清；阳性标准血清是经I群禽腺病毒模拟自然感染的方式滴鼻、点眼两次后的SPF鸡血清；洗涤液是含有0. 05%吐温-20的磷酸盐缓冲液，PH为7. 4 ；稀释液是BSA;底物液是TMB-H2A溶液；终止液是2M H2SO4。磷酸盐缓冲液由NaCl 8. 0g, KCl 0. 2g，KH2PO4 0. 2g, Na2HPO4. 12H20 2. 9g，吐温-20 500uL，加蒸馏水定容至1000mL3M PH值到7. 4制成。TMB-H2O2 溶液由 TMB 缓冲液 10ml、TMB 溶液 0. 5ml、H2O2 32ul 组成；TMB 缓冲由 Na2HPO4 18. 27g，柠檬酸4. 665g，用900mL溶解，调PH至5. 5，加水至IOOOmL制成；TMB溶液由5mL无水乙醇溶解TMB IOmg制成。根据I群禽腺病毒五邻体蛋白的特性，本发明利用五邻体蛋白的抗原表位作为包被抗原，以辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡IgG为酶标二抗，制成了 FAVI抗体间接ELISA检测试剂盒。该试剂盒具有抗原制备工艺简单、生物安全度高、成本低廉、易于生产和应用等特点。使用本发明，以鸡血清为检测样品，建立起利用五邻体重组蛋白作为包被抗原的间接 ELISA检测方法，该法特异性强、灵敏度高、重复性好、适于大批量检测，可用于I群禽腺病毒抗体的临床检测、流行病学调查和主动免疫效果检测。
图1是I群禽腺病毒五邻体重组蛋白的SDS-PAGE图，图中M是DNA分子量标准， 1是pGEX-4T-l空菌体表达产物，2和5是五邻体融合蛋白表达产物，3和4是五邻体融合蛋白未诱导。图2是应用本发明基于五邻体蛋白的FAVI抗体间接ELISA检测试剂盒的检测方法流程图。
具体实施例方式一、包被抗原五邻体重组蛋白的制备本发明中所用的包被抗原是利用引物PCR扩增I群禽腺病毒五邻体的抗原表位， 将截短的五邻体基因插入表达载体PGEX-4T-1中构建重组质粒pGEX-penton，再将该重组质粒转化大肠杆菌DH5ci中进行原核表达而形成的重组蛋白(如图1)。(罗思思，谢芝勋， 邓显文，等.I群禽腺病毒五邻体基因的克隆及原核表达[J].广东农业科学，2011，38 (7) 154-157)。五邻体重组蛋白经包涵体纯化后，作为试剂盒中包被酶标板的包被抗原。
二、ELISA检测试剂盒所用试剂的准备与配制(1)辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡IgG酶标二抗购自KPL公司；(2)包被酶标标板的制备用包被液将包被抗原稀释至1 30 μ g/mL,加入96孔酶标板，100 μ L/孔，置于37°C温育Ih后，4°C过夜；用PBST洗板3次，拍干，每孔加入封闭液200 μ L，置于37°C封闭lh，用PBST洗板3次，拍干制得；包被液碳酸盐缓冲液=Na2CO3 1. 59g, NaHCO3 2. 93g，加蒸馏水定容至IOOOmL, il PH值到9. 6 ；封闭液5%脱脂奶，5g脱脂奶用PBST定容至IOOmL ；(3)洗涤液含有0. 05 %吐温-20的磷酸盐缓冲液，即PBST =NaCl 8. 0g, KCl 0. 2g，KH2PO4 0. 2g，Na2HPO4. Iffl2O 2. 9g，吐温-20 500uL，加蒸馏水定容至 IOOOmL, il PH 值到 7. 4 ；(4)稀释液1 % BSA Ig牛血清白蛋白BSA用PBST定容至IOOmL ；(5)底物液(TMB-H2O2 溶液)=TMB 缓冲液(Na2HPO4 18. 27g，柠檬酸 4. 665g， 用900mL溶解，调PH至5. 5，加水至IOOOmL) IOmL, TMB溶液(TMB IOmg, 5mL无水乙醇溶解)0. 5mL, H2O2 32uL ；(6)终止液2M H2SO4 :21. 7mL浓硫酸缓慢加入178. 3mL蒸馏水中。三、ELISA操作方法(如图2)(1)包被用包被液将包被抗原稀释至1 30 μ g/mL,加入96孔酶标板，100 μ L/ ？L置于37°C温育Ih后，4°C过夜；用PBST洗板3次，拍干；(2)封闭每孔加入5%的脱脂奶200yL，置于37°C封闭45min，用PBST洗板3次， 拍干；(3)与血清结合设阴性标准孔和阳性标准孔，其余孔加入待检样品，IOOyL/孔， 于37°C温育Ih后，用PBST洗板3次，拍干；(4)与酶标二抗结合辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡IgG用1 % BSA以1 1000 1 8000倍稀释，100 μ L/孔，置于37°C温育Ih后，用PBST洗板3次，拍干；(5)显色每孔加入IOOuL底物显色液，于37°C避光作用IOmin ；(6)终止每孔加入50uL终止液，酶标仪检测0D450值；(7)结果判定计算检测50份SPF阴性血清样品的0D450平均值X和标准差SD，若样品( 450值> X+3SD，判为阳性；若样品( 450值< X+3SD，判为阴性。计算得X为0. 182， SD为0. 051，根据统计学原则，阴性样本的X+3SD为阴、阳性临界值，即该法的阴阳性临界值为 0. 182+3X0. 051 = 0. 335 若样品 0D450 值> 0. 335，为阳性，若样品 0D450 值< 0. 335， 为阴性。四、FAVI抗体间接ELISA检测试剂盒的实际应用1.临床样品检测(1)样品采集随机采集10份临床样品，以静脉采集活禽市场鸡血液，析出的血清为待检样品；(2)检测具体方法同上；(3)结果与判定测定各样品的0D450值，根据上述的标准判定，结果如表1。表1临床样品ELISA检测结果
权利要求
1.一种基于五邻体蛋白的FAVI抗体间接ELISA检测试剂盒，包括包被酶标板、阴性标准血清、阳性标准血清、羊抗鸡IgG酶标二抗、洗涤液、稀释液、底物液和终止液，其特征在于所述包被酶标板以I群禽腺病毒五邻体重组蛋白作为包被抗原。
2.根据权利要求1所述的基于五邻体蛋白的FAVI抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于所述I群禽腺病毒五邻体蛋白由序列表SEQ. ID. No. 1的截短的五邻体基因编码。
3.根据权利要求1所述的基于五邻体蛋白的FAVI抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于所述I群禽腺病毒五邻体重组蛋白来自大肠杆菌原核表达。
4.根据权利要求1所述的基于五邻体蛋白的FAVI抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于所述包被酶标板是用包被液将包被抗原稀释至1 30 μ g/mL,加入96孔酶标板， 100 μ L/孔，置于37°C温育Ih后，4°C过夜；用PBST洗板3次，拍干，用封闭液封闭酶标板， 37°C温育lh，用PBST洗板3次，拍干制得；所述封闭液为5%脱脂奶；所述包被液为pH 9.6 的碳酸盐缓冲液。
5.根据权利要求1所述的基于五邻体蛋白的FAVI抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于所述羊抗鸡IgG酶标二抗是以辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡IgG。
6.根据权利要求1所述的基于五邻体蛋白的FAVI抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于所述阴性标准血清是SPF鸡胚孵育所产2 5日龄雏鸡的血清；所述阳性标准血清是经I群禽腺病毒模拟自然感染的方式滴鼻、点眼两次后的SPF鸡血清；所述洗涤液是含有0. 05%吐温-20的磷酸盐缓冲液，pH为7. 4 ；所述稀释液是BSA;所述底物液是TMB-H2A溶液；所述终止液是2M H2SO4。
7.根据权利要求4所述的基于五邻体蛋白的FAVI抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于所述磷酸盐缓冲液由 NaCl 8. 0g, KCl 0. 2g，KH2PO4 0. 2g，Na2HP04. 12Η202· 9g，吐温-20 500uL,加蒸馏水定容至IOOOmL,调PH值到7. 4制成。
8.根据权利要求4所述的基于五邻体蛋白的FAVI抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于所述TMB-H2A溶液由TMB缓冲液10ml、TMB溶液0. 5ml, H2O2 32ul组成；所述TMB缓冲由Na2HPO4 18. 27g，柠檬酸4. 665g，用900mL溶解，调PH至5. 5，加水至IOOOmL制成；所述TMB溶液由5mL无水乙醇溶解TMB IOmg制成。
全文摘要
本发明公开了一种基于五邻体蛋白的FAVI抗体间接ELISA检测试剂盒，其包被酶标板以I群禽腺病毒五邻体重组蛋白作为包被抗原。本发明根据I群禽腺病毒五邻体蛋白的特性，本发明利用五邻体重组蛋白的抗原表位作为包被抗原，以辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡IgG为酶标二抗，制成了FAVI抗体间接ELISA检测试剂盒。该试剂盒具有抗原制备工艺简单、生物安全度高、成本低廉、易于生产和应用等特点。使用本发明，以鸡血清为检测样品，建立起利用五邻体重组蛋白作为包被抗原的间接ELISA检测方法，该法特异性强、灵敏度高、重复性好、适于大批量检测，可用于I群禽腺病毒抗体的临床检测、流行病学调查和主动免疫效果检测。
文档编号G01N33/68GK102445548SQ20111036100
公开日2012年5月9日 申请日期2011年11月15日 优先权日2011年11月15日
发明者刘加波, 庞耀珊, 罗思思, 谢丽基, 谢志勤, 谢芝勋, 邓显文 申请人:广西壮族自治区兽医研究所