专利名称：一种定量检测肌钙蛋白i/肌酸激酶同工酶/肌红蛋白的荧光免疫层析方法及其试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种以量子点可实现多色标记的特性为基础，利用量子点标记抗体定量检测生化标志物的方法，特别公开了一种肌钙蛋白I/肌酸激酶同工酶/肌红蛋白定量检测试剂盒，可同时实现肌钙蛋白I、肌酸激酶同工酶和肌红蛋白的定量检测，属于医学检验领域。
背景技术：
心血管疾病对人类健康和生命的威胁很大，已成为医学上的两大难关之一，心血管疾病是全世界导致人类死亡的“头号杀手”，我国有心血管疾病患者近2亿人，每年死于心血管疾病者近300万人。因此建立一套可以准确、快速、方便地预测和诊断癌症、心血管疾病的检测系统已迫在眉睫。心血管标志物主要包括肌钙蛋白I、肌钙蛋白T、肌酸激酶(CK)和肌酸激酶同工酶 (CK-MB)、肌红蛋白、D- 二聚体、C反应蛋白等。目前对心血管疾病的诊断和预测主要是对单个标志物指标进行检测，费时费力。 本实用新型通过对多个指标的快速检测实现对心血管疾病的发生和发展进行全面的预测、 诊断和预后，对心血管疾病的预防和治疗有着重要的指导意义。免疫层析(immunochromatography)是近十年来兴起的一种快速诊断技术，具有精确、快速和操作简单等优点。胶体金免疫层析技术已经在临床检验中得到了广泛应用， 其基本原理是通过胶体金标记物与分析物及包被抗体或抗原反应形成胶体金本身的颜色 (红色)，可通过肉眼观察检测结果。但是对于某些抗原或抗体含量极低的样本，胶体金的颜色很浅且很难用肉眼来判断结果，灵敏度低。并且胶体金试纸条大多对单个标志物进行检测，对多个标志物检测时，易发生交叉干扰，产生假阳性信号。量子点又叫半导体纳米晶(quantum dots，QDs)，通常是由II-VI族或III-V族元素组成的稳定的、尺寸介于1 20nm之间的纳米微晶体。其具有许多优良的光学特性(1) 量子点的荧光发射光谱窄而对称，荧光发射波长可调，且覆盖范围可从紫外到近红外区。 (2)量子点的吸收光谱宽且连续，可实现一元激发，多元发射，适合于多色标记。(3)量子点具有较强的光学稳定性。Cdk/ZnS量子点的光稳定性是罗丹明6G的100倍以上。(4)量子点摩尔吸光系数可以高达106L/(mol ^m)，且荧光量子产率高(50 80% )，因而可产生较强荧光信号。( 量子点斯托克斯位移较大，荧光寿命长(20 50ns)，使得信号可以显著区分于背景和其它荧光基团。量子点是一种理想的应用于超灵敏和多组分生物化学分析的荧光探针。将量子点与抗体结合可应用于荧光免疫分析和检测。量子点高荧光特性结合层析试纸条简便快速的特点，可实现生化标志物的快速、 灵敏检测。并且利用量子点多色标记的特性，可实现多种目标物的同时检测。肌红蛋白是存在于肌肉组织中的一种亚铁血红素蛋白，当肌肉细胞损伤后，由于分子量小，肌红蛋白迅速释放到血液中，2小时可异常增高。肌红蛋白虽不够特异但灵敏度很高，是目前心肌受损后最早发生异常的心血管标志物，并具有很高的阴性排除价值。CK是由两种不同亚基(M和B)组成的二聚体，这样正常人体组织主要含3种同工酶，即CK-MM、CK-BB, CK-MB。CK-MM主要存在于肌肉细胞中，CK-BB主要存在于脑细胞中， CK-MB主要存在于心肌细胞中。CK-MB是目前常用的心肌损伤标志物，曾一度被视为诊断 AMI的“金标准”。CK-MB在急性心肌梗死发病后4 他内增高，24h达峰值，两三天恢复正常。心肌肌钙蛋白是由cTnl、cTnC以及cTnT组成的复合物，在肌肉收缩和舒张过程中起重要调节作用。其中，cTnC没有心肌特异性，较少用于心肌损伤的检查。在正常状态下，cTnl和cTnT均不能透过细胞膜进入血液循环，故健康人血内不含或含极低量的cTnl、 cTnT ；当心肌细胞受损后，cTnl及cTnT弥散进人细胞间质，较早的出现在外周血中。通常， 心肌肌钙蛋白在发病后3 证即可升高，15 24h达高峰，持续时间久，5 10天后降至正常。cTnl在心肌中无其它亚型，特异性高于cTnT，此外其分子量亦小于cTnT，在AMI发病时，更早被释放于血液中，因此cTnl更优于cTnT，可谓目前诊断心肌梗死最好的心肌损伤标志物。中国专利申请号CN200510025494. X和CN200520041211. 6公布了一种心血管疾病的诊断和预测多指标蛋白芯片检测试剂盒，该试剂盒利用化学发光在蛋白芯片上进行心肌肌钙蛋白I、肌红蛋白等八项指标同时定性检测。此法虽较敏感、准确，但存在着操作繁琐， 检测耗时较长等缺点。中国专利申请号CN200720140932. 1公布了一种人肌红蛋白/肌酸激酶同工酶/ 心肌钙蛋白I诊断试纸，该试纸利用颜色颗粒(如胶体金颗粒、染料颗粒)在常规试纸条进行三项指标的定性检测。胶体金免疫层析法虽然具有简便快速便宜的优势，然而当样本中抗原或抗体含量极低时，胶体金的颜色将很浅，很难用肉眼来判断结果，容易出现误判，灵敏度较低，且三项指标同时检测时，有一定的交叉干扰，易产生假阳性。故现有多项标志物同时检测主要存在如下缺点1)胶体金免疫层析试纸条灵敏度低，线性范围窄，有一定的交叉干扰。2)酶联免疫和蛋白芯片存在操作繁琐，检测耗时较长等缺点。
发明内容
本发明要解决的技术问题为针对现有技术中检测多项生化标志物灵敏度低和标志物间相互干扰的缺点，提供了一种检测的荧光免疫层析方法。为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为一种量子点多色标记定量检测肌钙蛋白I/肌酸激酶同工酶/肌红蛋白的荧光免疫层析方法，包括以下步骤步骤1)量子点多色标记合成不同荧光发射波长的量子点，并用化学交联分别将肌钙蛋白I、肌酸激酶同工酶、肌红蛋白的特异性抗体连接到不同发射波长的量子点表面， 得到抗体修饰的量子点，所述不同荧光发射波长的量子点波长范围为550 1300nm ；步骤2、抗体包被混合三种步骤1)得到的抗体修饰的量子点，并固定在标记垫上，且标记垫上同时固定有质控分子修饰的量子点，所述质控分子修饰的量子点的发射波长与步骤1)得到的抗体修饰的量子点的发射波长不同，且波长范围为550 1300nm，在层析膜上分别设有质控带和至少三条定量带，其中质控带固定有能与所述质控分子特异性结合的生物分子，定量带分别固定有对应肌钙蛋白I、肌酸激酶同工酶或肌红蛋白的与对应步骤1)所述抗体不同抗原决定簇的特异性抗体；步骤幻试纸条组装以样品垫、标记垫、层析膜、吸水垫和底板构建成荧光免疫层析试纸条，其中所述层析膜为弱荧光层析膜，底板具低荧光特性；步骤4)荧光定量检测试纸条免疫层析后，检测定量带和质控带荧光信号强度， 并以质控带荧光信号强度校正定量带荧光信号强度，进而实现肌钙蛋白I、肌酸激酶同工酶、肌红蛋白的同时定量检测。本发明提供的一种量子点多色标记定量检测肌钙蛋白I/肌酸激酶同工酶/肌红蛋白的荧光免疫层析方法是一种以不同激发波长的量子点为荧光信号的，采用多色标记技术，在免疫层析试纸条上同时实现肌钙蛋白I/肌酸激酶同工酶/肌红蛋白定量检测的方法。本发明量子点多色标记定量检测肌钙蛋白I/肌酸激酶同工酶/肌红蛋白的荧光免疫层析方法能够解决现有荧光免疫层析技术中背景与信号难区分、灵敏度低、生化标志物检测时相互干扰的不足和缺陷，可实现对微量样本中多项标志物的同时检测。由于量子点荧光受激发光干扰很小，灵敏度大大提高，其灵敏度是用传统染料和有色标记物检测方法的10 1000倍。为了提高与背景的区分度，本发明选用发射光波长为550 1300 nm的量子点。因为在紫外照射下，层析膜、底板和扣卡的荧光强度在^Onm以下远强于550nm以上，从而对低浓度CK-MB检测时产生一定的影响，故可优选发射波长大于550nm的量子点。另外层析膜、底板和扣卡在近红外区域(750 1300nm)荧光强度极弱，并结合量子点合成技术，优选近红外波长的量子点(750 1300nm)可进一步提高灵敏度。本发明所用量子点包含单一化合物形成的量子点或是几种化合物组装成的复合物量子点，且量子点具有较强的光稳定性。形成量子点的化合物是从aiS、CdS、HgS、MgS、 CdSe, MgSe, ZnSe、PbSe、PbSe, CdTe, MgTe, ZnTe, HgTe, InAs, InP 组成的组中选择的，且可掺杂Cu、Mn和Hg。本发明采用四种不同发射波长的量子点分别修饰肌钙蛋白I抗体、肌酸激酶同工酶抗体、肌红蛋白抗体和质控分子，以减少量子点非特异性吸附和标志物间的交叉干扰，对定量检测的影响，其中不同发射波长的量子点具有相同的电性，且不同量子点发射峰之间
重叠很少。作为优选，在本发明的实施例中，使用有机相方法合成570nm和630nm的CdSe/ SiS，和690nm和750nm的CdTe/CdSe，并把量子点由脂溶性转为水溶性，此过程中量子点荧
光无明显变化。作为优选，在本发明实施例中，标记垫中肌钙蛋白I抗体、肌酸激酶同工酶抗体和肌红蛋白抗体修饰的量子点发射波长分别为750nm、690nm和630nm，质控分子修饰的量子点的发射波长为570nm。本发明中采用化学交联将抗体修饰到量子点表面，得到抗体修饰的量子点。其中抗体分别为肌钙蛋白I、肌酸激酶同工酶或肌红蛋白的一个或多个抗原表位的抗体。本发明中的化学交联为当量子点表面有活性基团，可与抗体或质控分子直接反
6应时，不需用化学交联剂，反之用化学交联剂把抗体修饰到量子点表面。在本发明的实施例中采用化学交联法对量子点进行蛋白质分子修饰的方法为 利用1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、戊二醛等交联剂将量子点表面的官能团(如羧基、氨基)与蛋白质分子(如抗原、抗体等)表面的官能团(如氨基、羧基、醛基等)连接。作为优选，在本发明的实施例中，采用EDC/NHS交联法对量子点进行修饰。其中 EDC/NHS交联法对量子点进行抗体修饰的一般步骤为将量子点溶液与EDC和NHS混合，然后加入一定量的抗体，以缓冲液为反应介质，培育4h，加入L-甘氨酸封闭，以色谱、层析柱或超滤离心等方式纯化，从而得到抗体修饰的量子点。分别将肌钙蛋白I、肌酸激酶同工酶和肌红蛋白的特异性抗体修饰到750nm、690nm和630nm的量子点表面，将质控分子修饰到 570nm的量子点表面。为了降低对量子点荧光信号的影响，本发明采用弱荧光层析膜、低荧光底板和低荧光扣卡，从而保证获得高荧光信背比，能良好区分信号与背景，进而提高检测灵敏度。作为优选，在本发明实施例中，底板(8)为黑色，表面附有不干胶，且层析膜G)、 扣卡(11)、底板(8)和不干胶均不含有荧光剂。如扣卡含有润湿孔(1 时，则润湿孔可在层析膜的近样品垫一端或在近吸水垫一端。为区别于胶体金免疫层析试纸条的检测带，本发明中层析膜上固定分析物配体的区域称为定量带，用于准确定量检测分析物的浓度，并以质控带作内质控校正定量带，以减弱样本、环境因素等的影响。本发明的免疫层析试纸条可采取常规的层析方式，作为优选，本发明采用预润免疫层析进行分析物检测。其中预润免疫层析试纸条有直接和间接预润两种，直接预润免疫层析试纸条由样品垫⑴、过滤膜⑵、标记垫⑶、层析膜⑷、吸水垫(7)和底板⑶组成， 如图1所示。本发明的实施例中为间接预润免疫层析试纸条，由样品垫(1)、过滤膜( 、标记垫(3)、层析膜、润湿垫(9)、连接垫(10)、吸水垫(7)和底板(8)组成，如图2所示。在标记垫上固定有钙蛋白I、肌酸激酶同工酶和肌红蛋白的特异性抗体分别修饰的量子点， 以及质控分子修饰的量子点。在试纸条层析膜上分别设有三条定量带和两条质控带，其中质控带固定有能与质控分子特异性结合的生物分子，三条定量带分别固定有肌钙蛋白I抗体、肌酸激酶同工酶抗体和肌红蛋白抗体，其中定量带上对应抗体与标记垫上抗体的抗原决定簇不同，但肌钙蛋白I能与量子点表面的肌钙蛋白I抗体和定量带上的肌钙蛋白I抗体形成双抗体夹心结构，肌酸激酶同工酶能与量子点表面的肌酸激酶同工酶抗体和定量带上的肌酸激酶同工酶抗体形成双抗体夹心结构，肌红蛋白能与量子点表面的肌红蛋白抗体和定量带上的肌红蛋白抗体形成双抗体夹心结构。在本发明的实施例中，发明人所选用的待测样本为血清，且样本进一步包含全血和血浆。当样本为全血时，荧光免疫层析试纸条还包括在标记垫与层析膜之间设置的过滤膜，用于凝固、过滤红细胞，该过滤膜可分别与样品垫和标记垫直接毛细作用接触，如图1 所示，也可与标记垫和层析膜直接毛细作用接触。本发明实施例采用预润免疫层析方法对样本中的肌钙蛋白I、肌酸激酶同工酶和肌红蛋白进行定量检测。其中预润免疫层析为加入一定体积的缓冲液到层析膜上，目的是预润湿层析膜，封闭非特异性结合位点，以使量子点标记物均勻通过层析膜，且减少在层析膜上的非特异性吸附，并减缓样本流动速度，从而增加特异性结合。其中缓冲液体积一般为 20 80 μ 1，润湿时间一般为30秒 2分钟，而样本层析时间一般为8 25分钟。本发明的预润免疫层析可为将缓冲液直接或间接滴加于层析膜。而将缓冲液间接滴加于层析膜时，荧光免疫层析试纸条还包括润湿垫和连接垫，其中润湿垫分别与层析膜和连接垫以毛细作用接触，连接垫分别与润湿垫和吸水垫以毛细作用接触。缓冲液通过润湿垫到达层析膜。本发明采用的缓冲液为ρΗ 7. 2 11的碱性缓冲液，且该缓冲液可包含牛血清白蛋白、酪蛋白和表面活性剂。其中表面活性剂可包括吐温20、吐温80、曲拉通Χ-100、聚乙二醇和聚乙烯基吡咯烷酮等。作为优选，本发明实施例中，使用缓冲液为包含牛血清白蛋白和吐温20的pH 9. 0 的磷酸缓冲液。本发明的检测用荧光定量仪包含激发光源模块、滤光模块、光电转换模块、控制分析模块和软件系统。其中激发光源模块包含光源和聚光装置，该光源为发光二极管或激光二极管，波长选择300 400nm之间或500 600nm之间。滤光模块包含滤光片轮，该滤光片轮包含不同种滤光片，以获取相应量子点的荧光信号。光电转换模块包含图像传感器或光电倍增管。层析结束后，在光源激发下，试纸条产生的荧光信号，经过滤光模块滤除杂散光及背景荧光，到达光电转换模块，转换为数字信号。其中所获质控带与定量带的荧光强度有一定相关性，主要影响因素有温度、湿度、基质等。本发明检测结果的判定方法为如果质控带荧光信号强度值超过荧光定量仪内部设定的可接受值，说明检测结果无效；在检测结果有效的前提下，定量带荧光强度与质控带比值越高，表示相应标志物浓度越高，反之越低。本发明采用荧光定量仪检测一系列不同浓度的标准品，绘制标准曲线。其中标准曲线为标准品系列浓度与所对应的校正荧光信号强度关系曲线，关系式为F = f (C)。校正荧光信号强度为F= aFg—A^j^，其中α为校正系数，受温度、湿度和基质等影响。然后检测样本，依据标准曲线获得样本中肌钙蛋白I、肌酸激酶同工酶和肌红蛋白的浓度。本发明还提供了一种量子点多色标记定量检测肌钙蛋白I/肌酸激酶同工酶/肌红蛋白的荧光免疫层析试剂盒，包括缓冲液、扣卡(U)和荧光免疫层析试纸条，如图3所示。该试剂盒采用间接预润免疫层析方法。扣卡(11)为荧光免疫层析试纸条的外部壳结构，包括上样孔(12)、视窗(14)和润湿孔(13)，且具低荧光特性，或为不含荧光剂。荧光免疫层析试纸条结构如图2所示，其包含样品垫(1)、标记垫(3)、层析膜0)、 润湿垫(9)、连接垫(10)、吸水垫(7)和底板(8)。层析膜(4)包含质控带( 和定量带 (6)。其中样品垫(1)、标记垫(3)、层析膜(4)、润湿垫(9)、连接垫(10)和吸水垫(7)搭载于底板(8)之上，样品垫(1)连接于标记垫(3)，且位于上样孔(12)的下方，标记垫(3)连接于层析膜G)，层析膜(4)上固定有两条质控带( 和三条定量带(6)，且质控带(5)位于定量带(6)的两侧，三条定量带分别对应肌钙蛋白I、肌酸激酶同工酶和肌红蛋白的检测区域，层析膜(4)位于视窗(14)的下方，层析膜(4)连接于润湿垫(9)，且润湿垫(9)位于润湿孔(13)的下方，润湿垫(9)连接于连接垫(10)，连接垫(10)连接于吸水垫(7)
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进行全血样本层析时，试纸条还包括过滤膜O)，具体结构如图2所示，其中试纸条包含样品垫(1)、标记垫(3)、层析膜(4)、润湿垫(9)、连接垫(10)、吸水垫(7)、底板(8) 和过滤膜O)。过滤膜连接于样品垫(1)与标记垫C3)之间。本发明构建的预润免疫层析试纸条，其特征是，增加润湿垫(9)和连接垫(10)，其中润湿垫分别与层析膜(4)和连接垫(10)毛细作用接触，用于减小滴加缓冲液时，缓冲液对层析膜的冲击，以润湿层析膜(4)，并减少非特异性吸附。而连接垫(10)分别与润湿垫(9)和吸水垫(7)毛细作用接触，具有缓慢的吸水速度，以减少润湿时的吸水量，促使缓冲液充分润湿层析膜G)，当加样本层析时，吸水垫(7) 可通过连接垫(10)吸水，促使样本层析。试纸条的层析膜(4)具有弱荧光特性，优选不含荧光剂，其荧光噪声且在大于 550nm时很弱，以减少对低浓度目标物检测的影响。本发明的主要优点如下1)本发明方法采用量子点作为特异性抗体的标记物，与有机荧光染料相比，具有发光强度高、激发光谱宽、发射光谱窄、荧光寿命长、表面修饰多功能化及稳定性好等优势。 并优选了 550 1300nm的量子点，以提高与背景的区分度。2)本发明试剂盒的组成部件中的扣卡、底板以及层析膜在大于550nm时均具有低的荧光特性，以减少对量子点荧光信号获取的影响，从而保证获得高的荧光信背比，进而达到提高灵敏度的目的。3)本发明采用荧光定量仪检测定量带和质控带荧光信号强度，并以质控带校正定量带荧光信号强度，进而依据荧光定量仪获取的标准曲线实现分析物的定量检测。其中标准曲线为标准品系列浓度(c)与所对应的校正荧光信号强度(F)的关系曲线，关系式为F = f(C)。校正荧光信号强度为F= aFg^/Fgi，其中α为校正系数，受温度、湿度和基质等影响。然后检测样本，依据标准曲线获得样本中分析物浓度。4)本发明改变量子点的粒径或种类，就可得到不同波长的荧光，用不同类型的量子点标记不同的抗体，可产生多色荧光标记，实现多组分的同时检测；利用量子点多色标记技术，减少质控分子对分析物检测的影响，也可减少分析物间的交叉干扰和假阳性，方法简单快速，灵敏度高，有利于同时高灵敏定量检测多种分析物。5)本发明可利用预润免疫层析技术，增强特异性结合，减少非特异性吸附，增强试剂盒的检测灵敏度，有利于样品中肌钙蛋白I、肌酸激酶同工酶、肌红蛋白含量极低时的准
确定量。6)本发明方法简单、快速、准确、成本低，且灵敏很高。与传统的化学发光法和酶联免疫法检测肌酸激酶同工酶相比，具有操作简便、快速、不需昂贵的检测设备，适合单人份或小批量检测等优点；与常规胶体金免疫层析方法相比，本发明具有标记稳定性好、非特异性低、灵敏度高、线性范围宽以及定量准确等优势。
图1为直接预润免疫层析试纸条的组装示意图，其中1为样品垫，2为过滤膜，3为标记垫，4为层析膜，5为质控带，6为定量带，7为吸水垫，8为底板；图2为间接预润免疫层析试纸条的组装示意图，其中1为样品垫，3为标记垫，4
9为层析膜，5为质控带，6为定量带，7为吸水垫，8为底板，9为润湿垫，10为连接垫；图3为荧光免疫层析试剂盒示意图，其中11为扣卡，12为上样孔，13为润湿孔，14 为视窗，5为质控带，6为定量带。
具体实施例方式本发明公开了一种量子点多色标记定量检测肌钙蛋白I/肌酸激酶同工酶/肌红蛋白的荧光免疫层析方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及其试剂盒已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本发明的技术方案为步骤1)量子点多色标记合成不同荧光发射波长的量子点，并用化学交联分别将肌钙蛋白I、肌酸激酶同工酶、肌红蛋白的特异性抗体连接到不同发射波长的量子点表面， 得到抗体修饰的量子点，所述不同荧光发射波长的量子点波长范围为550 1300nm ；步骤2、抗体包被混合三种步骤1)得到的抗体修饰的量子点，并固定在标记垫上，且标记垫上同时固定有质控分子修饰的量子点，所述质控分子修饰的量子点的发射波长与步骤1)得到的抗体修饰的量子点的发射波长不同，且波长范围为550 1300nm，在层析膜上分别设有质控带和至少三条定量带，其中质控带固定有能与所述质控分子特异性结合的生物分子，定量带分别固定有对应肌钙蛋白I、肌酸激酶同工酶或肌红蛋白的与对应步骤1)所述抗体不同抗原决定簇的特异性抗体；步骤幻试纸条组装以样品垫、标记垫、层析膜、吸水垫和底板构建成荧光免疫层析试纸条，其中所述层析膜为弱荧光层析膜，底板具低荧光特性；步骤4)荧光定量检测试纸条免疫层析后，检测定量带和质控带荧光信号强度， 并以质控带荧光信号强度校正定量带荧光信号强度，进而实现肌钙蛋白I、肌酸激酶同工酶、肌红蛋白的同时定量检测。采用双抗体夹心法原理定量检测人样本(全血、血清或血浆)中生化标志物(如肌钙蛋白I、肌酸激酶同工酶和肌红蛋白)含量。检测时，首先向润湿孔中滴加缓冲液，然后将样本滴加到上样孔中样本先与标记垫中的量子点标记物相混合，并沿着层析膜向吸水垫方向毛细运动，分别流经层析膜上的定量带和质控带。若样本中含有生化标志物，则生化标志物与对应的量子点表面的生化标志物抗体相结合，当层析至定量带时，会被预先包被于相应条带的能与对应生化标志物结合的抗体相结合，从而构成双抗体夹心复合物。光源激发下，采用荧光定量仪获取定量带和质控带的荧光信号强度，依据荧光定量仪获取的标准曲线，进而分析样本中生化标志物(肌钙蛋白I、肌酸激酶同工酶和肌红蛋白)的浓度。为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。实施例1 量子点荧光多色标记后采用间接预润免疫层析对肌钙蛋白I、肌酸激酶同工酶和肌红蛋白的定量检测(一 )量子点合成及修饰
取0. 2375g硒粉、2. 60mL十八烯和1. 57mL三正辛基膦，依次加入25ml小试剂瓶中，加热瓶中混合液体并反复振荡直至硒粉全部溶解，即得硒前体。另取0. 0368g氧化镉、 0. 342g硬脂酸和3. 8ml十八烯，依次加入三颈烧瓶中，氮气保护下加热至氧化镉全部溶解。 降温使溶液冷却至凝固。取2. 25g十八胺和0. 95g三辛基氧化膦，加入三颈烧瓶，并加热使固体融解，继续加热至280°C，注入4. 2mL硒前体，升温至240°C，于不同反应时间取样获得不同荧光发射波长的Cdk量子点，并以甲醇纯化量子点。取IOmL十八烯、0. IlOg硫粉，依次加入三颈烧瓶中，在氮气保护下加热至硫粉溶解，即得硫前体。另取0. 8375g氧化锌、9mL油酸和2mL十八烯，依次加入三颈烧瓶中，在氮气保护下加热至锌粉溶解，即得锌前体。加入anl Cdk量子点溶液，加入三颈烧瓶中，抽真空去除氯仿，取以上合成的硫前体和锌前体，以及5mL十八烯和1. 4g十八胺，依次加入三颈烧瓶中，加热使固体融解，在氮气保护下加热使量子点生长至所需波长，并以甲醇纯化。同理，加入其他荧光发射波长的Cdk量子点获得所需波长的Cdk/ZnS量子点。表征量子点荧光特征，合成CcKe/ZnS量子点荧光发射波长分别为570nm、630nm，量子产率大于50%。同理获得690nm和750nm CdTe/CdSe量子点。取0. 5 1. Og四甲基氢氧化铵五水合物，加入0. 1 Iml巯基丙酸和IOml氯仿， 摇均，静置30分钟后，去除上层液体，然后加入100 μ 1量子点溶液。溶液中有红色沉淀析出，48小时后取出红色悬浮物，以氯仿纯化后，溶于水溶液中，得到表面官能团为羧基的量子点。量子点相转移前后荧光特性无明显变化。向ρΗ7· 4磷酸缓冲液中加入60pmol量子点(发射波长为750nm)、10 μ g EDC和 15 μ g NHS溶液和10 30 μ g的肌钙蛋白I的单抗，混合均勻于室温下反应4h，然后加入 Img甘氨酸封闭。用色谱柱或层析柱分离纯化，得到肌钙蛋白I单抗修饰的量子点。同理得到肌酸激酶同工酶单抗修饰的量子点(690nm)、肌红蛋白单抗修饰的量子点(630nm)和羊抗兔抗体修饰的量子点(570nm)。( 二)试剂盒构建以摩尔比1 :2:5: 1的比例混合均勻以上四种量子点标记物(依次为肌钙蛋白I肌单抗、酸激酶同工酶单抗、肌红蛋白单抗和羊抗兔抗体修饰的量子点)，其中混合液中含有1 15%蔗糖、0.05 0.5%牛血清白蛋白(B SA)和吐温20、吐温80、曲拉通X-100 等表面活性剂，其中表面活性剂含量在0.01 之间，然后均勻喷涂在标记垫上，37°C干燥后密封，4°C下保存。以划膜仪在弱荧光层析膜上划四条平行条带，条带间隔3 4mm，条带宽都约为 1mm。其中两侧的两条为质控带，中间三条为定量带，以样本层析方向，第一、二、三条为定量带分别包被肌钙蛋白I肌多抗、肌酸激酶同工酶多抗、肌红蛋白多抗。质控带上喷涂兔免疫球蛋白(兔IgG)，浓度分别为0. 2 lmg/ml和1 3mg/ml ；第一定量带喷涂的肌钙蛋白I多抗浓度为0. 5 2mg/ml ；第二定量带喷涂肌酸激酶同工酶BB (CK-MM)多抗，浓度为 0. 5 2mg/ml ；第三定量带喷涂肌红蛋白多抗，浓度为0. 5 2mg/ml。37°C干燥后密封，4°C 下保存。在黑色底板上，依次粘贴上层析膜(长30cm，宽2. 5cm)、标记垫(长30cm，宽8mm)、 过滤膜(长3Ocm,宽l6mm)、样品垫(长3Ocm,宽l6mm)、连接垫(长3Ocm,宽IOmm)、润湿垫 (长30cm，宽IOmm)和吸水垫(长30cm，宽16mm)。膜与膜之间都要紧密相连，制成荧光免疫层析试纸大板，示意图如图2所示。用切条机将粘贴好的试纸大板纵向切成4mm宽的试纸条，放入低荧光扣卡中组装成不含缓冲液的免疫层析试剂盒，如图3所示，干燥后密封， 与缓冲液共同构建为荧光免疫层析试剂盒，4°C避光保存。
(三)样本检测
用正常人血清作稀释液，将肌钙蛋白I标准品配制系列浓度标准品溶液如下 0. 05ng/mL、0. lng/mL、0. 2ng/mL、0. 4ng/mL、0. 8ng/mL、l. 6ng/mL、3. 2ng/mL、6. 4ng/mL、 12. 8ng/mL、25. 6ng/mL、51. 2ng/mL和 102. 4ng/mL。
用正常人血清作稀释液，将肌酸激酶同工酶标准品配制系列浓度标准品溶液如下0. 25ng/mL、0. 5ng/mL、lng/mL、2ng/mL、4ng/mL、8ng/mL、16ng/mL、32ng/mL、64ng/mL、 128ng/mL 禾口 256ng/mL。
用正常人血清作稀释液，将肌红蛋白标准品配制系列浓度标准品溶液如下 2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、80ng/mL、160ng/mL、320ng/mL、640ng/mL、 1280ng/mL 和 2560ng/mL。
缓冲液为含有0· 05 0· 2% BSA和0. 05 1 % Tween-20的pH9. 0磷酸缓冲液。 层析时先将50 μ 1缓冲液滴加到润湿孔中，1分钟后，将100 μ 1阴性血清或标准品溶液分别滴加到上样孔中，Hmin后，以荧光定量仪检测(每个样本分别用3个试纸条测定3次，取平均值)，绘制标准曲线。分别滴加不同标志物的标准品，可获得不同标志物的标准曲线。
将50 μ 1缓冲液滴加到润湿孔中，1分钟后，将100 μ 1血清样本滴加到上样孔中， 13分钟后以荧光定量仪检测，根据不同定量带的荧光强度，依据标准曲线获得样本中肌钙蛋白I肌、酸激酶同工酶和肌红蛋白的浓度。
结果表明，肌钙蛋白I最低检测限为0. Ing/mL，最低定量限为0. 2ng/mL,CK-MB最低检测限为0. 5ng/mL，最低定量限为Ing/mL，肌红蛋白最低检测限为5ng/mL，最低定量限为lOng/mL，在定量检测范围内，相关系数均R2 > 0. 99，未出现HOOK效应，且批内与批间重复性均较好，可为心血管疾病诊断提供参考。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。权利要求
1.一种量子点多色标记定量检测肌钙蛋白I/肌酸激酶同工酶/肌红蛋白的荧光免疫层析方法，其特征在于，包括以下步骤步骤1)量子点多色标记合成不同荧光发射波长的量子点，并用化学交联分别将肌钙蛋白I、肌酸激酶同工酶、肌红蛋白的特异性抗体连接到不同发射波长的量子点表面，得到抗体修饰的量子点，所述不同荧光发射波长的量子点波长范围为550 1300nm ；步骤2、抗体包被混合三种步骤1)得到的抗体修饰的量子点，并固定在标记垫上，且标记垫上同时固定有质控分子修饰的量子点，所述质控分子修饰的量子点的发射波长与步骤1)得到的抗体修饰的量子点的发射波长不同，且波长范围为550 1300nm，在层析膜上分别设有质控带和至少三条定量带，其中质控带固定有能与所述质控分子特异性结合的生物分子，定量带分别固定有对应肌钙蛋白I、肌酸激酶同工酶或肌红蛋白的与对应步骤1) 所述抗体不同抗原决定簇的特异性抗体；步骤3)试纸条组装以样品垫、标记垫、层析膜、吸水垫和底板构建成荧光免疫层析试纸条，其中所述层析膜为弱荧光层析膜，底板具低荧光特性；步骤4)荧光定量检测试纸条免疫层析后，检测定量带和质控带荧光信号强度，并以质控带荧光信号强度校正定量带荧光信号强度，进而实现肌钙蛋白I、肌酸激酶同工酶、肌红蛋白的同时定量检测。
2.如权利要求1所述的荧光免疫层析方法，其特征在于，步骤1)所述不同荧光发射波长的量子点波长为750nm、690nm或630nm，步骤2、所述质控分子修饰的量子点的发射波长为 570nmo
3.如权利要求1所述的荧光免疫层析方法，其特征在于，步骤1)所述量子点为单一化合物形成的量子点或几种化合物组成的复合量子点。
4.如权利要求2所述的荧光免疫层析方法，其特征在于，所述化合物为选自aiS、CdS、 HgS、MgS、CdSe、MgSe、ZnSe、PbSe、PbSe、CdTe、MgTe、ZnTe、HgTe,InAs, InP ψ 的任意一种或几种，且可掺杂Cu、Mn和Hg。
5.如权利要求1所述的荧光免疫层析方法，其特征在于，步骤1)所述不同发射波长的量子点具有相同的电性，且不同量子点发射峰之间重叠很少，或不重叠。
6.根据权利要求1所述的荧光免疫层析方法，其特征在于，步骤幻所述层析膜在大于 550nm处荧光很弱或不含荧光剂。
7.根据权利要求1所述的荧光免疫层析方法，其特征在于，步骤幻所述底板为黑色，表面附有不干胶，且两者均不含荧光剂。
8.根据权利要求1所述的荧光免疫层析方法，其特征在于，步骤幻所述荧光免疫层析试纸条还包括能使样本中液体与细胞分离的过滤膜。
9.根据权利要求1所述的荧光免疫层析方法，其特征在于，步骤4)所述免疫层析为预润免疫层析，其中预润免疫层析为先以缓冲液预润层析膜，再加入样本到样品垫中，样本流经定量带和质控带后，进行荧光定量检测。
10.根据权利要求9所述的荧光免疫层析方法，其特征在于，所述预润层析膜为将缓冲液直接滴加于层析膜。
11.根据权利要求9所述的荧光免疫层析方法，其特征在于，当所述预润层析膜为将缓冲液间接滴加于层析膜时，步骤幻所述荧光免疫层析试纸条还包括润湿垫和连接垫，其中润湿垫分别与层析膜和连接垫以毛细作用接触，连接垫分别与润湿垫和吸水垫以毛细作用接触。
12.根据权利要求9所述的荧光免疫层析方法，其特征在于，所述缓冲液为pH7. 2 11的碱性缓冲液。
13.根据权利要求12所述的荧光免疫层析方法，其特征在于，所述碱性缓冲液为包含牛血清白蛋白、酪蛋白和表面活性剂的碱性缓冲液。
14.根据权利要求12所述的荧光免疫层析方法，其特征在于，所述碱性缓冲液为包含牛血清白蛋白和吐温20的pH9. 0的磷酸缓冲液。
15.根据权利要求1所述的荧光免疫层析方法，其特征在于，步骤4)所述荧光定量检测为通过检测层析膜上定量带和质控带荧光信号强度，并依据荧光定量仪获取的标准曲线对比分析实现的。
16.一种定量检测心肌肌钙蛋白I/肌酸激酶同工酶/肌红蛋白的荧光免疫层析试剂盒，包括缓冲液、扣卡(11)和荧光免疫层析试纸条，其特征在于，所述扣卡(11)为荧光免疫层析试纸条的外部壳结构，包括上样孔(12)、视窗(14)和润湿孔(1 ；所述荧光免疫层析试纸条包括样品垫(1)、标记垫(3)、层析膜、润湿垫(9)、连接垫(10)、吸水垫(7)和底板(8)，其中样品垫(1)、标记垫(3)、层析膜(4)、润湿垫(9)、连接垫(10)和吸水垫(7)搭载于底板(8)之上，样品垫(1)连接于标记垫(3)，且位于上样孔(12)的下方，标记垫(3) 连接于层析膜G)，层析膜(4)上固定有两条质控带( 和三条定量带(6)，且质控带(5) 位于定量带(6)的两侧，三条定量带分别对应肌钙蛋白I、肌酸激酶同工酶和肌红蛋白的检测区域，层析膜(4)位于视窗(14)的下方，层析膜(4)连接于润湿垫(9)，且润湿垫(9)位于润湿孔(13)的下方，润湿垫(9)连接于连接垫(10)，连接垫(10)连接于吸水垫(7)。
17.根据权利要求16所述的荧光免疫层析试剂盒，其特征在于，所述荧光免疫层析试纸条还包括过滤膜O)，其中所述过滤膜( 分别与样品垫(1)或层析膜(4)毛细作用接触。
18.根据权利要求16所述的荧光免疫层析试剂盒，其特征在于，所述扣卡(11)具有低荧光特性，或不含荧光剂。
全文摘要
本发明公开了一种量子点多色标记定量检测多项心血管疾病标志物的方法，及心肌肌钙蛋白I/肌酸激酶同工酶/肌红蛋白的试剂盒。本发明的方法利用量子点优良的荧光特性，结合荧光多色标记技术和免疫层析技术，在优化试纸条各组成部件的基础上，实现的荧光定量检测。与常规胶体金免疫层析方法相比，本发明具有标记稳定性好、非特异性低、灵敏度高、线性范围宽、交叉干扰小以及定量准确的优势。本发明试剂盒对肌钙蛋白I、肌酸激酶同工酶、肌红蛋白同时进行定量检测，适用于全血、血清和血浆样本的检测，可为心脑血管疾病诊断提供参考，可广泛用于基层医院和诊所。
文档编号G01N33/573GK102520192SQ20111045164
公开日2012年6月27日 申请日期2011年12月29日 优先权日2011年12月29日
发明者王东 申请人:深圳康美生物科技股份有限公司