专利名称：用于检测雌马酚的测试条的制作方法
技术领域：
本发明涉及在水溶液中通过颜色变化来检测雌马酚的测试条及其相关方法和用途。
背景技术：
异黄酮类(isofIavones)(也被称为异黄酮类(isofIavonoids))是通常显黄色的化合物，这些化合物是异黄酮类和黄酮类(flavonoids)的衍生物。异黄酮类是来自于植物的次生化合物，除此之外其在植物防御病原体中发挥作用。在苜蓿物种中发现了异黄酮的骨架主体。一些熟知的异黄酮类有在大豆粉中作为葡萄糖苷的大豆苷而发现的大豆苷元(daidzein)、来自于大豆和红花苜蓿的染料木素(genistein)、来自于李树树皮的樱黄素 (prunetin)、来自于鹰嘴豆和苜蓿的鹰嘴豆芽素A(biochanin A)、香豌豆苷元(OTobol)、来自于八婆木、红木和其他树木的檀黄素(santal)以及来自于新鲜的红花苜蓿的红车轴草素(pratensein)。异黄酮大豆苷兀[4’, 7-二轻基异黄酮；7_轻基_3-(4-轻基苯基)-4!1-1-苯并吡喃-4-酮]发现于大豆中并且属于许多食品和营养补充剂的一部分。异黄酮雌马酚[4’，7-二羟基异黄烷；3-(4-羟基苯基)-7_色原烷醇]产自于消耗大豆苷元以后的肠道菌群。据推测，该转化通过链球菌(streptococci)、乳酰胺酸菌(lactamid acid bacteria)和双歧杆菌(bifido bacteria)来实现。在大豆或任何其他植物中未发现有雌马酚。因此，雌马酚是植物次生代谢物群体中的一部分。雌马酚具有温和的雌激素样活性(留体雌激素活性的O. 1%)并且能够与雌激素受体ERa和ERi3结合。许多有益效果均归功于雌马酚，例如降低胆固醇的效果、抗炎效果、对于乳腺癌以及停经后生理变化的积极效果。由于与5α还原酶的相互作用，雌马酚还抑制男性的DHT生产。据推测，DHT是男性形成前列腺癌的诱因。其他益处可以是治疗男性型脱发、痤疮以及与DHT相关的其他问题。在消耗富含大豆苷元的食品之后，如果人能够生产雌马酚，那么在血液和尿液中就能够检测到雌马酚。然而，仅仅约三分之一(高加索人群)最高一半(日本人群)的人类能够由大豆苷元生产雌马酚。与不能够生产雌马酚的人类相比，富含大豆的膳食的积极效果在能够生产雌马酚的人类(“雌马酚生产者”)中更加明显。为了预测富含异黄酮的膳食是否有益于人，有必要检测该人是否为雌马酚生产者。该项检测的方便的方式似乎是检测尿液中的雌马酚。在本领域中描述了各种用于检测雌马酚的方法。WO 2004/009035Α2涉及雌马酚的各种有益效果。根据该文献，在通过高效液相色谱法(HPLC)的纯化之后，通过质谱的后续分析检测雌马酚。因此，该方法需要复杂和昂贵的仪器。JP 2006-242602中公开了用于检测雌马酚的另一种方法。该文献的目的在于提供一种简化的方法，其不需要HPLC或质谱。为了解决该问题，发明人提供了两种方法。第一种方法基于采用薄层色谱法的样品分离。该方法需要采用用于除去糖类的酶来预处理样品。在色谱法分离异黄酮类以后，采用溶剂将薄层板展开。然后，进行用于肉眼观察异黄酮类的步骤，如将薄层板置于碘蒸汽中。尽管避免了诸如HPLC柱和质谱的复杂仪器，但是该方法还是相对复杂的并且需要不能轻易处理的化学品。第二种方法需要培养微生物并且也是复杂的。JP 2006-242602 的发明人随后发表了一 篇名为 “Rapid and ConvenientDetection of Urinary Equol by Thin-layer Chromatography” ；( J Nutr.Sci.Vitaminol. (Tokyo), 2007, 53(1) ;43_7)的文章。该方法需要水解尿液样品，通过反相娃胶
柱和薄层的色谱法纯化。该方法被应用于识别雌马酚生产者。涉及雌马酚检测的早期研究发表于二十世纪四、五十年代。DirscherI公开了一种用于在雌马尿液中颜色检测雌马酚的方法(1940，Physiol. Chem.，264，57-63)。在硝酸和样 品水溶液交界处形成的红色环指示雌马酚的形成。其他方法有所公布，其中产生并溶解雌马酚沉淀或者其中在显微镜载玻片上产生固体并在显微镜下观察固体。在该文献中公开的方法需要化学试验室的设备或仪器如显微镜。因此，用于检测雌马酚的本领域已知的问题是相对复杂的。它们或者需要精细和昂贵的仪器或者至少需要化学试验室的设备。进一步地，在测试过程中还使用潜在的危险性化学品，如硝酸或碘。
发明内容
本发明所面临的问题本发明所面临的问题是提供一种用于检测雌马酚的简单而快捷的方法。具体而言，所述方法将能够应用于自测，通过所述方法人们能够检测他/她是否为雌马酚生产者。因此，所述方法的进行无需精细的仪器，特别是复杂和昂贵的仪器如HPLC、质谱或显微镜，并且无需潜在的危险性化学品，如硝酸、碘或有机溶剂。优选地，所述方法将不需要化学试验室设备和培训员工。所述方法将应用少数的过程步骤。进一步地，所述方法将允许雌马酚的特定检测，特别是在包含其他异黄酮类的溶液中，或者在复合溶液如尿液或血液部分(fraction)中。所述方法将是敏感的以便于允许雌马酚生产者和非生产者之间的明确区别。本发明的技术方案令人吃惊地，通过如权利要求所定义的测试条、方法和用途解决了本发明所面临的问题。本发明的主题是通过颜色变化来检测雌马酚的测试条。根据本发明，在所述测试条的表面上能够检测到颜色变化。当所述条与包含雌马酚的水溶液接触时，发生颜色变化。根据本发明，“测试条”是采用至少一种反应试剂浸溃的简单条，其通过将水溶液与所述条接触来分析所述水溶液。优选地，在与所述水溶液接触以前，所述条是无色的或者仅具有微弱的显色。在这个方面，“无色”意味着所述条是白色的或者具有苍白的颜色，这取决于所述条的载体材料。在本发明的一项优选的实施方案中，黄色、橙色或红色颜色指示雌马酚的存在。这意味着颜色将主要为淡黄色或淡红色，尽管它可能包含其他颜色成分或者可能被加深。优选地，颜色反应是高度特异性的。当样品中存在显著浓度的雌马酚时，优选观察到清楚和与众不同的颜色变化。当不存在雌马酚时，所述条的颜色不发生或基本上不发生变化，或者至少不应该变为指示雌马酚存在的一种颜色。具体而言，当存在其他异黄酮类(特别是包含于大豆中的那些异黄酮类，或者是在消耗大豆以后代谢产生的衍生物)时，不应该观察到指示雌马酚的颜色变化。优选地，如果水溶液包含大豆苷元、大豆苷、樱黄素、鹰嘴豆芽素A、香豌豆苷元、檀黄素和/或红车轴草素或其代谢物，那么将观察不到颜色变化。进一步地，所述条的颜色将不受尿液中通常存在的其他化合物(如维生素、酚类和雌激素)的影响。在本发明的优选实施方案中，所述水溶液是尿液、血液或者尿液或血液的一部分。因为类似于用于检测血糖等的测试条，所以优选检测尿液中的雌马酚，对于消费者或实验室而言，尿液的分析是方便的，因为没必要采集并分离血液样品。在血液中检测雌马酚的情况下，优选使用无色的血液样品，如血浆或血清。根据本发明，没必要将尿液分成部分，或者使尿液经历预处理(例如采用酶的预处理)。因此，优选无需提前纯化、分离或化学处理即可将所述尿液应用于所述测试条。然而，根据本发明，任何体液部分或人工溶液均能够用于检 查雌马酚的存在。在本发明的一项优选的实施方案中，所述测试条的长度为I至20cm且宽度为O. 2至2cm。然而，所述测试条的尺寸取决于应用。例如，如果测试条仅仅提供用于检测雌马酚，其可能具有相对薄的棒状尺寸。另一方面，雌马酚测试可能与在同一根测试条上的其他测试相结合。在该情况下，所述条可能更宽。例如，所述条可能包含用于检测其他尿液成分(如大豆苷元或激素)的另一个部分。本发明的另一个主题是一种用于生产根据上述权利要求中至少一项的测试条的方法，所述方法包含将载体与包含硝酸的浸溃水溶液接触。优选地，所述硝酸是浓缩的。浓硝酸的含水量大约为64重量％至70重量％。在优选的实施方案中，硝酸的浓度介于15重量％和70重量％之间,优选介于40重量％和70重量％之间，或者至少为15重量％或至少为45重量％。因为浓硝酸通常包含水，所以所述浸溃溶液是水溶液。然而，所述水溶液可以包含有机溶剂。如文中所使用，术语“浸溃溶液”指的是包含水和任选添加的有机溶剂的浸溃溶液。一般而言，信号强度随着硝酸浓度的增加而增加。然而，在与包含雌马酚的水溶液接触之后将所述测试条展开的情况下，灵敏度将会增加并且硝酸的浓度可能会更低。在本发明的一项优选的实施方案中，所述浸溃溶液包含有机溶剂(优选脂肪醇)和/或碱金属或碱土金属的氢氧化物。调整成分的量以便于获得令人满意的信号强度。在本发明的一项优选的实施方案中，所述有机溶剂是甲苯、苯或戊醇。在一项优选的实施方案中，所述脂肪醇是戊醇和/或所述金属氢氧化物是氢氧化钠。当添加戊醇时，所述水溶液是混悬液或乳液。如文中所使用，术语“浸溃溶液”也涉及这样的乳液或混悬液。在另一项优选的实施方案中，所述浸溃溶液包含硝酸、硝酸盐和有机溶剂。例如，溶液包含介于40重量％和80和总量％之间的硝酸(HNO3的浓度至少为45重量％)、介于5重量％和30重量％之间的硝酸盐和介于5重量％和40重量％之间的有机溶剂。所述硝酸盐优选为碱金属或碱土金属的硝酸盐，优选硝酸钠。如技术人员所知，当采用碱(如氢氧化钠)从一部分硝酸的中和反应中生产至少一部分硝酸溶液时，能够获得相同的溶液。在本发明的一项优选的实施方案中，所述溶液的pH低于4，优选低于2。在一项优选的实施方案中，所述载体由纸、纤维素、硝基纤维素组成或者由有机聚合物组成。所述载体是多孔的，例如无纺布或多孔膜。在酸存在的条件下稳定的载体是本领域已知的。所述测试条可以包含外部阻挡层，优选来自于水溶性有机聚合物，所述水溶性有机聚合物一旦与水接触即可快速溶解。所述阻挡层可以赋予测试条储藏稳定性。例如，所述条能够采用聚乙烯醇(PVOH，PVA)分层。来自于水溶性塑料的阻挡层是本领域已知的。例如，在与水接触以后的数秒内PVOH分解、分散并溶解。通过选择膜度(film grade)实现速溶。有用的阻挡材料可以是颗粒状聚乙烯醇(以“depart”商标得自于EnvironmentalPolymers of Irlam UK)。采用该材料的测试已经表明在23°C和50%的相对湿度下，30微米的聚乙烯醇膜的氧渗透速率可以在O. 24-1. 85ml/平方米/天的范围内变化，所述变化取决于制剂。膜材料的氮渗透速率非常低，以至于它们不能够在实验室测试中测量，表明其渗透性类似于铝箔的渗透性。优选地，所述测试条具有长期贮存稳定性，例如持续数月或数年。这能够通过以下方式来实现使用稳定的载体，提供阻挡层和/或将所述条放入密封包装中，如叶片(foliage)、袋子或容器。然而，也有可能将所述测试条作为一套试剂盒来提供，其包含浸溃溶液和载体。在使用所述条以前，使用者采用所述溶液浸溃所述载体。
在本发明的一项优选的实施方案中，所述方法包含下列步骤(a)提供载体和包含硝酸的浸溃水溶液，(b)采用所述溶液浸溃所述载体，和(C)干燥所述载体。本发明的另一个主题是一种用于检测水溶液是否包含雌马酚的方法，其包含下列步骤(A)将所述水溶液与本发明的测试条接触，(B)检测存在或缺乏颜色变化，(C)从存在或缺乏颜色变化来推断所述溶液是否包含雌马酚。本发明的另一个主题是一种用于检测人是否为雌马酚生产者的方法，其包含下列步骤(i)将来自于所述人的尿液、血液或其部分与根据上述权利要求中任一项所述的测试条接触，(ii)检测存在或缺乏颜色变化，(iii)从存在或缺乏颜色变化来推断所述人是否为雌马酚生产者。在本发明的方法中，优选通过变成黄色、橙色或红色的颜色变化来检测雌马酚的存在。进一步地，优选通过眼睛观察颜色变化。因此，没必要使用用于颜色检测的仪器。当检测人是否为雌马酚生产者时，优选从受试者处获得尿液或血液，所述受试者在测试以前已经消耗大豆苷元或者包含大豆苷元的食品或膳食。优选地，人已经消耗预定量的大豆苷元或包含大豆苷元的产品。例如，包含大豆苷元的产品有大豆或大豆部分或大豆产品，如日本传统食品纳豆(natto)，或者红花苜蓿试样(assay)或部分。在消耗以后，雌马酚生产者迅速将大豆苷元转化为雌马酚并将其大量排出。因此，能够直接监测大豆苷元是否被转化为雌马酚。应该在充足的时间以后采集和/或分析样品(如尿液)以便大豆苷元被转化为雌马酚。例如，在消耗大豆苷元或者包含大豆苷元的食品以后，可以在20分钟至10小时以后采集样品和/或分析样品。
选择施用于个体的大豆苷元的量，以便将观察到雌马酚生产者的清楚信号。大豆苷元的量不但取决于具体的测试条的选择性，而且取决于个体的体重。例如，在测试以前可以向个体施用介于10至2000mg之间，优选介于20至IOOOmg之间，介于50至500mg之间或者介于50至250mg之间的大豆苷元,或者以纯净物的形式或者作为包含大豆苷元的产品的一部分来施用。在其他的实施方案中，被施用的大豆苷元的量高达IOOOmg,高达500mg或者高达250mg。在每一次施用变化量的大豆苷元以后，所述测试也可以进行数次，例如两次或三次。由于从大豆苷元到雌马酚的转化在不同的个体之间存在差异，所述试验也能够用于检测个体是否为强大的雌马酚生产者或者他是否仅部分地转化大豆苷元。根据本发明，并且与本领域已知的方法(如薄层色谱法)形成对比，没必要展开所述测试条。出现颜色变化而无需将已经与水溶液接触的所述测试条置于化学品中以诱导颜色变化。相反，由于所述测试条与雌马酚的化学反应，在所述测试条与雌马酚接触以后开始颜色变化。优选地，将所述样品与所述测试条接触以后迅速出现颜色变化，例如在一分钟以内或者小于30秒。优选地，在消耗大豆苷元以后，雌马酚浓度在雌马酚生产者的尿液中的雌马酚的生理学浓度范围之内时出现颜色变化。优选地，水溶液包含至少O. 5%，或者至少O. 1%或者至少O. 05%或者至少O. 01%的雌马酚(w/v)。本发明的主题也是本发明的测试条在通过颜色变化来检测雌马酚中的用途。本发明的方法优选为一项诊断方法。本发明的测试条和方法解决了本发明所面临的问题。所述测试条允许在快捷、简单和特定的方法中检测雌马酚。所述测试条可以被人使用，所述人想要检测他/她是否为雌马酚生产者。所述测试条还可以被第一人使用以检测第二人是否为雌马酚生产者或者来自于第二人的样品是否包含雌马酚。例如，所述第一人可以是实验室工作者、医务工作者或其他职业人员，如营养师或膳食顾问。除了所述测试条以外，本发明的方法不需要复杂的仪器或特定的化学品。
图I显示了与根据实施例5的尿液(其不包含雌马酚)接触的测试条。图2显示了与根据实施例8的包含O. 05%雌马酚的尿液接触的测试条。图3显示了与根据实施例9的包含O. 1%雌马酚的尿液接触的测试条。
具体实施例方式实施例实施例I至4 :测试条的制备制备如下的标准外消旋雌马酚溶液
权利要求
1.一种通过颜色变化来检测雌马酚的测试条。
2.根据权利要求I所述的测试条，其中当所述条与包含雌马酚的水溶液接触时出现所述颜色变化。
3.根据上述权利要求中至少一项所述的测试条，其中通过黄色、橙色或红色的颜色来指示雌马酚的存在。
4.根据上述权利要求中至少一项所述的测试条，其中所述水溶液是尿液、血液或其部分。
5.根据上述权利要求中至少一项所述的测试条，所述测试条的长度为I至20cm且宽度为 O. 2 至 2cm。
6.根据上述权利要求中至少一项所述的测试条，其中采用硝酸浸溃所述测试条。
7.一种用于生产根据上述权利要求中至少一项所述的测试条的方法，所述方法包括将载体与包含硝酸的浸溃水溶液接触。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述浸溃溶液包含有机溶剂，优选脂肪醇，和/或碱金属或碱土金属的氢氧化物。
9.根据上述权利要求中至少一项所述的方法，其中所述有机脂肪醇是戊醇和/或所述金属氢氧化物是氢氧化钠。
10.根据上述权利要求中至少一项所述的方法，其中所述溶液的pH低于2。
11.根据上述权利要求中至少一项所述的方法，其中所述载体是纸、纤维素、硝基纤维素或有机聚合物。
12.根据上述权利要求中至少一项所述的方法，其包含下列步骤 (a)提供载体和包含硝酸的浸溃水溶液， (b)采用所述溶液浸溃所述载体，和 (C)干燥所述载体。
13.一种通过颜色变化来检测雌马酚的测试条，其通过根据上述权利要求中至少一项所述的方法来获得。
14.一种用于检测水溶液是否包含雌马酚的方法，其包含下列步骤 (A)将所述水溶液与根据上述权利要求中任一项所述的测试条接触， (B)检测存在或缺乏颜色变化， (C)从存在或缺乏颜色变化来推断所述溶液是否包含雌马酚。
15.一种用于检测人是否为雌马酚生产者的方法，其包含下列步骤 (i)将来自于所述人的尿液、血液或其部分与根据上述权利要求中任一项所述的测试条接触， ( )检测存在或缺乏颜色变化， (iii)从存在或缺乏颜色变化来推断所述人是否为雌马酚生产者。
16.根据权利要求15所述的方法，其中在步骤(i)以前，所述人已经消耗预定量的大豆苷元或者包含大豆苷元的产品。
17.根据上述权利要求中至少一项所述的测试条在通过颜色变化来检测雌马酚中的用途。
全文摘要
本发明的主题是通过颜色变化来检测雌马酚的测试条。本发明的主题也是生产所述测试条的方法、使用所述测试条的方法以及所述测试条的用途。
文档编号G01N33/52GK102884429SQ201180009525
公开日2013年1月16日 申请日期2011年2月25日 优先权日2010年3月1日
发明者J·D·施米德 申请人:系统生物股份有限公司