专利名称：使用单个发光颗粒的光强度的光学分析方法
技术领域：
本发明涉及光学分析方法，其能够通过使用可检测来自溶液中的微小区域的光的光学系统如共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统，检测来自诸如分散或溶解于溶液中的原子、分子或其聚集体(下文中，这些称为“颗粒”)例如生物分子如蛋白质、肽、核酸、月旨质、糖链、氨基酸或这些的聚集体、病毒和细胞等粒状对象，或者非生物颗粒的光，从而在颗粒的状态(相互作用、结合或解离状态等)的分析中获得有用信息，更具体地，涉及使用如上所述的光学系统检测来自单独发光的单个颗粒的光，从而使得可进行各种光学分析的方法。就这一点而言，在本说明书中，发光的颗粒(下文称为“发光颗粒”)可为其本身发光的颗粒、和任意发光标签或任意发光探针已附着的颗粒中的任一种，从发光颗粒发出的光可为荧光、磷光、化学发光、生物发光、散射光等。
背景技术：
根据近年来光学测量技术的发展，通过使用共焦显微镜光学系统和能够计数光子(单一光子检测)的超高灵敏光检测技术已变得可在单一光子或单一荧光分子水平下检测和/或测量微光。因此，存在借助此类微光测量技术进行生物分子等的特性、分子间相互作用、结合或解离反应的检测的各种提议的装置或方法。例如，在借助激光共焦显微镜光学系统和光子计数技术的突光相关光谱学(fluorescence correlation spectroscopy, FCS,参见例如专利文献1-3和非专利文献1-3)中，对进出试样溶液的微小区域(显微镜的激光集中的焦点区域，称为“共焦体积(confocal volume)”)的荧光分子或荧光标记的分子(荧光分子等)的荧光强度进行测量，并基于由所测量的荧光强度的自相关函数值来确定的荧光分子等的平均滞留时间(dwell time)(平移扩散时间)和微小区域中滞留分子数的平均值，实现了信息如荧光分子的移动速度、尺寸或浓度等的获得，和/或各种现象如分子结构或尺寸的变化、分子的结合或解离反应或者分散和凝集的检测。另外，在荧光强度分布分析(Fluorescence Intensity Distribution Analysis, FIDA,例如专利文献4、非专利文献4)或光子计数直方图(Photon Counting Histogram, PCH,例如专利文献5)中，生成有与FCS类似测量的进出共焦体积的荧光分子等的荧光强度的直方图；通过将统计学模型公式拟合(fitting)为直方图的分布来计算荧光分子等的固有亮度的平均值和滞留在共焦体积中的分子的平均数，从而基于这些信息，可估计分子的结构或尺寸的变化、结合或解离状态或分散和凝集状态。此外，在专利文献6和7中，提出了基于使用共焦显微镜光学系统测量试样溶液的荧光信号的时间经过(time progress)来检测荧光物质的方法。专利文献8已提出了通过光子计数技术测量从流经流式细胞仪的荧光细颗粒或固定在基板上的荧光细颗粒的微光以检测流路中或基板上荧光细颗粒的存在的信号计算处理技术。特别地，根据采用使用共焦显微镜光学系统和光子计数技术如FCS和FIDA对微小区域的荧光测量技术的方法，测量所需的试样量可极小(用于一次测量的量至多几十μ L)，与现有技术相比其浓度极低，测量时间也大幅缩短(在一个实施方案中，重复几次时间为秒级的测量过程)。因此，期望这些技术，特别是在进行通常用于医学或生物学研究和开发领域中的稀有或昂贵的试样的分析时，或在进行如病的临床诊断或生物活性物质筛选等的大量试样的试验时，与常规生物化学方法相比，为能够以低成本和/或快速地实验或检查的强有力的工具。现有技术文献专利文献专利文献1:日本专利特开公布2005-098876专利文献2:日本专利特开公布2008-292371专利文献3:日本专利特开公布2009-281831专利文献4:日本专利4023523专利文献5:TO2008-080417专利文献6:日本专利特开公布2007-20565专利文献7:日本专利特开公布2008-116440专利文献8:日本专利特开公布4-337446非专利文献非专利文献I:Masataka Kaneshiro; “Protein, Nucleic acid, Enzymelo1.44，Nο.9，1431 - 1438 页，1999。非专利文献2:F.J.Meyer-Alms; “Fluorescence CorrelationSpectroscopy” edt.R.Rigler, Springer, Berlin, 204 - 224 页,2000。非专利文献3:Noriko Kato,等人.“Gene medicine”，Vol.6，N0.2，271-277 页。非专利文献4:P.Kask, K.Palo, D.Ullmann, K.Gall PNAS96, 13756-13761 (1999)。
发明内容
发明要解决的问题在使用共焦显微镜光学系统和光子计数技术的上述光学分析技术如FCS和FIDA中，尽管所测光为从单个或多个荧光分子中发出的光，但在光分析中进行统计程序来计算荧光强度波动等，如在时间序列中测量的荧光强度数据的自相关函数的计算或该荧光强度数据的直方图的拟合，因而未观察或分析来自单独荧光分子的光的信号。即，在这些光学分析技术中，通过统计学处理来自多个荧光分子等的光的信号，将检测出荧光分子等的统计学平均特性。因此，为了获得在这些光学分析技术中的统计学上显著的结果，荧光分子(其为试样溶液中的待观测对象物)等的浓度或数密度应为在平衡状态下时长为秒级的一次测量中，使能够进行统计学处理的数量的荧光分子等进出微小区域，优选使约一个荧光分子等总是存在于微小区域中。事实上，由于共焦体积的体积约为lfL，因此在用于上述光学分析技术的试样溶液中荧光分子等的浓度典型地处于InM以上的水平，而处于远低于InM下，产生在共焦体积中不存在荧光分子等的时间，从而将不会获得统计学上显著的分析结果。另一方面，在专利文献6-8中记载的荧光分子等的检测方法中，不包括荧光强度波动的统计学计算处理，从而可检测出甚至在试样溶液中处于小于InM的荧光分子等，但未实现在溶液中随机运动的荧光分子等的浓度或数密度的定量计算。然后，在日本专利申请2010-044714和PCT/JP2011/53481中，本申请的申请人在新原理的基础上提出了光学分析技术，所述新原理使得可在发光颗粒(待观测对象物)的浓度或数密度的水平比使用包括统计学处理的光学分析技术如FCS和FIDA的水平低的试样溶液中定量观测发光颗粒的状态或特性。简言之，在该新的光学分析技术中，使用可检测来自溶液中的微小区域的光的光学系统，如类似于FCS、FIDA等的共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统，另外，微小区域的位置即光的检测区域(下文成为“光检测区域”)在试样溶液中移动，即用微小区域扫描试样溶液内部，并且当在试样溶液中分散并随机运动的发光颗粒横穿微小区域的内部时，检测从发光颗粒发出的光，从而单独检测出试样溶液中的各发光颗粒，以便变得可进行发光颗粒的计数并获取关于试样溶液中发光颗粒的浓度和数密度的信息。根据该新型光学分析技术(此后称为“扫描分子计数法”)，不仅与光学分析技术如FCS和FIDA相类似地，测量所必需的试样量少(例如，约几十yL)和测量时间短，而且，与光学分析技术如FCS和FIDA的情况相比，变得可在更低浓度或数密度下检测发光颗粒的存在并定量检测其特性如浓度或数密度。顺便提及，在上述使用共焦显微镜光学系统和光子计数技术的光学分析技术中，根据FIDA，可估计每单个发光颗粒的荧光强度，因而可用每单个发光颗粒的荧光强度的量级来表征发光颗粒(特性)并基于其特性进行试样溶液中的“发光颗粒的鉴定”(说明或鉴定发光颗粒的种类或者证实或确定是何种发光颗粒或所检出的发光颗粒是哪个发光颗粒)。例如，在将荧光标签与两种颗粒附着下进行FIDA的情况中，其中在两种颗粒是否相互结合未知的情况下，由于作为一个单位移动的发光颗粒的荧光强度的量级可根据FIDA检测，因此可由荧光强度的量级来确定两种颗粒作为独立的单一单位存在还是作为结合体(结合体的荧光强度为单一单位的荧光强度的二倍)存在。然而，正如前面所提及，在FIDA的情况中，通过统计学处理，例如似合为时间序列荧光强度数据的直方图来确定每单个发光颗粒的荧光强度，因而试样溶液中观测对象物所需的发光颗粒的浓度通常约为InM，并且当发光颗粒的浓度比InM小得多时难以获得准确结果。例如，在如上所述的两种颗粒的结合反应试验中结合作用弱或者总颗粒的数量小的情况中，仅形成少量结合体，因此，统计学处理可能掩盖来自结合体的光的信息(即，可能不会检测出所述信息)。与FIDA相反，根据上述扫描分子计数法，甚至当发光颗粒(试样溶液中的待观测对象物)的浓度大幅低于FIDA中良好测量的水平时，也可测量由单个发光颗粒发出的发光强度。在扫描分子计数法中，在时间序列光强度数据中，可单独检测出当进入光检测区域时对应于由单个发光颗粒发出的光的具有山形或大致钟形的谱的光强度变化的信号，因而，此时通过单独测量各信号的强度，将测量从单个发光颗粒发出的光强度，并且似乎可基于由单个发光颗粒发出的光强度实现发光颗粒的表征或发光颗粒的鉴定。然而，使用在扫描分子计数法中测量的单个发光颗粒的发光强度的绝对值本身难以进行发光颗粒的表征和发光颗粒的鉴定。在共焦显微镜或多光子显微镜光学系统的实际光检测区域(即共焦体积)中，激发光强度不均一，通常具有钟形分布，该钟形分布的峰位于光检测区域的近似中心。因此，在用光检测区域扫描的光测量法中，所测量的发出的光强度根据发光颗粒在光检测区域所穿过的位置而不同，导致来自同种发光颗粒的发光强度的绝对值的离散(scattering)，此外，在当发光强度弱的颗粒穿过激发光强度强的部位时所需的信号强度与当发光强度强的颗粒穿过激发光强度弱的部位时所需的信号强度之间无区别。即，在扫描分子计数法中测量的发光强度的绝对值不是发光颗粒的特征值，因此，需要新方法来试图使用单个发光颗粒的发光强度来表征或鉴定发光颗粒。
因此，本发明的一个目的为提供基于在比可由FIDA良好测量的水平更低的浓度的发光颗粒的试样溶液中单个发光颗粒的发光强度能够表征发光颗粒或鉴定发光颗粒的新的光学分析方法。此外，本发明的另一目的为提供在扫描分子计数法中，使用单独测量的单个发光颗粒的发光强度来确定发光颗粒所特有的量，从而能够表征或鉴定颗粒的新的光学分析方法。用于解决问题的方案根据本发明，上述目的通过通过使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统来检测和分析来自在试样溶液中分散并随机运动的发光颗粒的光的方法来实现，所述方法的特征在于包括以下步骤:制备包含发光颗粒的试样溶液，所述发光颗粒具有第一发光部位和具有与所述第一发光部位不同的发射波长的第二发光部位；通过改变所述光学系统的光路而在所述试样溶液中移动所述光学系统的光检测区域的位置；在所述试样溶液中移动所述光检测区域的位置，单独并同时测量来自所述光检测区域的所述第一发光部位的光强度和所述第二发光部位的光强度从而产生光强度数据；在所述光强度数据中单独检测单个发光颗粒的信号指示光；利用在所述第一发光部位的光强度数据和所述第二发光部位的光强度数据中同步发生的各信号中所述第一发光部位的光强度与所述第二发光部位的光强度的比来鉴定单个发光颗粒。在该结构中，“在试样溶液中分散并随机运动的颗粒”可为诸如在试样溶液中分散或溶解并发光的原子、分子或这些的聚集体等的颗粒，其也可为在溶液中自由地进行布朗运动而不固定在基板等上的任意粒状物质。发光颗粒典型地为荧光颗粒，但可为通过磷光、化学发光、生物发光、散射光等发光的颗粒。共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统的“光检测区域”为在这些显微镜中检测光的微小区域，所述区域对应于当照明光从物镜给出时照明光聚集的区域(特别是在共焦显微镜中，根据物镜与针孔(pinhole)的空间关系来确定该区域。对于没有照明光而发光的发光颗粒，例如根据化学发光或生物发光而发光的分子，在显微镜中不需要照明光。)。另外，在本说明书的下文中，除另有说明以外，“信号”是指“表示来自发光颗粒的光的信号”。如上述所理解的，在本发明的基本结构中，即在扫描分子计数法中，在试样溶液中移动光检测区域的位置的同时，即用光检测区域扫描试样溶液的内部的同时，顺次进行光强度的测量。然后，当移动光检测区域包括随机运动的发光颗粒时，通过光检测部检测来自发光颗粒的光，从而将检测一个颗粒的存在。另外，在表示顺次检测的光的时间序列光强度数据中，单独检测表示来自发光颗粒的光的信号，从而逐个检测发光颗粒的单独存在，因而将获取溶液中颗粒状态的各种信息。在该情况下，如前面所提及，来自发光颗粒的光强度根据颗粒所穿过光检测区域的位置而不同，并且不是发光颗粒所特有的值，因此，难以利用发光颗粒的光强度的绝对值来表征发光颗粒。因此，在本发明中，将拥有发射波长相互不同的至少两种发光部位(第一和第二发光部位)的颗粒制备为发光颗粒，并单独测量从这些发光部位的光，并且观察第一发光部位的光强度与第二发光部位的光强度的比。由于第一发光部位的光强度与第二发光部位的光强度两者通常均随着激发光强度的增加或降低而一起增加或降低，因此在单个发光颗粒中第一发光部位的光强度与第二发光部位的光强度的比相对于激发光强度的变化是不变的，而不管发光颗粒所穿过的光检测区域中的位置。因此，由于认为第一发光部位的光强度与第二发光部位的光强度的比为发光颗粒所特有的值，因而可借助该比例表征发光颗粒，并基于该特性将实现发光颗粒的鉴定。在本发明的上述结构中，在该发光颗粒的种类、尺寸或特性相互不同，或者试样溶液中存在相互区分的发光颗粒的情况下，可将发光颗粒制备为使第一发光部位为其中在试样溶液中至少部分发光颗粒所共有的共有发光部位(common light-emitting site),第二发光部位为将表征各发光颗粒的固有发光部位。根据该结构，对于具有共有发光部位的发光颗粒，变得可利用来自共有发光部位的光强度与来自固有发光部位的光强度的比而将它们彼此区分。就这一点而言，共有发光部位可附着于在试样溶液中所有待观察发光颗粒，或者可将在试样溶液中所有待观察发光颗粒所共有的发光部位用作共有发光部位。在该情况下，变得可利用来自共有发光部位的光强度与来自固有发光部位的光强度的比来相互区分在试样溶液中所有待观察发光颗粒，这在各种分析中将是有利的。在上述鉴定发光颗粒的方式中，例如可利用第一发光部位的光强度与第二发光部位的光强度的比来鉴定单个发光颗粒的种类。即，通过制备发光颗粒以便第一发光部位的光强度与第二发光部位的光强度的比将根据发光颗粒的种类而不同，变得可利用强度比来鉴定对应于各信号的发光颗粒的种类。该结构可例如通过使发光颗粒中第二发光部位的种类或数量依据发光颗粒的种类而不同来实现。另外，特别地，单个发光颗粒的尺寸可利用第一发光部位的光强度与第二发光部位的光强度的比来鉴定。如稍后描述的实施方案所示，在发光颗粒的类型为单个发光颗粒的第二发光部位的数量随其尺寸的增加而变大的情况下，由于来自第二发光部位的光强度相对于第一发光部位的光强度随发光颗粒的尺寸而变化，发光颗粒的尺寸还可根据第一发光部位的光强度与第二发光部位的光强度的比的增加或降低来确定。在上述结构中，光强度数据中对应于单个发光颗粒的信号检测可基于信号形状来完成。在一个实施方案中，典型地，当检测出具有比预设阈值高的强度的脉冲状信号(pulseform signal)时,其信号为对应于一个发光颗粒的信号，因此,可判定在信号产生期间在光检测区域中存在一个发光颗粒。可例如以如下形式进行两个光强度数据中同步发生的信号的检测:当表示在第一发光部位的光强度数据中发光颗粒的光的信号产生期间与表示在第二发光部位的光强度数据中发光颗粒的光的信号产生期间重叠时，将这些信号检测为同步发生的信号；或者当第一发光部位的光强度数据中信号峰的时间和第二发光部位的光强度数据中信号峰的时间之差小于预设值时，将这些信号检测为同步发生的信号。就这一点而言，在本发明的上述结构中，可计数所鉴定的单个发光颗粒的数量(颗粒的计数)。在该情况下，通过将所鉴定的发光颗粒的数量与光检测区域的位置的移动量相关联，将获取试样溶液中发光颗粒的数密度或浓度的信息。特别地，通过借助任意方法，例如借助在预定速度下移动光检测区域的位置来确定光检测区域的位置的移动轨迹的整个体积，可具体计算发光颗粒的数密度或浓度。当然，代替直接确定绝对数密度值或浓度值，可计算与多个试样溶液或作为浓度或数密度的参考的标准试样溶液相对的数密度或浓度的相对比值。应理解的是，根据本发明，鉴定了对应于单独(同步发生的)信号的发光颗粒，从而，可进行通过发光颗粒的种类、特性或尺寸来单独计数发光颗粒的数量，和/或确定其浓度或数密度，因此，本发明的方法可有利地用于各种分子间相互作用、结合或解离状态的分析。
此外，在本发明的上述结构中，关于移动光检测区域的位置的步骤，试样溶液中光检测区域的位置的移动速度基于试样溶液中发光颗粒的特性或者数密度或浓度而适当变化。如本领域普通技术人员所理解的，来自发光颗粒的检测光的状态可根据发光颗粒在试样溶液中的特性、数密度或浓度而变化。特别地，当光检测区域的移动速度变快时，从一个发光颗粒获得的光的量将减少，因而优选光检测区域的移动速度可适当变化，以便可精确地或以足够的灵敏度测量来自一个发光颗粒的光。此外，关于上述移动光检测区域的位置的步骤，优选将试样溶液中光检测区域的位置的移动速度设为高于发光颗粒的扩散运动速度(由布朗运动所引起的颗粒的平均运动速度)。如上所解释的，在本发明的方法中，光检测区域检测来自发光颗粒的光，以便将单独检测发光颗粒。然而，当发光颗粒由于布朗运动而随机移动，从而多次进出光检测区域时，将多次检测来自一个发光颗粒的信号(显示其存在)，因此，将变得难以使一个发光颗粒的存在与所检测信号相关联。那么，如上所述，将光检测区域的移动速度设定为高于发光颗粒的扩散运动速度，从而变得可将一个发光颗粒与一个信号相对应。就这一点而言，由于扩散运动速度依赖于发光颗粒而不同，因此如上所述，优选可根据发光颗粒的特性(特别是扩散常数)适当地改变光检测区域的移动速度。可以以任意方式进行光学系统的光路的改变以移动光检测区域的位置。例如，可通过使用激光扫描式光学显微镜中所采用的电流镜(galvanomirror)改变光路来改变光检测区域的位置。光检测区域的位置的移动轨迹可任意设定，例如可从圆形、椭圆形、矩形、直线和曲线轨迹中选择。在这一点上，在本发明中，由于通过改变光学系统的光路来移动光检测区域的位置，在实质上不发生在试样溶液中的机械振动和流体动力效应的情况下快速移动光检测区域，因而可在稳定状态下而不影响试样溶液中发光颗粒的动力学作用(无人为现象(artifact))的条件下进行光测量(例如，当试样中产生流动时，不仅难以使流动速度总是保持均一，而且也将使装置结构变得复杂，另外，不仅所需试样量大幅增加，而且还可使溶液中的发光颗粒或其它物质因流动的流体动力学作用而劣化或变性)。另外，由于不需要使试样溶液流动的结构，因此与FCS和FIDA等相类似可用少量试样溶液(在一至几十μL的水平下)来进行测量和分析。典型地，将本发明的方法用于生物学粒状对象物如生物分子，诸如蛋白质、肽、核酸、脂质、糖链、氨基酸或它们的聚集体等、病毒和细胞等的溶液中的状态分析，但也可用于非生物颗粒(例如，原子、分子、胶束、金属胶体等)的溶液中的状态分析，应理解的是，这种情况也属于本发明的范围内。发明的效果总体来说，在本发明的方法中，注意到从单个发光颗粒的两种发光部位发出的光强度的比相对于激发光强度的变化是不变的，即该比例可为发光颗粒所特有的特性，而不管发光颗粒所穿过的共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统的光检测区域中的位置，借助上述光强度比对在扫描分子计数法中检测的单个发光颗粒的各光信号进行发光颗粒的鉴定。如已说明的，单独检测来自单个发光颗粒的光的扫描分子计数法在无统计学处理如计算荧光强度波动下进行，并可用于其中颗粒的数密度或浓度显著低于光学分析技术如FCS和FIDA所需水平的试样溶液，另外，可以说本发明的能够在扫描分子计数法中鉴定发光颗粒的方法使得可对处于比可由FIDA分析的浓度范围低的水平的单个发光颗粒进行鉴定。另外，根据本发明，变得可在扫描分子计数法中实现单个发光颗粒的表征和鉴定，因而，也可实现种类、特性或尺寸相互不同的发光颗粒的区分，因此期望扫描分子计数法的应用范围扩展到浓度极低或分子间相互作用相对弱的发光颗粒的观察和分析中。例如，甚至在试样溶液中两种以上的发光颗粒的相互作用弱，从而仅形成这些发光颗粒的微量结合体的情况下(例如，处于FIDA难以检测的水平)，本发明的方法将有利地用于结合体的存在的证实、计数等。 通过解释本发明的以下优选实施方案，本发明的其它目的和优势将变得清楚。
[图1]图1(A)为进行本发明所使用的光学分析装置的内部结构的示意图。图1(B)为共焦体积(共焦显微镜的光检测区域)的示意图。图1(c)为改变镜7的方向以在试样溶液中移动光检测区域的位置的机构的示意图。[图2]图2(A)和(B)分别为解释用于本发明的扫描分子计数法中的光检测原理的示意图和所测量光强度随时间的变化的示意图。[图3]图3为解释根据本发明的方法利用单个发光颗粒中两种以上发光部位的光强度的比来鉴定发光颗粒的图。(A)和(B)为在发光颗粒穿过光检测区域的不同位置的情况下分子状态的模式图和光强度的时间变化；(C)和(D)为在一方种类的发光部位的数量依据发光颗粒而不同的情况下分子状态的模式图和光强度的时间变化；(E)和(F)为在一方种类的发光部位的种类依据发光颗粒而不同的情况下分子状态的模式图和光强度的时间变化。[图4]图4为以流程图的形式示出根据本发明的方法进行光测量和来自两种以上发光部位的光的强度比计算的扫描分子计数法的步骤的图。[图5]图5(A)和(B)为在发光颗粒由于布朗运动而穿过光检测区域情况下和在发光颗粒通过以比发光颗粒的扩散运动速度快的速度移动试样溶液中光检测区域的位置而穿过光检测区域的情况下的模式图。图5(C)示出解释根据扫描分子计数法在由所测时间序列光强度数据(光子计数的时间变化)检测发光颗粒的存在的过程中所检信号的信号处理步骤的实例的图。[图6]图6 (A)示出所测光子计数数据的实例(条形图)；通过进行使数据平滑化所获得的曲线(虚线)；和在脉冲存在区域拟合的高斯函数(实线)。在该图中，将由于噪音或污染物而标有“噪音”的信号不视为信号。图6(B)为解释判断在不同波长带域的时间序列光强度数据上产生的信号是否同步发生的处理的图。[图7]图7(A)为通过根据本发明的方法进行的扫描分子计数法(实施方案I)所观察的已附着有两种荧光标签的寡核苷酸分子(1T-A、2T-A)模式图，和图7(B)为以条形图形式示出在IT-A和2T-A所观察的同步发生的脉冲中两种荧光强度的比(峰强度比)的产生频率(同步发生的脉冲的数量)的图。[图8]图8(A)为通过根据本发明的方法进行的扫描分子计数法(实施方案2)所观察的已附着有两种突光标签(其中一方种类的突光标签的数量依据链长而不同)的DNA的模式图，和图8(B)为示出相对于DNA链长的两种荧光强度的比(峰强度比)的变化的图。[图9]图9示出计算荧光强度波动的常规光学分析技术中所获得的光子计数(光强度)的时间变化的实例，其中(A)示出颗粒浓度为提供足够测量精度的水平的情况，(B)示出试样中的颗粒浓度比(A)情况显著低的情况。附图标记说明I—光学分析装置(共焦显微镜)2光源3—单模光纤4准直透镜5，14a二 向色镜6，7，11反射镜8物镜9微型板10—孔(试样溶液容器)12聚光透镜13针孔14屏障滤光片15—多模光纤16光检测器17镜偏转器17a载物台位置改变设备18 计算机
具体实施例方式下文中，详细描述本发明的优选实施方案。光学分析装置的结构在基本结构中，根据本发明的方法可用通过结合能够进行FCS、FIDA等的共焦显微镜和光检测仪的光学系统构成的光学分析装置来实现。在这一点上，在本发明的方法中，特别地，进行两种以上的波长带域相互不同的光的测量，因此，使用如图1(A)示意性所示的可测量两种以上的波长带域相互不同的光的装置。具体地，参照图1(A)，光学分析装置I由光学系统2-17和用于与控制光学系统中各部分的操作一起来获取和分析数据的计算机18构成。光学分析装置I的光学系统可与常规共焦显微镜的光学系统相同，其中从光源2发出并通过单模光纤3的内部传输的激光(Ex)形成发散为以在由光纤发射端的固有NA决定的角度放射的光；在用准直透镜4形成平行光束后，光在二向色镜5和反射镜6和7上反射,进入物镜8。就这一点而言,为了可根据激发发光颗粒的光的波长而适当选择激发光的波长，如图所示，可在光源2中制备两个以上的发光源(激光)。当同步观察的发光颗粒的至少两种发光部位的激发光的波长彼此不同时，光从两个以上的发光源同步发出并被导入物镜8。在物镜8上方，典型地放置有向其中分散有I至数十μ L试样溶液的试样容器或具有排列于其上的孔10的微型板9，从物镜8发出的激光聚焦在试样容器或孔10中的试样溶液中，形成光强度强的区域(激发区域)。在试样溶液中，分散或溶解了作为与发光标签如荧光染料附着的典型分子的发光颗粒(待观察对象物)，当发光颗粒进入激发区域时，发光颗粒在位于激发区域期间被激发并发光。发出的光(Em)在穿过物镜8和二向色镜5后在镜11上反射，并由聚光透镜12聚集，然后光芽过针孔13。就这一点而目，如本领域技术人员所公知的，针孔13位于物镜8的焦点位置的接合(conjugate)位置，从而，如图1(B)所示意性示出的，在来自除聚焦面以外的区域的光被阻断时，仅从激光的焦点区域，即激发区域发出的光穿过针孔13。图1(B)所示的激光的焦点区域为该光学分析装置中的光检测区域，其有效体积通常为约Ι-lOfL，称为“共焦体积”。典型地，在共焦体积中，光强度根据在所述区域中心具有峰的高斯型或洛伦兹型分布而散布，有效体积为与光强度减少至峰强度的Ι/e2的表面毗连的近似椭圆体的体积。然后，以部分波长带域的光被反射并且剩余的波长带域的光穿透二向色镜14a的方式将已穿过针孔13的光根据波长带域分开，所分开的光的各成分通过相应的屏障滤光片14传输(其中仅选择在特定波长带域中的光成分)；并且被导入多模光纤15中，到达相应光检测器16，在转换成时间序列电信号后，将信号输入计算机18，以稍后解释的方法进行光学分析处理。对于光检测器16，优选使用可用于光子计数的超高灵敏度的光检测器，以便可检测来自一个发光颗粒的光，例如来自一个或多个荧光染料分子的微光。此外，在上述光学分析装置的光学系统中，进一步提供用于改变光学系统的光路从而用光检测区域扫描试样溶液的内部，即在试样溶液的内部移动焦点区域即光检测区域的位置的机构。对于移动光检测区域的位置的该机构，例如，可采用如图1(C)所示意性示出的改变反射镜7的方向的镜偏转器17。该镜偏转器17可与装备在常规激光扫描型显微镜上的电流镜装置相同。此外，为了获得期望的光检测区域的位置的移动模式，在计算机18的控制下，与光检测器16的光检测相协调地驱动镜偏转器17。光检测区域的位置的移动轨迹可从圆形、椭圆形、矩形、直线和曲线轨迹，或者这些的组合中任意选择(可设计计算机18中的程序以便可选择各种移动模式)。就这一点而言，尽管未说明，但光检测区域的位置可通过上下移动物镜8而沿垂直方向移动。正如所提及的，根据改变光学系统的光路以移动光检测区域的位置从而代替移动试样溶液的结构，在试样溶液中基本上既不会发生机械振动也不会发生流体动力作用，因此变得可消除动力作用对于待观察对象物的影响，实现稳定测量。另外，对于额外结构，在显微镜的载物台(未示出)上，可设置有用于移动微型板9的水平位置的载物台位置改变设备17a，以便改变待观察的孔10。载物台位置改变设备17a的操作可通过计算机18来控制。
在发光颗粒通过多个光子吸收而发光的情况下，将上述光学系统用作多光子显微镜。在该情况下，由于仅从激发光的焦点区域(光检测区域)发光，所以可将针孔13移除。另外，在发光颗粒由于化学发光或生物发光现象在非激发光下发光的情况下，可省略用于产生激发光的光学系统2-5。当发光颗粒由于磷光或散射光而发光时，原样使用上述共焦显微镜的光学系统。
_7] 本发明方法的原理如“发明内容”栏中所述，简言之，在本发明的方法中，基于如下原理:在具有至少两种发射波长彼此不同的发光部位的发光颗粒中，这些至少两种发光部位的光强度比不依赖于显微镜的光检测区域中发光颗粒的位置，发光颗粒的特征在于来自至少两种发光部位的光强度比，从而在扫描分子计数法中进行发光颗粒的鉴定。换言之，可以说，本发明的一个实施方案为扫描分子计数法的改进。下文中，描述扫描分子计数法和本发明方法的原理。1.扫描分子计数法的原理光谱分析技术如FCS、FIDA等的优点在于与常规生物化学分析技术相比所需试样量极小并且可迅速进行试验。然而，在这些光谱分析技术如FCS、FIDA等中，发光颗粒的浓度和特性主要基于荧光强度波动来计算，因此，为了获得精确的测量结果，如图9(A)示意性描绘的，在荧光强度测量期间试样溶液中发光颗粒的浓度或数密度应处于在光检测区域CV中总是存在约一个发光颗粒的水平，以便如图右手边所示在测量期限内总能检测到显著的光强度(光子计数)。如图9(B)所描绘的，当发光颗粒的浓度或数密度低于例如发光颗粒很少进入光检测区域CV的水平下的浓度或数密度时，如图右手边所示在部分测量期限内将不出现显著的光强度信号(光子计数)，因此，精确计算光强度波动将变得困难。此外，当发光颗粒的浓度显著低于在测量期间在光检测区域内部总是存在约一个发光颗粒的水平时，光强度波动的计算将会受到背景的影响，应使测量期限变长，从而获得足以计算的显著量的光强度数据(光子计数)。然后，在日本专利申请2010-044714和PCT/JP2011/53481中，本申请的申请人基于如下新原理而提出“扫描分子计数法”:即使当发光颗粒的浓度低于上述光谱分析技术如FCS和FIDA所要求的水平时，该技术也能够检测发光颗粒的特性如数密度或浓度。在扫描分子计数法中，简言之，作为要进行的步骤，光检测与在试样溶液中移动光检测区域CV的位置一起进行，S卩，与如图2示意性描绘的，通过驱动用于移动光检测区域的位置而改变光路的机构(镜偏转器17)来用光检测区域CV扫描试样溶液的内部一起进行。然后，例如如图2(A)所示，在移动光检测区域CV期间(图中，时间t0-t2)，当光检测区域CV穿过其中存在一个发光颗粒的区域时(tl)，从发光颗粒发出光，并出现如图2 (B)所示的具有显著的光强度(Em)的脉冲状信号。因此，在进行如上所述的光检测区域CV的位置移动和光检测期间，通过逐个地检测如图2(B)所示出现的各脉冲状信号(显著的光强度)，来单独检测发光颗粒，并通过计算其数量而可获取关于存在于测量区域的发光颗粒的数量、浓度或数密度的信息。在扫描分子计数法的原理中，未进行统计学计算处理如荧光强度波动的计算，并且颗粒是逐个测量的，因此，即使在具有处于FCS、FIDA等无法获得足够精确分析的水平下的低颗粒浓度的试样溶液中也可获得关于颗粒的浓度或数密度的信息。2.根据本发明的发光颗粒的鉴定原理在进行上述扫描分子计数法的实际实验体系中，光检测区域中激发光的强度不均一，通常从光检测区域中心的峰向所述区域边缘降低，另外，相对于从光检测区域经针孔至光检测器的路径，来自光检测区域的整个区域的光强度并不绝对均一地到达光检测器。即，由特定发光颗粒发出的光(或用光检测器检出的光)的强度依据光检测区域中发光颗粒的位置而变化(因此，在扫描分子计数法中，典型地当检测的脉冲状信号的强度在认定为来自发光颗粒的光的规定限度内时，将信号判定为来自发光颗粒的光信号)。因此，例如，在观察两种发光颗粒的情况下，即使这些发光颗粒的量子产率或发光能力(在相同条件下发出的光的强度)相互不同，也难以参考它们光强度的绝对值来将它们区分。然而，如前面所述，在发光颗粒具有至少两种发光部位的情况下，由于认为当发光颗粒的尺寸与光检测区域相比足够小时这些发光部位在光检测区域中的位置几乎是一致的，因此这些发光部位的光强度比不依赖于显微镜的光检测区中发光颗粒的位置。例如，如图3 (A)示意性示出，当具有发出波长I的光的发光部位α和发出波长II的光的发光部位β的发光颗粒穿过光检测区域的近似中心时(tl)和当相同发光颗粒穿过光检测区域边缘邻域时(t2)，如图3(B)示意性示出，从各发光部位发出的所检光强度相互不同，而波长I的光强度与波长II的光强度的比被认为是基本上彼此相等。另外，参考光强度比，变得可鉴定发光颗粒并区分发光颗粒的种类。因此，在本发明中，通过将具有不同发射波长的两种发光部位附着至待观察的发光颗粒或通过利用发光颗粒固有的发光部位，并参考从发光颗粒的发光部位发出的光的强度，将进行发光颗粒的鉴定。根据上述方式，参考发光颗粒上至少两种发光部位的光强度比来鉴定发光颗粒，变得可以以各种方式区分相互不同的发光颗粒。例如，如图3(C)示意性所示，在具有发出波长I的光的发光部位α和发出波长II的光的发光部位β的发光颗粒a以及具有发出波长I的光的发光部位α和发出波长II的光的两个发光部位β的发光颗粒b的存在下(即，当发光颗粒之一的一种发光部位的数量不同于另一发光颗粒的对应发光部位的数量时)，即使发光颗粒a穿过光检测区域的近似中心(tl)，而发光颗粒b穿过发光区域的边缘邻域(t2)，从而它们的波长II的光强度几乎彼此相等，在发光颗粒a和发光颗粒b之间，波长I的光强度与波长II的光强度的比也相互不同，因而可参考光强度比来判定各信号中哪个信号在发光颗粒a和发光颗粒b的信号中。另外，通过单独计数发光颗粒a和b的信号数，变得可获取各数密度或浓度的信息以及其他信息。此外，在任选的方式中，例如，如图3 (E)不意性不出，在具有发出波长I的光的发光部位α和发出波长II的光的发光部位β的发光颗粒a以及具有发出波长I的发光部位α和发出波长II的光的发光部位Y (量子产率与发光部位β不同)的发光颗粒c的存在下(即，当发光颗粒之一的一种发光部位的种类不同于另一发光颗粒的对应发光部位的种类时)，在发光颗粒之间发光部位的光强度比将相互不同，不管发光颗粒在何处穿过光检测区域。因此，可判定各信号中哪个信号在发光颗粒a和发光颗粒c的信号中，并且变得可有区分地参考这些。另外，通过单独计数发光颗粒a和c的信号数，变得可获取各数密度或浓度的信息以及其他信息。上述鉴定或区分发光颗粒的方法可用于例如测试某两种颗粒是否已彼此结合(结合和解离反应的检测)或用于估计分子的发光部位数随其分子尺寸而变化的分子的分子尺寸(参见下述实施方案I和2)。就这一点而言，在上述本发明的方法用于区分两种以上的发光颗粒的情况下，在计算和比较光强度比中，至少部分、优选全部发光颗粒(待观察对象物)拥有相同的发光部位是有利的。因此，优选共有发光部位可附着于所有发光颗粒(待观察对象物)。并且各发光颗粒设置有特定的发光部位(固有发光部位)，用以鉴定各发光颗粒或将各发光颗粒与其他发光颗粒相区分，从而利用来自固有发光部位的光强度与来自共有发光部位的光强度的比可表征、鉴定各发光颗粒或与其他颗粒相区分。另外，尽管在图实例中解释了单个发光颗粒具有两种发光部位的情况，但单个发光颗粒可具有三种以上的发光部位，而发光颗粒可利用这些发光部位的光强度比表征和鉴定，并且应理解的是，此类情况也属于本发明的范围。扫描分子计数法的操作过程在用如图1 (A)所示的光学分析装置I的根据本发明的扫描分子计数法的实施方案中，具体地，进行(I)包含发光颗粒的试样溶液的制备过程，(2)测量试样溶液的光强度的过程，和(3)分析所测光强度的过程。图4以流程图的形式示出该实施方案的操作过程。(I)试样溶液的制备本发明方法中待观察颗粒只要在试样溶液中分散并在溶液中随机运动则可为任意颗粒，如溶解的分子，该颗粒可为例如生物分子即蛋白质、肽、核酸、脂质、糖链、氨基酸等，或者它们的聚集体，病毒、细胞、金属胶体或其他非生物分子(典型地，试样溶液为水溶液，但不限于此，并可为有机溶剂或其他任意液体)。另外，待观察颗粒可为自身发光的颗粒，或可为发光标签(荧光分子、磷光分子、以及化学发光或生物发光分子)以任意方式附着的颗粒。另外，为了进行本发明的方法，各颗粒(待观察对象物)需要具有第一和第二发光部位或者共有发光部位和固有发光部位。特别地，如上所述，如果各颗粒(待观察对象物)设置有共有发光部位，则在比较或鉴定所检测颗粒中是有利的，因而，任意发光标签如荧光染料可通过任意方式附着于各颗粒(待观察对象物)来作为共有发光部位。另外，对于用于鉴定和区分各颗粒(待观察对象物)的表征，任意发光标签如荧光染料可通过任意方式附着于各颗粒来作为固有发光部位。在这方面，当颗粒(待观察对象物)具有固有的发光部位时，该发光部位可用作共有发光部位或固有发光部位。重要的是发光颗粒(待观察对象物)具有至少两种发射波长不同的发光部位，以便可利用在稍后解释的光测量中检测的各波长的光强度来计算出光强度比。如何选择试样溶液中的颗粒(待观察对象物)、如何将发光标签附着于颗粒(待观察对象物)或者如何选择检测波长可通过实验实施者来适当确定，应理解的是，本领域技术人员可选择待观察颗粒或发光标签的各种组合以及检测波长带域，从而实现本发明的方法，只要发光颗粒的鉴定是根据本发明进行的，则任何情况均属于本发明的范围。(2)试样溶液的光强度的测量根据该实施方案的扫描分子计数法在光学分析的光强度的测量过程中，在驱动镜偏转器17从而在试样溶液中移动光检测区域的位置(从而在试样溶液中扫描)下，单独并同时对在两个以上的波长带域中，即在第一和第二发光部位(或共有发光部位和固有发光部位)的发射波长中的光强度进行测量(图4步骤100)。在操作过程中，典型地，在将试样溶液分散在微型板9的孔10中并将其置于显微镜的载物台上后，当使用者输入计算机18测量开始的指令时，计算机18运行存储于存储装置(未示出)中的程序(为了在试样溶液中移动光检测区域的位置而改变光路的步骤，在移动光检测区域的位置期间检测来自光检测区域的光的步骤)，然后将开始用激发光照射试样溶液中的光检测区域并测量光强度。当开始测量时，根据所述程序在计算机18的操作处理的控制下，从光源2发出试样溶液中发光颗粒的激发波长的光。特别地，在该实施方案中，由于检测到两个以上的波长带域的光，所以选择从光源2发出的激发光的波长，以便从发光颗粒中发出待检测的两个以上的波长带域的光。就这一点而言，当发光颗粒上的各发光部位的激发光波长相互不同时，将同时发出两个以上的波长带域的激光。另一方面，在根据所述程序在计算机18的操作过程的控制下使镜偏转器17驱动镜7(电流镜)以移动孔10中光检测区域的位置，与此同时，光检测器16顺次将检测的光转换为电信号并将其输送至计算机18，该计算机18以任意方式产生来自输送信号的时间序列光强度数据并将其存储。特别地，在该实施方案中，各两个以上的光检测器16检测到波长带域相互不同的光，从而产生各所检测的相互不同的波长带域的时间序列光强度数据。此外，光检测器16典型地为可检测单个光子到达的超高灵敏度的光检测器，因此光检测可为以在预设时间内顺次测量每预设的单位时间(BIN TIME)，例如每10 μ s内到达光检测器的光子的数量的方式进行的光子计数，因此时间序列光强度数据将为时间序列光子计数数据。在光强度测量期间光检测区域的位置的移动速度可为例如实验上或为了满足分析目的而任意设定的预设速度。在基于检测的发光颗粒的数量来获取数密度或浓度信息的情况下，光检测区域已通过的区域大小或体积是必要的，因此，以能够控制移动距离的方式进行光检测区域的位置移动。就这一点而言，如果经过时间与光检测区域的位置的移动距离成比例，则测量结果的解释将变得容易，因此基本上优选移动速度是恒定的，尽管不限于此。顺便提及，关于光检测区域的位置的移动速度，为了从所测量的时间序列光强度数据或发光颗粒的数量的计数来进行定量地精确地单独检测待观察发光颗粒，优选将移动速度设为比发光颗粒的随机运动，即布朗运动的运动速度更快的值。由于在该实施方案中发光颗粒(待观察对象物)为分散或溶解在溶液中并自由随机运动的颗粒，所以其位置由于布朗运动而随时间移动。因此，当光检测区域的位置的移动速度慢于由布朗运动引起的颗粒运动时，颗粒如图5(A)示意性描绘在区域中的随机运动，由此，使光强度随机变化(光检测区域中的激发光强度从在区域的中心的顶点向其外侧减少)，变得难以确定对应于各发光颗粒的显著的光强度变化(表示来自发光颗粒的光的信号)。然后，如图5(B)所示，优选将光检测区域的位置的移动速度设为比由布朗运动引起的颗粒的平均运动速度(扩散运动速度)快，以使颗粒沿近似直线穿过光检测区域，从而如图5(C)上段所示在时间序列光强度数据中，对应于各颗粒的光强度的变化谱变得几乎均一(当发光颗粒沿近似直线穿过光检测区域时，光强度变化谱与激发光强度分布相似)，并可易于确定各发光颗粒与光强度之间的对应性。具体地，由均方位移(mean-square displacement)关系的表达式给出具有扩散系数D的发光颗粒通过布朗运动而穿过半径为Wo的光检测区域(共焦体积)所需的时间Δ t:(2ffo) 2=6D.Δ t—(I)由此:Δ t= (2ffo) 2/6D—(2)
因此，通过布朗运动而移动的发光颗粒的速度(扩散运动速度)Vdif=2ffo/At=3D/ffo—(3)那么，据此，光检测区域的位置的移动速度可设为比Vdif足够快的值。例如，当期望发光颗粒的扩散系数为约D=2.0X 10_V/s时，则Vdif将为1.0X 10_3m/s，假设Wo约为
0.62 μ m,因此，光检测区域的位置的移动速度可设为其10倍以上，如15mm/s等。就这一点而言，当发光颗粒的扩散系数未知时，可通过重复进行设定光检测区域的位置的各种移动速度以求得光强度变化谱变为期望谱(典型地，类似于激发光强度分布)的条件的预实验，来确定光检测区域的位置的大致移动速度。(3)光强度分析当通过上述处理获得试样溶液中发光颗粒的各发光部位的时间序列光强度数据时，可在计算机18中通过根据存储于存储装置中的程序的处理来顺次进行:(i)各光强度数据中对应于来自发光颗粒的光的信号的检测；(ii)在检测的信号中各发光部位的时间序列光强度数据的同时发生信号(同时发生的脉冲)的检测；(iii)同步发生脉冲的强度比的计算；和(iv)各种分析如发光颗粒浓度的计算。(i)对应于发光颗粒的信号的检测当一个发光颗粒在其穿过光检测区域中的轨迹如图5(B)所示大致呈直线时，时间序列光强度数据中对应于待观察颗粒的信号中的光强度变化具有反映(由光学系统决定的)光检测区域中光强度分布的钟形谱。因此，当超过适当设定的阈值1的光强度持续的时间宽度Λ τ在预设范围内时，具有光强度谱的信号可判定为对应于已穿过光检测区域的一个颗粒，从而检测一个发 光颗粒。另外，当光检测区域中的光强度分布可被认为高斯分布时:I=A.exp (~2t2/a2)---(4),和当通过将表达式(4)拟合到显著光强度谱(可清楚判定为非背景的谱)而计算的强度A和宽度a在相应预设范围内时，可判定光强度谱对应于已穿过光检测区域的一个颗粒，从而将完成一个发光颗粒的检测(强度A和宽度a在预设范围外的谱可作为分析中的噪音或污染物而忽略。)。作为由时间序列光强度进行发光颗粒的联合检测和计数的操作方法的实例，对时间序列光信号数据(图5 (C)，最上段“检测结果(未处理)”)进行平滑化处理(图4-步骤110，图5(C)的中上段“平滑化”)。尽管由发光颗粒发出的光是随意的(stochastic)以使在微小时间内的数据值产生间断，但是数据值中的这类间断可通过平滑化处理而忽略。平滑化处理可例如通过移动平均法(moving average method)(例如,相邻平均法和萨温斯基-高类(Savinsky-Golay)法算法)、百分位滤波法(Percentile filter method)或 FFT滤波法来完成。就这一点而言，进行平滑化处理的参数，例如在移动平均法中一次平均化中数据的点数、移动平均值的次数等，可根据在光强度数据获取时的光检测区域的位置的移动速度(扫描速度)和/或BIN TIME而适当地设定。接下来，在平滑化处理后的时间序列光信号数据中，为了检测其中存在显著脉冲状信号(下文中称为“脉冲信号”)的时间域，计算平滑化处理后时间序列光信号数据随时间的第一微分值(步骤120)。如图5(C)所示的，在时间序列光信号数据的时间微分值中，中下段的“时间微分”，在信号值改变时所述值的变化增加，从而可通过参考时间微分值而有利地确定显著信号的起始点和终止点。其后，在时间序列光强度数据上顺次检测显著脉冲信号，并判断所检测的脉冲信号是否为对应于发光颗粒的信号。具体地，首先在时间序列光强度数据的时间序列时间微分值数据上，通过顺次参照时间微分值来搜索并确定一个脉冲信号的起始点和终止点，从而确定脉冲存在的区域(步骤130)。当已确定一个脉冲存在的区域时，将钟形函数的拟合应用到在脉冲存在的区域中的平滑化的时间序列光信号数据(图5 (C)，较下段的“钟形函数拟合”)，然后，计算钟形函数中的脉冲参数，例如峰强度(最大值)，Imax;脉冲宽度(半高全宽)，w ;(最小二乘法的)拟合时的相关系数等(步骤140)。就这一点而言，尽管要用于拟合的钟形函数典型地为高斯函数，但其也可为洛伦兹型函数。并判断所计算的钟形函数的参数是否在通过一个发光颗粒穿过光检测区域时所检测的脉冲信号所描绘的钟形谱的假定参数的相应范围内，即，是否脉冲的各峰强度、脉冲宽度和相关系数在对应的预设范围内(步骤150)。然后，如图6(A)左所示，将所计算的钟形函数的参数判定为在对应于一个发光颗粒的光信号的假设范围内的信号判定为对应于一个发光颗粒的信号，从而，检测一个发光颗粒。另一方面，如图6(A)右所示，将所计算的钟形函数的参数不在假设范围内的脉冲信号作为噪音忽略。在时间序列光信号数据的整个区域内重复进行在上述步骤130-150的处理中的脉冲信号的搜索和判断(步骤160)。特别在该实施方案中，上述步骤110-160可在波长带域相互不同的各时间序列光强度数据中进行，对应于发光颗粒的脉冲信号可在各波长带域中检测。就这一点而言，尽管未举例说明，但所检测的脉冲信号的数量可在时间序列光强度数据的整个区域内搜索脉冲信号期间计数。并且，由时间序列光强度数据单独检测发光颗粒的信号的处理可通过除上述方式以外的任意方式来进行。(ii)同步发生信号的检测当如上所述完成了在两个以上波长带域的时间序列光强度数据(即，各发光部位的时间序列光强度数据)中的对应于发光颗粒的信号(脉冲信号)的检测时，在所检测的信号中检测在两个以上波长带域的时间序列光强度数据上同步发生的信号(步骤170)。具体地，例如，如图6(B)所示，该检测可以以如下方式进行:当一个波长带域(波长I)的时间序列光强度数据中对应于发光颗粒的脉冲信号的峰值(最大值)的时间tpl与另一个波长带域(波长II)的时间序列光强度数据中对应于发光颗粒的脉冲信号的峰值(最大值)的时间tp2之差Λ T小于预设值时，判定在波长I和波长II中已产生了同步发生脉冲信号。并且，通过在时间序列光强度信号上顺次重复该判定，来检测两个以上波长带域的时间序列光强度数据中的所有同步发生的脉冲信号(同步发生脉冲信号)。另外，在检测同步发生脉冲信号的可选方式中，当在时间序列光强度数据之一上的信号的发生期间(起始点-终止点)与在另一时间序列光强度数据上的信号的发生期间(起始点-终止点)重叠时，可判定已产生了同步发生脉冲信号。就这一点而言，在本发明的方法中，基本上发光颗粒(待观察对象物)承载有发射波长相互不同的至少两种发光部位，因此，理论上所有脉冲信号应成为同步发生脉冲。然而，在实际实验体系中，由于色差等造成难以使波长相互不同的激发光的CV在空间上完全一致，可在光检测区域中产生其中示出了仅一个波长的激发光的区域，在该情况下，仅在一个波长带域的时间序列光强度数据上发生脉冲信号。因此，如上所述进行同步发生脉冲的单独检测。(iii)同步发生脉冲中强度比的计算当如上所述检测同步发生脉冲时，计算各同步发生脉冲在波长带域之一中的脉冲信号强度与另一波长带域中脉冲信号强度的比(第一发光部位的发射波长的脉冲信号强度与第二发光部位的脉冲信号强度的比，或者共有发光部位的发射波长的脉冲信号强度与固有发光部位的脉冲信号强度的比)。该比例可为，例如在各脉冲信号的峰处的强度比或各脉冲信号强度的累计值的比。例如，在利用共有发光部位的发射波长带域的信号的峰强度Imaxl和固有发光部位的发射波长带域的信号的峰强度Imax2限定发光颗粒(待观察对象物)中的共有发光部位和固有发光部位的情况下，可通过下式给出强度比:Imax2/Imaxl—(5)。(iv)分析和浓度的计算等(步骤180)如前面所述，由于上述信号强度(光强度)比被认为是发光颗粒的特有值，而不管发光颗粒在光检测区域中的穿过途径如何，发光颗粒以该信号强度比为特征，因此将进行其鉴定，即发光颗粒为假定的发光颗粒的证实，或其种类的区分。并且，利用信号强度比或所鉴定的结果，可将各信号分类，或可通过分类的信号来计数信号的数量。例如，在试验两种颗粒的结合反应的实验中，在给予第一颗粒共有发光部位和固有发光部位而给予第二颗粒固有发光部位的情况下，如果两种颗粒结合在一起，则在同步发生脉冲信号中对应于两种颗粒的结合体的信号强度比变为对应于第一颗粒的信号强度比的两倍，因此通过比较强度比，变得可区分对应于结合体的信号和对应于第一颗粒的信号，从而可证实在两种颗粒之间是否已发生了结合反应。并且通过将对应于结合体的信号数量与对应于第一颗粒的信号数量进行比较，还可评价结合反应的强度。此外，作为任选方式，在可具有各种尺寸的分子等如核酸、聚合蛋白或凝集蛋白等中，当制备分子以使固有发光部位的数量将根据分子尺寸增加时，在同步发生脉冲信号中信号的强度比随分子尺寸变化，因此，参考信号的强度比，变得可估计分子尺寸和/或评价聚合或凝集的程度或强度。顺便提及，在时间序列光强度数据的发光颗粒的数密度或浓度可使用对应于相应发光颗粒的信号的计数值(信号数)以及在时间序列光强度数据的获取期间光检测区域所穿过的整个区域的体积来确定。然而，光检测区域的有效体积依赖于激发光或检测光的波长、透镜的数值孔径和光学系统的调整条件而变化，因此，通常难以由设计参数值来计算光检测区域的有效体积，并且也不容易计算光检测区域已穿过的整个体积。另外，如前面所述，当两个以上的波长带域的激发光同时照射时，由于色差等造成难以使各激发光的共焦区相互完全一致，更加难以计算产生同步发生脉冲的各激发光焦点区域的重叠区域的有效体积。因此，典型地，用具有已知的发光颗粒浓度的溶液(参考溶液)在与要试验试样溶液的测量相同条件下如上所述进行光强度测量、颗粒的检测及其计数，然后，可由所检测的发光颗粒数和参考溶液中发光颗粒浓度来确定光检测区域已穿过的整个区域的体积，即发光颗粒的检测数和浓度之间的关系。优选地，参考溶液的发光颗粒可为具有与对应发光颗粒的相同的波长特性的发光标签(荧光染料等)。具体地，例如，假设在颗粒浓度(数密度)为C的参考溶液中发光颗粒的检测数为N，则由下式给出光检测区域已穿过的整个区域的体积Vt:Vt=N/C(6)
任选地，将多种不同浓度的溶液制备为参考溶液，对各溶液进行测量，然后，将所计算的Vt的平均值确定为光检测区域已穿过的整个区域的体积Vt。因此，当给出Vt时，由下式给出颗粒的计数结果为η的试样溶液的发光颗粒的浓度(数密度)C:c=n/Vt---(7)就这一点而言，可通过任意方法例如使用FCS和FIDA代替上述方法来给出光检测区域的体积和光检测区域已穿过的整个区域的体积。另外，在该实施方案的光学分析装置中，对于光检测区域的假设的移动模式，可预先在计算机18的存储设备中存储关于各种标准颗粒的浓度C和颗粒数N之间的关系(表达式￠))的信息，从而在进行光学分析时装置使用者可适当地使用关于该关系的存储信息。特别地，在本发明中，由于观察到对应于同步发生脉冲信号的发光颗粒，可将在所有观察的波长带域中具有发射波长的发光颗粒的已知浓度的溶液制备为参考溶液，在通过用该溶液测量光强度所获得的时间序列光强度数据上进行同步发生信号的检测和计数，然后，可由计数值和浓度来确定光检测区域穿过的区域的总体积Vt。因此，根据上述本发明的方法，通过参考借助扫描分子计数法中两个以上的波长带域的光测量所获取的信号强度比，变得可实现发光颗粒的鉴定，并且基于信号强度比的变化，将获取试样溶液中颗粒的相互作用、尺寸变化的信息等。在这一点上，应理解的是，根据上述方法，即使用与FCS、FIDA等类似的少量试样溶液，也可获取关于比FCS、FIDA等可良好测定的水平(典型地约InM)低的浓度(几PM水平)的发光颗粒的多样化信息。为了证实上述本发明的有效性，进行如下所述的实验。就这一点而言，应理解的是，以下实施方案仅说明本发明的有效性，而不意于限制本发明的范围。实施方案I标记有两种不同颜色的荧光 染料的寡核苷酸的检测实验根据本发明的方法，证实可区发单链寡核苷酸和双链寡核苷酸。对于试样，制备有如图7(A)左图不意性所不的具有序列编号I的喊基序列的31个碱基的单链寡核苷酸(1T-A)，其中5’端被荧光染料Alexa647修饰，3’端被荧光染料TAMRA修饰；以及如图7 (A)右图示意性所示的双链寡核苷酸(2T-A)(通过将IT-A与5’端由TAMRA修饰并具有与IT-A序列互补的序列编号2的碱基序列的寡核苷酸(1_A)结合所形成的寡核苷酸)。通过在包含IOmM Tris-HCl (pH8.0)、5mM EDTA和IOOnM NaCl的缓冲液中分别混合IT-A和IA以成为I μ M ;将混合液置于94°C下5分钟以便将引起热变性；并随后将温度降至室温以进行退火处理，从而来制备2T-A。然后，作为试样溶液，在上述缓冲液中单独制备有分别以约2nM包含IT-A和2T-A的溶液。在这一点上，当Alexa647被633nm的激发光激发时，发出约650-705nm的荧光。另一方面，当TAMRA被543nm的激发光激发时，发出约550-620nm的荧光。(在该实施方案中，Alexa647将成为共有发光部位，TAMRA将成为固有发光部位。)在光的测量和分析中，将装备有共焦荧光显微镜的光学系统和光子计数系统的单分子荧光测量设备MF-20 (Olympus Corporation)用作光学分析装置，并根据上述“(2)试样溶液的光强度的测量”中所述的方式来获取上述各试样溶液的时间序列光子计数数据(光子计数数据)。在此时，将543nm激光和633nm激光用于激发光，分别对于543nm和633nm的激发光，使用带通滤波器同时并单独测量两个波长带域565-590nm和660-7IOnm的光，并产生543nm激发光和633nm激发光各自的时间序列光强度数据。将在试样溶液中的光检测区域的位置的移动速度设为15mm/秒；ΒΙΝ ΜΕ设为10 μ sec.;对于各试样溶液，分别进行2秒测量。在光强度测量后，根据上述“(3) (i)对应于发光颗粒的信号的检测”中所述的步骤，将平滑化处理应用到由各试样溶液获取的各波长带域的时间序列光强度数据，在确定了平滑化数据中脉冲信号的起始点和终止点后，通过最小二乘法进行高斯函数对各脉冲信号的拟合，确定(在高斯函数中)的峰强度、脉冲宽度(半高全宽)和相关系数。然后，仅将满足以下条件的脉冲信号判定为对应于发光颗粒(1T-A，2T-A)的信号:20 μ sec.< 脉冲宽度〈400 μ sec.
峰强度>1(光子/10 μ sec.)— (A)相关系数>0.95而不满足上述条件的脉冲信号作为噪音忽略。接下来，通过比较543nm激发光数据与633nm激发光数据上判定为发光颗粒的脉冲信号，当脉冲信号之间的峰值(最大值)的时间差在30μ秒以内时，判定这些脉冲信号并提取为同步发生的脉冲信号(同步发生脉冲信号)，对于各信号，计算543nm激发光数据上的峰强度Imax2与633nm激发光数据上的峰强度Imaxl的比(Imax2/Imaxl)。图7(B)示出关于在上述处理中获得的同步发生脉冲，相对于峰强度比的同步发生脉冲的发生数。如图中所理解的，IT-A的分布(白色条带)与2T-A的分布(黑色条带)分别形成钟形，IT-A的峰强度比Imax2/Imaxl的平均值为0.73 (SD=0.22)，而2T-A的峰强度比Imax2/Imaxl的平均值为1.52 (SD=0.50)。即，2T-A的峰强度比约为IT-A的峰强度比的两倍，并且一般根据发光颗粒上TAMRA(固有发光部位)的数量来量化峰强度比的分布。在该结果中，峰强度比为约0.8以下的信号可鉴定为与IT-A相对应，峰强度比为约1.5以上的信号可鉴定为与2T-A相对应。此外，上述结果还示出IT-A和1-A彼此结合形成2T-A。因此，根据本实施方案，显示出可根据本发明的方法，通过根据发光颗粒种类而适当选择固有发光部位的数量并参照在各同步发生脉冲信号中的固有发光部位的光强度与共有发光部位的光强度的比，来进行发光颗粒的鉴定，特别是发光颗粒种类的区分。实施方案2标记有两种不同颜色的荧光染料的核酸分子尺寸的检测实验证实通过本发明的方法可区分具有各种链长度的核酸分子。对于试样，制备有5’端被荧光染料ATT0647N修饰的各DNA，其分别具有序列编号3的碱基序列，链长为IOObp ;序列编号4的碱基序列，链长为200bp ;序列编号5的碱基序列，链长为400bp ;序列编号6的碱基序列，链长为SOObp ;和序列编号7的碱基序列，链长为
1.5kbp (下文中分别称为 AlOObp, A200bp、A400bp、A800bp 和 Al.5kbp)。在这些 DNA 的制备中，首先，使用质粒PUC19作为模板；具有序列编号8的碱基序列并在5’端被ATT0647N修饰的寡核苷酸作为通用引物；各自具有序列编号9-13的未标记的寡核苷酸作为分别对应链长度为 AlOObp、A200bp、A400bp、A800bp 和 Al.5kbp 的 DNA 的引物；以及 AmpliTaqGold(注册商标)，通过PCR生产上述各DNA。随后，使用Wizard SV Gel和PCR Clean-UpSystem(Promega)将未反应的引物从PCR产物中除去，并使用生物分析仪(Agilent)根据电泳检测上述链长度的DNA 是否存在和浓度。对于试样溶液，在各链长度的DNA在缓冲液(IOnM Tris-HCl (ρΗ8.0)，5mM EDTA, IOOmM NaCl)中溶解为 IOnM 后，通过在 IOnM 荧光染料SYTOX Orange(Invitrogen)的存在下稀释 DNA 以使 DNA 浓度为 lpM、10pM、IOOpM 和 InM，并将它们放置在室温下静置30分钟以上来制备溶液。在这一点上，当ATT0647N被633nm激发光激发时，发出约665-700nm的荧光，当SYTOX Orange (下文中，SYTOX 0.)被543nm激发光激发时，发出约550-630nm的荧光。特别地，SYTOX 0.为当进入DNA碱基对时其荧光强度增加约500倍的嵌入剂式荧光染料。因此，如图8 (A)所示，当DNA的链长度变长时，每一 DNA分子的SYTOX 0.结合数将增加，因此期望(每单位激发光量的)每分子的发光量增力口。(在该实施方案中，ATT0647N将为共有发光部位，SYTOX 0.将为固有发光部位。)与实施方案I类似地对上述各试样溶液进行光的测量和分析，其中检测同步发生脉冲，对于所检测的同步发生脉冲，计算SYTOX 0.的信号(543nm激发光的数据上的信号)的峰强度Imax2与ATT0647N的信号(633nm激发光的数据上的信号)的峰强度Imaxl的比(Imax2/Imaxl)。下表I示出在上述处理中获得的以各浓度包含各链长度的DNA的相应试样溶液中同步发生的脉冲数。[表 I]在以各种浓度包含具有不同链长度的DNA的试样溶液中所检测的同步发生脉冲数
权利要求
1.一种使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统来检测和分析来自在试样溶液中分散并随机运动的发光颗粒的光的方法，其特征在于包括以下步骤: 制备包含发光颗粒的试样溶液，所述发光颗粒具有第一发光部位和第二发光部位，所述第二发光部位具有与所述第一发光部位的发射波长不同的发射波长； 通过改变所述光学系统的光路而在所述试样溶液中移动所述光学系统的光检测区域的位置； 在所述试样溶液中移动所述光检测区域的位置的情况下，单独并同时测量来自所述光检测区域的所述第一发光部位的光强度和所述第二发光部位的光强度，从而单独产生光强度数据； 在所述光强度数据中单独检测表示单个发光颗粒的光的信号； 利用对于所述第一发光部位的光强度数据和所述第二发光部位的光强度数据的同步发生的各信号中所述第一发光部位的光强度与所述第二发光部位的光强度的比来鉴定单个发光颗粒。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述第一发光部位为在所述试样溶液中至少部分发光颗粒所共同具有的共有发光部位，和所述第二发光部位为表征各所述发光颗粒的固有发光部位。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于利用所述第一发光部位的光强度与所述第二发光部位的光强度的比来鉴定所述单个发光颗粒的种类。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述单个发光颗粒的尺寸由所述第一发光部位的光强度与所述第二发光部位的光强度的比来确定。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述第二发光部位的种类因发光颗粒的种类而异。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述第二发光部位的数量因发光颗粒的种类而异。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述单个发光颗粒具有的所述第二发光部位的数量随着所述发光颗粒的尺寸增加而增加。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于进一步包括计数所鉴定的单个发光颗粒的数量的步骤。
9.根据权利要求1至8任一项所述的方法，其特征在于以比所述试样溶液中的所述发光颗粒的扩散运动速度快的速度移动所述光检测区域的位置。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于进一步包括基于所鉴定的单个发光颗粒的数量来确定所述发光颗粒的数密度或浓度的步骤。
全文摘要
提供一种通过使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学测量的扫描分子计数法，所述方法能够通过使用单独测量的发光颗粒的光强度来表征单个发光颗粒或鉴定所述发光颗粒。该光学分析技术如下在包含至少具有发射波长相互不同的两种发光部位的发光颗粒的试样溶液中，测量从各发光部位同时发出的光学信号，同时通过改变所述光学系统的光路来移动光学系统的光检测区域的位置，从而参考信号强度之间的比，进而鉴定对应于所述信号的单个发光颗粒来区分所述发光颗粒的种类和尺寸等。
文档编号G01N15/00GK103097878SQ20118004316
公开日2013年5月8日 申请日期2011年8月31日 优先权日2010年9月10日
发明者西川和孝, 田边哲也, 山口光城 申请人:奥林巴斯株式会社