专利名称：Sirt5调节剂及其筛选方法
Sirt5调节剂及其筛选方法交叉引用美国相关专利申请本发明要求美国临时专利申请的优先权(申请号:N0.61/362，078，申请日:2010年7月7日)，在此将其作为参考文献整体引用并到本发明中。关于美国联邦资助研究的说明本发明得到美国政府的资助，获得NIH基金，合同号为GM086703。因此政府拥有本发明的某些权利。
背景技术：
沉默信息调控蛋白2 (Sir2)或者叫去乙酰化酶(Sirtuins)，是一个具有辅酶(nicotinamide adenine dinucleotide, NAD)依赖蛋白去乙酰活性的进化保守的酶家方矣(A.A.Sauve, et al., Annu.Rev.Biochem.75:435 (2006) ；S.-1.1mai, et al., Trendsin Pharmacological Sciences 31:212(2010) ；M.C.Haigis, et al., Annual Reviewof Pathology:Mechanisms of Disease 5:253 (2010)).自从最初发现 sirtuin 的去乙酸活性(S._1.1mai, et al., Nature 403:795 (2000) ；K.G.Tanner, et al., Proc Natl.Acad.Sc1.U.S.A.97:14178 (2000))，揭示了 sirtuins的很多重要的生物功能，并且也很好的理解了 NAD 依赖的去乙酸机制(S.- 1.1mai, et al., Trends in PharmacologicalSciences 31:212 (2010) ；M.C.Haigis, et al., Annual Review of Pathology:Meehanismsof Disease 5:253(2010))。基于序列的相似性，sirtuins被分为不同的类型(R.A.Frye, Biochem, Biophys.Res.Commun.273:793 (2000))。哺乳动物有 7 种 sirtuins,Sirtsl-7。Sirtsl-3属于第一类,Sirt4属于第二类，Sirt5属于第三类，Sirt6和Sirt7属于第四类(R.A.Frye, Biochem.Biophys.Res.Commun.273:793 (2000))。研究sirtuin活性的一个主要障碍在于7种人类sirtuins中的4种(Sirt4_7)要么有非常弱的去乙酰活性，要么没有去乙酰活性(E.Michishita, et al.，Mol.Biol.Cell16:4623 (2005) ；M.C.Haigis et al., Cell 126:941 (2006) ;Α.Schuetz et al., Structure15: 377 (2007) ；G.Liszt, et al., J.Biol.Chem.280:21323(200 5) ；E.Michishita etal., Nature 452:492(2008))。这对研究Sirtuins和开发调节他们活性的小分子带来了许多困难。比如，由于没有强活性检测方法，所以难以开发以Sirts4-7为靶点的抑制剂或激活剂。也难以确认以Sirtl、Sirt2和Sirt3为靶点的抑制剂或激活剂是否也同样作用于Sirts4_70发明概沭Sirt5，一种线粒体去乙酰化酶，被发现是一种有效的脱丙二酰和脱琥珀酰酶。这个发现证明了哺乳动物线粒体蛋白新的翻译后进行修饰的过程，即赖氨酸残基的丙二酰化和琥珀酰化。Sirt5去除线粒体蛋白赖氨酸残基上的戊二酰，丙二酰和琥珀酰基团，这个过程被认为可以可逆的调节线粒体蛋白的活性。由于发现了这个强酶活性，使得能够开发识别Sirt5调节剂的方法。Sirt5特异性的调节剂可被用于研究Sirt5的生物功能和革巴向Sirt5活性用于治疗人类疾病。附图简沭
图1:使用AMC-琥珀酰肽来测试Sirt5的荧光实验。图2A-2D:Sirt5的结构揭示了一个不寻常的酰基袋。(A)Sirt5的酰基袋被CHES的缓冲分子与Argl05和Tyrl02相互作用产生的硫酸盐部分占据。所述硫酸酯距离硫代乙酰基团4.2A, (B)Sirt5-硫代乙酰肽结构和Sir2Tm-乙酰肽结构的对比。(C)理论预测丙二酰/琥珀酰肽可能是Sirt5更好的底物。(D) Sirt5-琥珀酰肽-NAD三重结构表明琥珀酰基团和Tyrl02和Argl05的相互作用。图3A-3F:Sirt5催化的丙二酰和琥珀酰赖氨酸的水解。纯化的去乙酰化酶(Sirtl
0.75μΜ或Sirt53.3μΜ)和0.3mM的酰基肽一起孵育，1.0mM NAD加到含有ImM DTT的60 μ L的20mM Tris-HCl缓冲液中(ρΗ7.5)，在37°C反应2小时。反应用60 μ L10%TFA终止。去除沉淀的蛋白后，使用LCMS分析反应混合物。灰色曲线表明酰基肽的质量(乙酰肽，m/zl274.0 ;丙二酰肽，m/zl318.0 ;琥珀酰肽，m/zl332.0)和脱乙酰肽的质量(m/zl232.0)的离子峰强度(IOx放大)。黑色曲线表明所有从100-2000的质量(总离子数或者TIC)的离子峰强度。对于Sirtl，当H3K9乙酰肽(A)作为底物时可检测出脱乙酰产物，当使用H3K9丙二酰(B)和琥珀酰(C)肽时没有水解产物被检出。对于Sirt5，脱乙酰产物很少被检出(D)，而脱丙二酰(E)和脱琥珀酰(F)产物可以被检出。图4A-4B:㈧琥珀酰赖氨酸残基存在于牛肝脏线粒体中。使用32P-NAD可以检出Sirt5催化的丙二酰和琥珀酰肽的水解，形成32P标记的O-Ma-ADPR(条带2)和O-Su-ADPR(条带3)。用乙酰肽则没有反应发生(条带I)。当组蛋白被用作乙酰赖氨酸(条带8)或H3K9乙酰肽(条带4)的来源时，Sirtl催化的O-Ac-ADPR的形成可以被检测出来。当用32P-NAD和Sirt5孵育被胰蛋白酶消化的牛肝脏线粒体肽时形成O-Su-ADPR(条带9)，但用Sirtl则不能形成(条带10)，这表明琥珀酰赖氨酸残基存在于牛肝脏线粒体肽提取物中。作为对照组的用BSA肽和Sirt5的反应不会产生0-Su-ADPR(条带12)。⑶38能水解NAD产生ADPR，它被用来产生在第13条带上的标准32P-ADPR点。(B) Sirt5的缺失可以增加老鼠肝脏部位的C PSl琥珀酰水平。在野生型或Sirt5敲除的肝脏中免疫沉淀出CPS1，用32P-NAD检测出琥珀酰化水平。合成的乙酰，丙二酰和琥珀酰肽可被用来分别产生对照点 0-Ac-ADPR，O-Ma-ADPR 和 O-Su-ADPR。图5A-5C =Sirtl和Sirt5催化的H3K9肽(A)脱乙酰化，⑶脱丙二酰化和(C)脱琥珀酰化通过HPLC被检测(检测波长为215nm)。一个更长的HPLC柱被用于更好地分离酰基肽和脱酰基肽。结果进一步表明Sirtl有更好的脱乙酰活性，而Sirt5有更好的脱丙二酰和脱琥珀酰活性。图6A-6B: (A)表示Sirtuin催化的NAD依赖的脱酰基化反应，这个反应产生O-酰基-ADP-核糖。(B) sirtuin催化的NAD依赖的脱乙酰基化的机理。图7A-7D:0-丙二酰-ADPR的⑷和O-琥珀酰-ADPR⑶的HPLC纯化及MS确认(C和D)。在A和B中的黑色曲线是Sirt5催化的H3K9酰基肽脱丙二酰化和脱琥珀酰化的HPLC曲线(检测波长为260nm)。用Sirtl孵育的肽没有产生相同的产物(灰色曲线)。O-丙二酰-ADPR(C)和O-琥珀酰-ADPR(D)进一步通过MALD1-MS分析。O-丙二酰-ADPR和O-琥珀酰-ADPR的形成表明Sirt5催化的反应机制和第一类的脱乙酰化酶的脱乙酰化机制相同。图8:Sirt5催化的脱丙二酰和脱琥珀酰反应。
图9:受保护的硫代琥珀酰赖氨酸化合物的合成，被用于制备H3K9TSU肽。图10:AMC_琥珀酰肽的合成。图 11:1SGASE (SuK) -AMC 是 Sirt5 的底物。ISGASE (SuK) -AMC 肽在有或没有 Sirt5下孵育4小时，然后加Iyg胰蛋白酶孵育3小时。与没有Sirt5的阴性对照相比，1，2，和5μΜ的Sirt5使荧光分别增加11，20，和26倍。图 12:SGASE (SuK) -AMC 不是 Sirtl, 2,和 3 的底物。ISGASE (SuK) -AMC 肽用 I μ M不同的去乙酰化酶孵育4小时，然后用I μ g胰蛋白酶孵育3小时。与没有去乙酰化酶的阴性对照相比，只有使用Sirt5的荧光才增强。 图13:使用荧光底物ISGASE(SuK)-AMC筛选Sirt5抑制剂。没有Sirt5和有Sirt5，但是不加小分子的反应做对照组。所有小分子的浓度为30 μ M。H3K9TSU和suramin表现出显著的Sirt5抑制活性。图14:1SGASE (AcK)-AMC 是 Sirt2 底物。ISGASE (AcK)-AMC 肽用 ΙμΜ 不同的去乙酰化酶孵育10小时，然后加入I μ g胰蛋白酶孵育3小时。与没有去乙酰化酶的阴性对照相比，Sirt2增强荧光最多，但Sirt5和Sirt3没有显著增强荧光。图15:使用 ISGASE (AcK)-AMC和 Sirt2 筛选发现H3K9TSU而不是苏拉明(suramin)是Sirt5特异性的抑制剂。
发明内容
去乙酰化酶(Sirtuins)是一类进化保守的酶,与很多生物功能有关。Sirtsl-3被认为有强的脱乙酰活性，但是在本发明公开之前，Sirts4-7没有被发现有强的酶活性。比如，Sirt5的脱乙酰活性弱，其脱乙酰的效力比Sirtl低500倍。本发明第一次发现Sirt5对丙二酰和琥珀酰肽比对乙酰肽具有更显著的水解活性。进一步说，本发明表明在哺乳动物细胞中存在蛋白赖氨酸琥珀酰化和丙二酰化。另外，在Sirt5敲除的小鼠组织中，观察到CPSl (—个已知的Sirt5靶蛋白)的赖氨酸琥珀酰化水平增高。因此，可以认为Sirt5在体内的主要活性是脱琥珀酰和脱丙二酰，而不是脱乙酰。本发明的研究者发现了 Sirt5的强酶活性，使开发鉴别Sirt5特异性调节剂的方法成为可能。Sirt5特异性调节剂可被用于研究Sirt5的生物功能,可以祀向Sirt5活性用于治疗人类疾病。Sirt5 活性本发明中使用的“Sirt5活性”包括酶去除赖氨酸残基上的酰基(丙二酰，琥珀酰，戊二酰和乙酰)。所以，Sirt5活性包括赖氨酸残基的脱丙二酰，脱琥珀酰，脱戊二酰和脱乙酰。在本发明的一些实施例中，公开了 Sirt5独特的脱琥珀酰和脱丙二酰活性。“Sirt5脱琥珀酰活性”是指Sirt5酶去除赖氨酸残基上的琥珀酰基。“Sirt5脱丙二酰活性”是指Sirt5酶去除赖氨酸残基上的丙二酰基。Sirt5能作用于孤立的带有酰基的赖氨酸残基，或者是作用于在肽或蛋白中的酰基化的赖氨酸残基。Sirt5活性，比如，脱琥珀酰和脱丙二酰活性可以发生在体内作为对含有琥珀酰或丙二酰赖氨酸的蛋白翻译后进行修饰，使得下游生理反应的产生。“Sirt5调节剂”或“Sirt5调控剂”或“Sirt5调控化合物”是可以激活或抑制Sirt5活性的底物。“Sirt5抑制剂”是可以降低或阻止Sirt5活性的底物。“Sirt5激活剂”是可以提高或促进Sirt5活性的底物。检测Sirt5活性的方法一方面，本发明公开了一种在样本中检测Sirt5脱丙二酰，脱琥珀酰或脱戊二酰活性水平的实验。
上述实验基于含有丙二酰，琥珀酰，或戊二酰赖氨酸的底物。所述赖氨酸连接指示剂部分，所述赖氨酸和指示剂部分间的连接可以被裂解剂裂解，所述裂解剂对赖氨酸残基的丙二酰化，琥珀酰化或戊二酰化状态敏感。因此，当所述底物在能被Sirt脱丙二酰化，脱琥珀酰化或脱戊二酰化的环境下与Sirt5接触时，酰基的去除(可能导致裂解部位的暴露)允许裂解剂作用于裂解部位，然后释放指示剂部分，产生可检测的信号。用于在实验中检测Sirt5活性的合适底物可以是任何含有琥珀酰，丙二酰或戊二酰赖氨酸残基的分子，包括孤立的赖氨酸残基或者是含有赖氨酸的肽。在具体的实施例中，用于实验的底物是含有琥珀酰或丙二酰赖氨酸残基的肽，并连接有指示剂部分。本发明所使用的术语“肽”包括通过肽键相连的2个或者更多氨基酸。对肽的链长没有特别限制。所述肽链短到可以是4到5个氨基酸，也可以长到50个氨基酸或者更长。在一些实施例中，被用于方法的肽的长度是15到25个氨基酸。除了肽一般在C端包括琥珀酰，丙二酰或戊二酰赖氨酸外，对肽的氨基酸序列也没有特别的限制。优选的，所述肽底物在丙二酰或琥珀酰赖氨酸残基之前没有赖氨酸或者精氨酸残基，这样一旦去除琥珀酰或丙二酰基，在琥珀酰或丙二酰赖氨酸和指示剂部分间的连接(比如酰氨键)可以被裂解剂有效地作用。在一个具体实施例中，所述肽链具有序列异亮氨酸-丝氨酸-甘氨酸-丙氨酸-丝氨酸-谷氨酸-赖氨酸(ISGASEK，SEQ ID NO:1)，其中所述的赖氨酸是酰化的(琥珀酰化，丙二酰化或戊二酰化)。不管是孤立的还是作为肽的一部分，所述丙二酰，琥珀酰或戊二酰赖氨酸和指示剂部分连接。所述连接是共价连接，在赖氨酸的酰基被去除后可以被裂解剂裂解。比如，所述共价连接是一个酰胺键，形成于丙二酰，琥珀酰或戊二酰赖氨酸羧基和指示剂化合物的氨基之间，在赖氨酸的酰基被去除后(比如，导致所述肽键向蛋白水解酶暴露)易被蛋白水解酶裂解。所述裂解剂可以是任何能可预见性地裂解在特定氨基酸残基之间肽的试剂(t匕如蛋白水解的裂解方式)，但是在赖氨酸被琥珀酰化，丙二酰化或者戊二酰化时不能裂解肽键。如一个实施例所述，裂解剂是蛋白水解酶，比如可以水解肽键的酶(也指肽酶)。所述的蛋白水解酶包括但不限于胰蛋白酶，钙蛋白酶，赖氨酰肽链内切酶，赖氨酸-C蛋白内切酶，金属肽链内切酶，血纤维蛋白溶酶，羧肽酶，胰凝乳蛋白酶，V8蛋白酶，胃蛋白酶，木瓜蛋白酶，枯草杆菌蛋白酶，凝血酶，弹性蛋白酶，gluc-C, endo Iys-C或者蛋白酶K,半胱天冬酶-1，半胱天冬酶_2，半胱天冬酶-3，半胱天冬酶-4，半胱天冬酶-5，半胱天冬酶-6，半胱天冬酶_7，半胱天冬酶_8，MetAP-2,腺病毒蛋白酶，HIV蛋白酶等。 在一个具体的实施例中，所述裂解剂是胰蛋白酶。胰蛋白酶水解肽键，所述肽键的羧基来自赖氨酸和精氨酸残基；因此，胰蛋白酶可以裂解Sirt5底物的赖氨酸残基的羧基末端的肽。另外一种合适的裂解剂是胃蛋白酶，它能水解在丙基苯氨酸，色氨酸和酪氨酸残基的氨基末端的肽键。因此，所述胃蛋白酶可以裂解赖氨酸残基和邻近的丙基苯氨酸，色氨酸或酪氨酸残基之间的底物肽。在这些实验中，Sirt5酶活性是通过蛋白水解消化，用裂解剂从肽上裂解指示剂部分，产生一个可检测的信号。“指示剂部分”是能检测到Sirt5活性的分子或Sirt5底物的组分。指示剂部分或许可以是，比如，荧光或其他标记分子，比如 -氨基-4-甲基香豆素(AMC)，FLAG，或聚组氨酸抗体标签。在具体实施例中，所述指示剂部分具有荧光性质。在一个实施例中，所述指示剂部分是单独的荧光小分子或荧光团。所述“荧光团”是指能引起分子发出荧光的分子组分。它是分子中的功能性基团，能吸收特定波长的能量，并再以特定波长发射能量。通常的荧光团是异硫氰酸酯的荧光素(FITC)，罗丹明的衍生物(TRITC)，香豆素，芘，青色素，马来酰亚胺的衍生物染料，CF染料，荧光探针染料，DyLightFluors, Oyester 染料，Atto 染料，HiLyte Fluors,萤光素和 Alexa Fluors0 突光素酶，比如萤火虫荧光素，当用萤火虫荧光素酶和ATP孵育时可以发光。所发射的光可被用于检测Sirt5活性。在本发明的一些实施例中，所使用的荧光团产生的荧光强度或者发射波长会随着荧光团和肽之间连接的存在或消失而变化，而且所述荧光强度或发射波长的改变可以被荧光分光光度计检测出来。在一个实施例中，所述指示剂部分是氨基甲基香豆素。在一个优选的实施例中，所述指示剂部分是7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)。因此，Sirt5脱琥珀酰活性的荧光底物的一个优选的例子是AMC-琥珀酰肽，比如，ISGASE (SuK) -AMC (其中SuK代表琥珀酰赖氨酸)，来自谷氨酸脱氢酶的肽序列。相似的，Sirt5脱丙二酰活性的荧光底物的一个例子是AMC-丙二酰肽，比如ISGASE (MaK) -AMC (其中MaK代表丙二酰赖氨酸)。
在另一个实施例中，所使用的荧光团产生的荧光强度或者发射波长不必须随着荧光团和肽之间连接的存在或 消失而变化，但是，底物肽也被淬火基团标记。比如，所述荧光团可以和酰化赖氨酸肽的羧基末端相连，而所述淬火基团可以和含有酰化赖氨酸的肽链中的不同氨基酸相连。由于底物中存在淬火基团，这些底物的荧光强度较弱。但是，当裂解剂把所述肽赖氨酸残基的C末端裂解时，所述荧光强度提高。这个可以检测裂解的底物肽的量。本发明中适宜的淬火基团包括DNP，Black Hole Quencher 部分，和DABCYL。另外一个实施例中，所述指示剂部分是荧光小分子或荧光团，且属于供体-受体对荧光团对中的一个。在这个实施例中，所述指示剂荧光团连接于酰化赖氨酸肽的羧基末端(在“FRET”实施例中所述肽典型地包括在酰化赖氨酸的C末端有一个或多个氨基酸)，供体-受体对荧光团对中的另一个分子位于附近，比如与所述肽底物的另一个氨基酸相连。因此，在赖氨酸和指示剂部分之间的连接被裂解之前，所述邻近的供体-受体荧光团从供体和受体间进行能量转移，所述能量转移可以被FRET检测。荧光共振能量转移(FRET)是一个非辐射性的途径，在电子激发状态的分子通过FRET可以释放能量返回到更稳定的基态。所述能量的转移发生于偶极-偶极相互作用的空间:如果两荧光团处于合适的距离，能量能从激发态分子(供体荧光团)转移到邻近的分子(受体荧光团)。在这个实施例中，Sirt5作用后，蛋白水解作用导致荧光团对中的一个分子对从底物上释放，使得荧光团分离，降低了 FRET信号强度，这与Sirt5活性具有相关性。为完成检测Sirt5活性实验，首先将含有Sirt5的样品与本发明所述合适的底物接触，并在合适的条件下孵育。所述“样品”是指任何含有纯化，部分纯化或没有纯化的目标Sirt5，而且可以是从细胞或组织中的溶解产物，或者Sirt5蛋白的产物(纯化自细胞或组织或者是重组的表达系统)。在Sirt5样品和底物的孵育阶段后，将裂解剂同合适的反应缓冲液加入反应中。在第二次孵育阶段以后，用水或其它中性PH缓冲液稀释，使用荧光检测器在对所用荧光团所适宜的激发和检测波长下记录荧光。所述的信号强度与Sirt5具有相关性。所述实验可以在微型板中进行。比如，将底物肽加到反应缓冲液中，随后将溶液加入到可用于检测荧光的微型板的孔中，将板孵育。随后，将一小份Sirt5样品加入每个孔中，在给定的时间内去酰化。然后，将一小份蛋白水解酶和合适的反应缓冲液加入到每个孔，使用荧光酶标仪定时检测所述溶液的荧光强度。在一些实施例中，为避免与预测的Sirt5酶活性相关的底物肽不足，在实验中使用过量的底物肽。优选的，为了在普通的生物样品中检测Sirt5活性，比如细胞核的提取物，在反应中底物的浓度通常是I到200 μ Μ,更优选的，20到50 μ M0另一方面，所述裂解剂的浓度可以主要根据所用底物肽的量进行调整。通常，所述裂解剂的量根据预测产生底物肽的数量而调整，使在给定的条件下实现所述底物肽的充分裂解。优选的，所述裂解剂活性要能够保证，比如即使所有使用的底物肽都脱乙酰化，都可以被裂解剂裂解时，在反应给定的实验条件下在反应孵育中肽被充分裂解。优选的，当底物肽以0.01到ImM浓度被用于反应时，所用的胰蛋白酶数量，比如，每60 μ I反应液中通常为0.2到5 μ g。更优选的，为每60 μ I反应液中I到2μ g。关于第一个反应(Sirt5引起的脱酰基化)，反应的pH可以考虑选择Sirt5适宜的pH值。例如，所述pH通常可以调整到6.0到8.5，优选的，pH6.8到8.5。反应缓冲液可以从能够提供上述给定的pH的缓冲液中进行选择。例如，Tris-HCl, Hepes-KOH,等可以被用于本发明的方法中。更优选的，例如，可以使用20mMTris-HCl，pH7.4。NAD是Sirt5需要的共同底物，通常使用的浓度为0.5mM。优选的，在反应液中加盐和防腐剂。例如，往反应中加ImM 二硫苏糖醇(DTT)。第一个反应(Sirt5引起的脱酰基化)在35_40°C之间孵育2_20小时。优选的孵育条件包括，例如，在37°C下，于含有NAD (0.5mM)和DTT (ImM)的Tris-HCl缓冲液(PH7.4，20mM)中孵 育含有Sirt5的样品和底物的液体混合物4小时。使用裂解剂进行第二个反应，所述裂解剂和合适的反应缓冲液加入反应中。例如，胰蛋白酶(Iug)和CaCl2(ImM)加入到反应中，在37°C下孵育大约3小时。胰蛋白酶孵育后，用水或其它中性的pH缓冲液稀释反应，使用荧光检测器在对所用荧光团所适宜的激发和检测波长下记录荧光。所述的信号强度与Sirt5活性具有相关性。筛选SIRT5调节剂的方法另一方面，本发明提供了一种筛选Sirt5脱丙二酰，脱琥珀酰或脱戊二酰活性的调节剂的方法。所述筛选方法主要基于前面描述的评价Sirt5活性的实验，除了在有候选化合物或者没有候选化合物的情况下进行实验。与没有候选化合物时的Sirt5脱丙二酰或脱琥珀酰活性相比，在存在候选化合物时，如果Sirt5脱丙二酰或脱琥珀酰活性减弱，此候选化合物被鉴定为Sirt5抑制剂。在存在候选化合物时，与没有候选化合物时的Sirt5脱丙二酰或脱琥珀酰活性相比，如果Sirt5脱丙二酰或脱琥珀酰活性增强，此候选化合物被鉴定为Sirt5激活剂。在所述筛选方法中被使用的测试化合物包括，例如，合成或重组的肽；低分子量的合成化合物(小分子)；来源于动物，植物或细菌的细胞提取物；细胞培养上清液。脱丙二酰化或脱琥珀酰化实验和脱乙酰化实验联合使用来提高特异性如上所述的筛选Sirt5调节剂的实验可以包括一个补充的第二步脱乙酰活性的实验，用来鉴别化合物可以调节Sirt5但不能调节Sirtsl-3或其它有脱乙酰活性的去乙酰化酶。在这个第二部分实验中，例如，使用AMC-乙酰肽来鉴定被确认为是Sirt5调节剂的化合物其调节Sirtsl/2/3的能力。在一个具体的实施例中，AMC-乙酰肽是ISGASE (AcK)-AMC肽，其中AcK是乙酰赖氨酸。通过使用底物ISGASE (AcK)-AMC和Sirtsl-3任意一个，对被确认为是Sirt5调节剂的化合物进一步进行测试。在第二部分实验中，化合物被发现可以调节Sirt5活性，也可以调节Sirtsl-3任意一个活性,则其不被认为是Sirt5特异性调节齐U。然而，一个化合物被发现可以调节Sirt5活性，但不能调节Sirtsl-3任意一个活性，其被认为是Sirt5特异性调节剂。因此，例如，使用AMC-琥珀酰肽的Sirt5实验，联合使用AMC-乙酰肽的Sirtl/2/3实验，能用来筛选选择性调节Sirt5活性的化合物。所有实验都可以微型化，自动化以便用于高通量分析。所述实验能在一个或多个分离的容器中进行；但是，本发明公开的实验的一个优点在于，能在一个容器中进行，比如，微型板孔，其使用容易而且可以自动操作。如果需要的话，所述底物可以选择性地固定化在固体介质上，比如通过生物素-链霉亲和素连接。本发明描述的合成底物的方法为现有技术。例如，在后续实施例中会描述在上述公开的荧光实验中所用底物的合成方法。其它的检测方法本发明提供了另一个检测方法是质谱检测。这个实验中，Sirt5的活性是通过和Sirt5接触后，测定底物肽的质量来鉴别的。比较起始物质(琥珀酰，丙二酰或戊二酰肽)和产物(比如脱琥珀酰，脱丙二酰或脱戊二酰肽)的数量，这与底物上的Sirt5活性的量相关。在这个实验中，产物的增加表明有Sirt5活性，产物很少或没有产物则表明Sirt5活性很小或没有活性。通过使用质谱实验，候选化合物可以如下被鉴定为Sirt5抑制剂或Sirt5激动剂。相对于没有候选化合物时产生的产物，当存在候选化合物时，产物减少(比如，脱琥珀酰化，脱丙二酰化，或脱戊二酰化肽)，则候选化合物被鉴别为Sirt5抑制剂。相对于没有候选化合物时产生的产物，当存在候选化合物时，产物增加(比如，脱琥珀酰化，脱丙二酰化，或脱戊二酰化肽)，则候选化合物被鉴别为Sirt5激动剂。存在和不存在有调节作用的化合物产生的活性的差异应该至少是 20%，30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%,500%或更多。IC50 和 EC50候选化合物抑制Sirt5活性的能力可以通过确定其IC5tl来表示。候选化合物激活Sirt5活性的能力可以通过确定其EC5tl来表示。本发明所使用的“IC50”或者“一半最大抑制浓度”是表示抑制一半的活性所需的化合物的量。可以通过构建剂量响应曲线，检测不同浓度的化合物在降低或阻止酶活作用来确定化合物的IC50。对于一个给定的抑制剂，IC5tl可以通过测定抑制一半最大酶活所需的浓度来计算。所述浓度的检测一般会形成S形曲线，即在浓度相对较小的改变会造成快速增加。随着浓度增加效力减慢的点即为IC5(I。根据现有技术所知，可以通过对最佳拟合线求导来从数学上确定这个点。本发明进一步所使用的，“EC5(I”或“一半最大有效浓度”是指引起基线和最大活性之间的中点的强度反应时的化合物浓度。因此，递增的剂量响应曲线的EC5tl表示其达到最大作用50%时的化合物的浓度。优选的,本发明Sirt5抑制剂抑制Sirt5的活性的IC5tl小于或等于5 μ M。更优选的，Sirt5抑制剂抑制Sirt5脱丙二酰化和脱琥珀酰化的活性的IC5tl小于或等于5 μ M，而且抑制Sirtsl-3脱乙酰活性的IC5tl大于或等于100 μ Μ。化合物抑制Sirt5脱丙二酰化和脱琥珀酰化的活性的IC5tl小于或等于5 μ Μ，而且抑制Sirtsl-3脱乙酰活性的IC5tl大于或等于100 μ Μ，则被认为是Sirt5特异性抑制剂。本发明Sirt5激动剂优选地激活Sirt5的活性的EC5tl小于或等于5 μ M。更优选地，Sirt5激活剂激活Sirt5脱丙二酰化和脱琥珀酰化的活性的EC5tl小于或等于5 μ M，而且激活Sirtsl-3脱乙酰活性的EC5tl大于或等于100 μ Μ。化合物激活Sirt5脱丙二酰化和脱琥珀酰化的活性的EC5tl小于或等于5 μ Μ，而且激活Sirtsl-3脱乙酰活性的EC5tl大于或等于100 μ Μ，则被认为是Sirt5 特异性激动剂。 可用于开展实验的试剂盒另一方面，本发明提供了一种检测样品中Sirt5活性的试剂盒，可筛选上述抑制或增强Sirt5活性的化合物。所述试剂盒包括含有上述酰化赖氨酸的底物肽。—个实施例提供了一种检测Sirt5活性的试剂盒，包括:(a)底物肽；(b)裂解剂，它裂解底物肽的活性会随着底物肽的酰化水平的变化而变化。另一个实施例提供了一种能筛选抑制或提高Sirt5活性的化合物的试剂盒，包括:(a)底物肽；(b)Sirt5 ； (c)裂解剂,它裂解底物肽的活性会随着底物肽的酰化水平的变化而变化。通常，每个组分，(a)底物肽，(b)Sirt5，和(c)裂解剂是分开包装的。本发明中的试剂盒分开的组分通过组合实现最终适合反应的浓度。进一步说，除了上述组分，所述试剂盒还可以包括提供合适反应条件的缓冲液。酶制剂和底物肽可以和其它稳定蛋白的组分组合在一起。例如，优选的在制备液中加入使最终浓度是1%的BSA和多元醇，比如蔗糖和果糖，其最终浓度达0.2到10%，优选的，1%，作为防止蛋白在冻干后失活的成分。根据本发明所述试剂盒的每个组分可以是液体或干燥形式。本领域中常用的洗涤剂，防腐剂，缓冲液等，可以加到上述组分中，只要他们不会阻碍脱酰化活性的检测。候选抑制剂的合成硫代琥珀酰和硫代丙二酰肽通过形成停滞的共价中间体抑制Sirt5脱琥珀酰和脱丙二酰活性。所述硫代琥珀酰和硫代丙二酰肽参与Sirt5催化反应的第一步，形成不能进一步反应的共价中间体。因为其它去乙酰化酶不能识别琥珀酰和丙二酰赖氨酸肽，所以硫代琥珀酰和硫代丙二酰肽是Sirt5特异性抑制剂。在一个实施例中，所述候选化合物是小分子。所述的“小分子”是指小分子有机化合物，比如，杂环，肽，糖类，留体之类的。优选的，所述小分子调节剂的分子量小于1500道尔顿，1000道尔顿，，800道尔顿，或者甚至小于500道尔顿。所述化合物可以被修饰以提高其性质，比如有效性，稳定性或者药学上的兼容性。在一个具体的实施例中，所述Sirt5抑制剂是H3K9硫代琥珀酰(H3K9TSU)肽。硫代琥珀酰优选于硫代丙二酰是因为琥珀酰赖氨酸比丙二酰赖氨酸具有更低的对Sirt5的Km值。SIRT5特异性抑制剂本发明提供了抑制Sirt5脱琥珀酰或脱丙二酰活性的化合物。所述Sirt5抑制剂
被描述具有下列通式:
权利要求
1.一种识别Sirt5脱丙二酰或脱琥珀酰活性的调节剂的方法，包括: 提供候选化合物； 提供底物，所述底物包含与指示剂部分连接的丙二酰或琥珀酰赖氨酸； 在上述候选药物存在的情况下，将底物和Sirt5接触，使底物被Sirt5脱丙二酰和脱琥珀酰化； 用裂解剂接触所述脱丙二酰化或脱琥珀酰化的底物，所述裂解剂裂解所述赖氨酸和所述指示剂部分间的连接，以释放出所述指示剂部分，从而产生可检测的信号；以及 建立信号强度和Sirt5脱丙二酰或脱琥珀酰活性间的相关性；其中，存在所述候选化合物时Sirt5脱丙二酰或脱琥珀酰活性相对于不存在所述候选化合物情况时Sirt5脱丙二酰或脱琥珀酰活性的变化将所述候选化合物识别为Sirt5脱丙二酰或脱琥珀酰活性的调节剂。
2.按权利要求1所述的方法，其中所述底物是肽，所述肽包含丙二酰或琥珀酰赖氨酸，所述丙二酰或琥珀酰赖氨酸通过肽键与所述指示剂部分共价连接。
3.按权利要求2所述的方法，其中所述裂解剂是蛋白水解酶。
4.按权利要求3所述的方法，其中所述蛋白水解酶是胰蛋白酶。
5.按权利要求1所述的方法，其中所述指示剂部分有荧光性质。
6.按权利要求5所述的方法，其中所述指示剂部分包含荧光团，所述荧光团在指示剂部分被裂解和释放时会改变其发射波长。
7.按权利要求5所述的方法，其中所述指示剂部分包含荧光团，并且所述底物也用淬火基团标记，当所述指示剂部分从底物上裂解时，其会产生荧光信号。
8.按权利要求5所述的方法，其中所述指示剂部分包含荧光团，所述荧光团是供体-受体荧光团对中的一个，并且所述荧光团对中的一个和赖氨酸残基的羧基末端相连，另一个直接或间接地和赖氨酸残基的氨基末端相连。
9.按权利要求8所述的方法，其中所述指示剂荧光团从底物上裂解时会减弱基于荧光共振能量转移(FRET)的信号强度。
10.按权利要求5所述的方法，其中所述指示剂部分是7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)。
11.按权利要求10所述的方法，其中所述底物是ISGASE(SuK)-AMC(SEQ ID NO: 11)。
12.按权利要求1所述的方法，其中所述候选化合物是小分子。
13.按权利要求12所述的方法，其中所述候选化合物具有下式:
14.按权利要求1所述的方法，进一步包括检测候选分子影响Sirtl、2、或3中任何一个的脱乙酰活性的能力。
15.一种识别或测定Sirt5脱丙二酰和脱琥珀酰活性的方法，包括: 提供底物，所述底物包含与指示剂部分连接的丙二酰或琥珀酰赖氨酸； 在有生物样本存在的情况下，将底物和Sirt5接触，使底物被Sirt5脱丙二酰和脱琥珀酰化； 用裂解剂接触所述脱丙二酰化和脱琥珀酰化的底物，所述裂解剂裂解所述赖氨酸和所述指示剂部分间的连接，以释放出所述指示剂部分，从而产生可检测的信号；以及 建立信号强度和Sirt5脱丙二酰化或脱琥珀酰化活性间的相关性；其中信号强度的增加提示存在Sirt5脱丙二酰和脱琥珀酰活性。
16.一种用于Sirt5活性的底物，所述底物包含与指示剂部分连接的丙二酰赖氨酸，所述指示剂部分能产生指示Sirt5脱丙二酰化活性的可检测信号。
17.按权利要求16所述的底物，其中所述底物是AMC-丙二酰肽。
18.一种用于Sirt5活性的底物，所述底物包含与指示剂部分连接的琥珀酰赖氨酸，所述指示剂部分能产生可检测信号提示Sirt5琥珀酰化的活性。
19.按权利要求18所述的底物，其中所述底物是AMC-琥珀酰肽。
20.按权利要求19所述的底物，其中所述底物是ISGASE(SuK)-AMC(SEQ ID ΝΟ:11)肽。
21.一种抑制Sirt5脱丙二酰或脱琥珀酰活性的化合物，所述化合物具有下式:
22.按权利要求21所述的化合物，其中所述化合物是硫代琥珀酰赖氨酸化合物。
23.按权利要求22所述的化合物，其中所述化合物是Η3Κ9硫代琥珀酰肽。
24.按权利要求21所述的化合物，其中所述化合物抑制Sirt5脱丙二酰或脱琥珀酰活性，IC5tl小于或等于5 μ M。
25.按权利要求24所述的化合物，其中所述化合物抑制Sirtl、2、或3脱乙酰化活性，IC50 大于 100 μ Mo
26.一种治疗或预防紊乱的方法，所述紊乱的特征在于，Sirt5脱丙二酰或脱琥珀酰活性异常，所述方法包含向所述对象给予药学有效量的根据权利要求21所述的化合物，以治疗或预防所述紊乱。
27.一种识别Sirt5脱丙二酰或脱琥珀酰活性的试剂盒，包括: 底物，所述底物包含与指示剂部分连接的丙二酰或琥珀酰赖氨酸；以及 裂解剂，所述裂解剂裂解所述底物肽的活性的变化，取决于所述底物肽是否被酰化。
28.一种识别Sirt5脱丙二酰或脱琥珀酰活性的调节剂的试剂盒，包括: 底物，所述底物包含与指示剂部分连接的丙二酰或琥珀酰赖氨酸； Sirt5 ;以及 裂解剂，所述裂解剂裂解所述底物肽的活性的变化，取决于所述底物肽是否被酰化。
全文摘要
Sirt5，一种线粒体去乙酰化酶，在本发明中其被鉴定具有脱丙二酰和脱琥珀酰活性。基于Sirt5强的酶活性，本发明公开了一种鉴定Sirt5调节剂的方法。特异性的Sirt5调节剂可以被用于Sirt5的生物功能的研究，也可以靶向Sirt5活性用于治疗人类疾病。
文档编号G01N33/15GK103097545SQ201180043047
公开日2013年5月8日 申请日期2011年7月7日 优先权日2010年7月7日
发明者林合宁 申请人:康奈尔大学