专利名称：一种谷物中结合态脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量的检测方法
技术领域：
本发明涉及谷物中结合态脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量的检测方法，属于分析测试领域。
背景技术：
脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)，亦称呕吐毒素，是赤霉病病原菌的次级代谢产物。赤霉病导致谷类作物减产、加工品质下降，而且受侵染谷物含有DON等多种真菌毒素。小麦、大麦、玉米是最容易受到DON污染的粮食作物。DON具有多种毒性作用低剂量摄入时可导致动物摄食减少、生长减缓，高剂量时可导致厌食、呕吐、腹泻等中毒症状，猪对DON尤其敏感。在分子水平，DON对真核细胞具有多重抑制作用，通过抑制蛋白质、DNA和RNA的合成，显著改变真核细胞体液免疫、细胞介导免疫功能。欧盟、加拿大、美国、澳大利亚规定小麦中DON的最大限量分别为1250 μ g/kg、2000 μ g/kg、1000 μ g/kg和 500 μ g/kg。我国规定小麦及小麦粉中DON的最大允许限量为1000 μ g/kg。联合国粮农组织和世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会(JECFA)规定DON的暂定每日允许最大摄入量(PMTDI)为 I μ g/kg · bw0近年来研究发现，在赤霉病污染的谷物中除了游离态DON外还存在结合态DON。结合态DON是作物在受到赤霉病菌侵染时，为降低DON在谷物中积累、抵御赤霉病扩展代谢产生的，主要包括D0N-3-葡萄糖苷(D3G)等。在谷物加工及其制品的生产过程中，结合态DON 和DON—样可以留存在食品以及饲料中。由于在常规的毒素分析中难以被检测，结合态DON 又称为隐蔽型DON。动物饲喂试验表明，结合态DON可以在哺乳动物肠道内重新转化为游离态的D0N，并进而表现出DON的毒性。因此，建立谷物中结合态DON的定量检测方法，对于准确评价谷物中真菌毒素的含量水平、开展真菌毒素暴露水平研究具有重要意义。目前，结合态DON的检测方法主要有两种一是高效液相色谱-质谱(HPLC-MS) 法，可以对谷物中的D3G进行定性、定量分析，但由于缺少标准样品尚不能对其它的结合态 DON进行分析，并且需要昂贵的仪器设备；二是酸催化水解法，将谷物中结合态DON水解成游离态D0N，再通过HPLC-UV或者酶联免疫吸附(ELISA)分析水解前后DON的含量，对谷物中的结合态DON进行定量分析，不需要昂贵的仪器设备和结合态DON标准样品。但结合态 DON具有良好的稳定性，水解条件(酸种类、温度、时间等)影响结合态DON的转化率，进而影响检测方法的准确性。常用的三氯乙酸，需要在140°C的高温下进行水解，对设备有很高的要求，同时操作时也有一定的危险性。
发明内容
技术问题本发明的目的在于针对目前水解法分析谷物中结合态DON含量时需要在高温下进行水解，对设备有很高的要求以及操作具有一定危险性，提供一种新的谷物中结合态DON 含量检测方法。
技术方案本发明是这样实现的一种谷物中结合态脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量的检测方法， 其特征在于谷物样品粉碎后三氟甲烷磺酸催化水解，通过检测水解前后脱氧雪腐镰刀菌烯醇的含量，两者之差为谷物中结合态脱氧雪腐镰刀菌烯醇的含量。在本发明中，所述的谷物为大麦、小麦、玉米等。在本发明中，所述的三氟甲烷磺酸(TFMSA)催化水解其条件为三氟甲烷磺酸溶液浓度0.01 0.0211101/1;谷物样品与三氟甲烷磺酸溶液质量体积比1 : 4 I : 8;温度30 600C ;时间30 60min ;中和试剂0. 5 I. Omol/L碳酸钠溶液。在本发明中，所述的脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量的检测方法为高效液相色谱-紫外 (HPLC-UV)法。有益效果本发明的优点在于三氟甲烷磺酸催化水解条件温和，不需要耐高温、高压设备， 操作简便、安全，便于推广普及。本发明用3A-D0N做添加回收试验，观察三氟甲烷磺酸法测定谷物中结合态DON准确性。从表I的数据来看，不同添加水平(100 ΙΟΟΟμ g/mg)均表现出了良好的回收率 (84. O 90. 7% )，表明三氟甲烷磺酸水解法可以应用于谷物中结合态DON含量的定量分析。
具体实施例方式下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步的说明，但不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述本发明的内容作出一些非本质的改进和调整。实施例I步骤I :谷物中DON含量的分析(I)提取称取粉碎的山农优麦3号小麦样品(江苏红旗农场)2. 5g于50mL的具塞离心管中，加入25mL水,室温下超声波水浴提取30min。然后4500rpm离心IOmin,取IOmL 上清液加入等体积的无水乙醇4°C沉淀lh, 4500rpm离心15min,上清液旋转蒸发至近干,用 2mL水溶解，供固相萃取净化。(2)净化将上述2mL水溶液通过已经活化的Oasis固相萃取小柱(Waters公司， 美国)，用3mL水洗漆,用2mL乙酸乙酯洗脱,洗脱液在50°C下N2吹至近干,用500 μ L水溶解，过0. 22 μ m微孔滤膜，供HPLC分析。(3)高效液相色谱-紫外(HPLC-UV)分析色谱条件色谱柱，C18 (250X4. 6mm, 5 μ m);流动相，乙腈+水(10 : 90, v/v);流速，I. 0ml/min ;柱温,35°C ;进样量，20yL;波长，224nm。用DON标准溶液(100 μ g/mL，Sigma公司，美国)配置系列工作溶液，外标法定
量样品中DON含量。结果山农优麦3号中DON含量为1280 μ g/kg。步骤2 :水解后谷物中DON含量的分析(I)三氟甲烷磺酸(TFMSA)溶液配制秤取适量TFMSA (上海威方精细化工有限公司)，加入到水中，配置浓度为0. 01mol/L TFMSA溶液。
(2)水解称取步骤I中的小麦样品2. 5g于50mL的具塞离心管中，加入O. Olmol/ L TFMSA溶液20mL，振荡后在40°C放置45min。反应结束后用O. 5mol/L碳酸钠溶液中和， 并加水至总提取溶剂为25mL。然后4500rpm离心lOmin，取IOmL上清液加入等体积的无水乙醇4°C沉淀lh，4500rpm离心15min，上清液旋转蒸发至近干，用2mL水溶解，供固相萃取净化。(3)净化同步骤I中⑵。(4)HPLC-UV分析同步骤I中(3)。结果水解后山农优麦3号中DON含量为 1540 μ g/kg。步骤3 :谷物中结合态DON含量计算谷物中结合态DON含量=水解后谷物中DON含量-谷物中DON含量结果山农优麦3号中结合态DON含量为260 μ g/kg。实施例2步骤I :谷物中DON含量的分析(I)提取称取粉碎的扬麦14小麦样品(江苏红旗农场)2. 5g于50mL的具塞离心管中，加入25mL水，室温下超声波水浴提取30min。然后4500rpm离心lOmin，取IOmL上清液加入等体积的无水乙醇4°C沉淀Ih,在4500rpm离心15min,上清液旋转蒸发至近干,用 2mL水溶解，供固相萃取净化。(2)净化将上述2mL水溶液通过已经活化的Oasis固相萃取小柱(Waters公司， 美国)，用3mL水洗漆,用2mL乙酸乙酯洗脱,洗脱液在50°C下N2吹至近干,用500 μ L水溶解，过O. 22 μ m微孔滤膜，供HPLC分析。(3) HPLC-UV分析色谱条件色谱柱，C18 (250 X 4. 6mm, 5 μ m);流动相，乙腈+水 (10 90, v/v);流速，LOml/min ;柱温，35°C ;进样量，20yL ;波长，224nm。用 DON 标准溶液(ΙΟΟμ g/mL，Sigma公司，美国)配置系列工作溶液，外标法定量样品中DON含量。结果扬麦14中DON含量为562 μ g/kg。步骤2 :水解后谷物中DON含量的分析(I)三氟甲烷磺酸(TFMSA)溶液配制秤取适量TFMSA (上海威方精细化工有限公司)，加入到水中，配置浓度为O. 02mol/L TFMSA溶液。(2)水解称取步骤I中的小麦样品2. 5g于50mL的具塞离心管中，加入O. 02mol/ L TFMSA溶液15mL，振荡后在40°C放置40min。反应结束后用O. 5mol/L碳酸钠溶液中和， 并加水至总提取溶剂为25mL。然后4500rpm离心lOmin，取IOmL上清液加入等体积的无水乙醇4°C沉淀lh，4500rpm离心15min，上清液旋转蒸发至近干，用2mL水溶解，供固相萃取净化。(3)净化同步骤I中⑵。⑷HPLC-UV分析同步骤I中(3)。结果水解后扬麦14中DON含量为970 μ g/
kg ο步骤3 :谷物中结合态DON含量计算谷物中结合态DON含量=水解后谷物中DON含量-谷物中DON含量结果扬麦14中结合态DON含量为408 μ g/kg。实施例3
3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3A-D0N)的添加回收试验步骤I :小麦样品总DON (游离态DON+结合态DON)的测定按实施例I的步骤2测定小麦样品山农12号(江苏红旗农场)水解后DON的含量。步骤2 添加3A-D0N的小麦样品总DON的测定(I)称取2. 5g粉碎的步骤I中样品于50mL具塞离心管中，加入适量3A-D0N溶液 (I μ g/mL, Sigma公司，美国)，并在室温下放置过夜(使3A-D0N渗透到样品中)。然后按照步骤I测定样品总DON含量。目前，采用酸水解测定谷物中结合态DON得到的是各种结合态DON的总和，尚不能区分其组分。但通过添加某种已知组分并测定其回收率可以获得方法准确性的相关信息。 3A-D0N也属于一种结合态D0N，目前尚不完全清楚是由赤霉病病原菌产生还是由植物代谢产生。本实施例用3A-D0N做添加回收试验，观察三氟甲烷磺酸法测定谷物中结合态DON准确性。从表I的数据来看，不同添加水平(100 ΙΟΟΟμ g/mg)均表现出了良好的回收率 (84. O 90. 7% )，表明三氟甲烷磺酸水解法可以应用于谷物中结合态DON含量的定量分析。 表I 3A-D0N添加回收实验结果*
3A-DON添加水平** 添加前样品中总DON 添加后样品中总DON , π _
,η λa且,n Λa旦，n、添加回收率(％)
(pg/kg)S 重(Hg/kg)S M (Hg/kg)
100276984.0
5002685312688.2
1000359290.7*为三次重复试验平均值(η = 3)。** 以 DON 计。
权利要求
1.一种谷物中结合态脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量的检测方法，其特征在于谷物样品粉碎后加入三氟甲烷磺酸TFMSA催化水解，通过检测水解前后脱氧雪腐镰刀菌烯醇的含量， 两者之差即为谷物中结合态脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量。
2.根据权利要求I所述的一种谷物中结合态脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量的检测方法，其特征在于所述的谷物为大麦、小麦或玉米。
3.根据权利要求I或2所述的一种谷物中结合态脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量的检测方法，其特征在于所述的三氟甲烷磺酸TFMSA催化水解其条件为三氟甲烷磺酸溶液浓度O.01 O. 02 mol/L ;谷物样品与三氟甲烷磺酸溶液质量体积比1 4 I : 8;温度30 600C ;时间30 60 min ;中和试剂0. 5 I. O mol/L碳酸钠溶液。
4.根据权利要求I或2所述的一种谷物中结合态脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量的检测方法，其特征在于所述脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量的检测方法为高效液相色谱-紫外HPLC-UV 法。
5.根据权利要求3所述的一种谷物中结合态脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量的检测方法，其特征在于所述脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量的检测方法为高效液相色谱-紫外HPLC-UV法。
全文摘要
本发明涉及谷物中结合态脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)含量的检测方法，属于分析测试领域。主要针对大麦、小麦、玉米等谷物中结合态DON的检测。它是利用三氟甲烷磺酸将被测样品中的结合态DON水解转化为游离态DON，再通过高效液相色谱法分析水解前后被测样品中DON的含量，对谷物中结合态DON含量进行定量分析。三氟甲烷磺酸可在温和条件(30～60℃)下催化水解结合态DON，无需耐高温、高压设备，操作简便、安全，便于推广普及。
文档编号G01N30/02GK102590380SQ20121002911
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月10日 优先权日2012年2月10日
发明者张平平, 杨丹, 杨学明, 耿志明 申请人:江苏省农业科学院