专利名称：一种玉米农华101种子纯度检测方法
技术领域：
本发明属于种子质量检测领域，具体涉及一种玉米农华101种子纯度检测方法。
背景技术：
聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE (Polyacrylamide gel electrophoresis),是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳技术。聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应，用于分离蛋白质和寡糖核苷酸。在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。从玉米种子中提取的蛋白质在凝胶的分子筛效应、样品的浓缩效应和电泳分离的电荷效应下得到良好的分离，通过显色显示蛋白质谱带类型。不同品种因遗传基础不同，因而形成的蛋白质种类和数量不同，电泳分离后所形成的蛋白质谱带类型也不同，并可作为 品种指纹(Fingerprint)，即鉴定品种的生化性状，利用品种指纹来分析单粒种子鉴定品种纯度。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种玉米农华101种子纯度检测方法。本发明提供的方法，包括如下步骤I)种子蛋白质提取取单粒种子粉碎后，加入0. 6-0. 8ml蛋白提取液，摇匀，盖好后在室温放置20-40min，加样前4000-8000rpm离心10_20min ；2)取步骤I)离心后的上清，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；3)电泳后将胶板进行染色，按农华101的标准谱带鉴别出异品种种子粒数，计算品种纯度，其中，所述的蛋白提取液为含有质量分数为15-20%和体积分数为15-20%的冰醋酸的水溶液。其中，聚丙烯酰胺凝胶电泳的电极缓冲液为含有体积分数为0. 3-0. 5%冰醋酸和质量分数为0. 03-0. 05%甘氨酸的水溶液。其中，聚丙烯酰胺凝胶电泳的分离胶按如下方式制备I)制备制胶液I号90g丙烯酰胺+3g甲叉双丙烯酰胺加水溶解并定容至500ml ；2号60g脲加水溶解并定容至200ml ；3号48ml IM氢氧化钾+17. 2ml冰乙酸加无离子水溶解并定容至IOOml ；5号四甲基乙二胺的原液；6号10g过硫酸铵加水溶解并定容至IOOml ；2)灌分离胶依次取I号22. 5ml、2号5ml、3号3. 75ml>6号I. 6ml、5号0. 2ml混合摇勻后，灌入胶室至距顶端2-3cm为止，避免形成气泡，胶聚合后，用滤纸或注射器吸去析出的水。其中，聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓缩胶按如下方式制备I)制备制胶液I号90g丙烯酰胺+3g甲叉双丙烯酰胺加水溶解并定容至500ml ；2号60g脲加水溶解并定容至200ml ；4号48ml IM氢氧化钾+2. 9ml冰乙酸加水溶解并定容至100ml。5号四甲基乙二胺的原液； 6号10g过硫酸铵加水溶解并定容至IOOml ；2)灌浓缩胶依次取I号3ml、2号2ml、4号5ml、6号0. 3ml、5号0. 04ml迅速摇勻后灌入分尚胶上面，并立即插入样品梳，待浓缩胶聚合后拔出样品梳，用吸去各凹槽中多余的水分。其中，聚丙烯酰胺凝胶电泳中，每个样品加样25-30 yl。本发明具有以下有益效果I)快速、简便农华101传统纯度检测方法为SSR检测，该方法样品采用人工挖胚，还要进行多对引物筛选，从提取到电泳染色操作全过程复杂繁琐，一个工作日(按8小时计算)至多能够完成7个样品的纯度检验。而本发明方法样品使用单粒样品粉碎进行研磨，采用比例药剂配方，提取至电泳染色步骤简单，可轻松出具12个样品的纯度结果，检验速度几乎翻倍。2)电泳谱带清晰、可长期保存采用SSR标记的检测需在紫外凝胶成像系统中观测，清晰度很难调节，只能获得电泳图片，胶片无法保存，而且胶片中残留EB，毒性大，不利环保。而本方法电泳谱带在胶片上即可清晰显现，无剧毒，易于观测将其装去自封袋放入冰箱或放入水中加几滴醋酸都可长期保存。3)节约成本经计算，本发明方法所需仪器设备价格不到SSR检测的1/10，所用药品价钱也很便宜，检验相同样品量成本至少降低一半左右。总之，本发明方法是对玉米杂交种农华101纯度检验的一项技术性突破，适应范围广，节约效果显著，有很好的应用推广价值。
图I所示为父母本和农华101种子的聚丙烯酰胺凝胶电泳谱图。图2所示为聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定农华101的电泳图。图3所示为本发明对比例I的SSR的电泳图。其中，A为引物umcl705的SSR电泳谱图；B为引物umc2105的SSR电泳谱图；M为母本，F为父本，H为农华101杂交种。图4所示为本发明对比例2的盐溶PAGE电泳图。其中，泳道1-4为农华101的父本，泳道5-8为农华101的母本，泳道9-24为农华101。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例II、溶液配制I)蛋白提取液称取脲80g粉剂,加入80ml冰乙酸,然后加无离子水,定容至500ml。置于棕色广口瓶中，低温避光保存。2)电极缓冲液吸取冰乙酸4. 4ml，加入甘氨酸0.44g，再加入无离子水溶解定容至1100ml，低温保存。3)制胶液I号90g丙烯酰胺+3g甲叉双丙烯酰胺加无离子水溶解并定容至500ml。2号60g脲加无离子水溶解并定容至200ml。3号48ml氢氧化钾(lmol/L)+17. 2ml冰乙酸加无离子水溶解并定容至100ml。4号48ml氢氧化钾(lmol/L)+2. 9ml冰乙酸加无离子水溶解并定容至100ml。5号四甲基乙二胺的原液。6号IOg过硫酸铵加无离子水溶解并定容至IOOml。注以上各号药品均置于棕色广口瓶中低温避光保存。4)指示剂0. Ig甲基绿加无离子水溶解并定容至IOOml并存放于滴瓶内。5)染色液10%三氯乙酸200ml加入考马斯亮兰R250的I %无水乙醇溶液10ml。2、种子贮藏蛋白质提取取单粒种子用单粒粉碎器粉碎，收集到离心管中，然后加入0.6ml提取液，摇匀，盖好后在室温(20°C左右)放置30min，在加样前5000rpm离心15min。样品浸提在冰箱中进行更好，可保存2天，再电泳时只需将样品重新摇动一次就行。测定杂交种纯度的种子样品数量取决于测定所接受的可靠程度。通常分析200粒单粒种子即可，推荐测定400粒单粒种子。
3、凝胶室制作垂直板夹芯电泳槽安装比较简便，先将洗净干燥的玻璃板装入橡胶封条中，然后插入电泳槽中，拧紧螺栓，配少量浓缩胶封好底缝后把胶条固定在电泳槽中，保持水平，以防漏水。4、灌分离胶依次取I号22. 5ml、2号5ml、3号3. 75ml、6号I. 6ml、5号0. 2ml混合摇勻后，小心灌入胶室至距顶端2cm左右为止，应避免形成气泡，如出现气泡可用细不锈钢针快速挑出。在室温下IOmin左右胶可聚合，用滤纸或注射器吸去析出的水。5、灌浓缩胶依次取I号3ml、2号2ml、4号5ml、6号0. 3ml、5号0. 04ml迅速摇勻后灌入分尚胶上面，并立即插入样品梳(必须注意，灌胶动作应快速，否则会由于太慢，在倒入前开始聚合)。2min左右待浓缩胶聚合后小心平衡地拔出样品梳，用注射器(亦可用滤纸)吸去各凹槽中多余的水分。
6、加样用微量进样器吸取蛋白提取上清液，注入浓缩胶上的凹槽内。一般每个样品加样25 30 ill (对每板25梳齿的)，若加样量太多,会使蛋白质谱带模糊而难以分辨；加样过少，则有的谱带可能丢失。每点一个样要用无离子水清洗进样器。7、电泳加样完毕后，小心倒入电极液，并在上槽加入4-6滴甲基绿指示剂，接好电极引线(中间正极两边负极)，接通电源逐渐将电压调至190V。电流时要求在15-20°C温度下进行，如气温高于这一范围，可放在空调室冷却。电泳开始时，甲基绿在浓缩胶中浓缩成一条细线，进入分离胶后，甲基绿开始扩散电泳至槽底部距胶底部边缘0. 5-lcm处时，关闭电泳仪(一般电泳时间约2h)。8、卸板电泳结束后倒出电极缓冲液，拧松固定螺杆，将玻璃板和密封胶带一同取出，卸下密封胶带，小心地剥下胶板。9、染色胶板用无离子水漂洗后，浸入染色液(事先倒入瓷盘)，在30°C恒温下染色2_3h，或室温4. 5h以上。10、保存倒去染色液，用清水漂洗，并用湿软毛笔刷去胶板表面的沉淀，然后用7%醋酸液保存。11、鉴定按品种标准谱带鉴别出不同的异品种种子粒数，计算出品种纯度。品种纯度(％ )=本品种粒数/供试总粒数X 100
从图I中可以看出，农华101具有父本和母本两者的特异谱带，能轻易地进行鉴别。图2所示为用本发明的方法鉴定的一批农华101的杂交种，图中“丨”所表示的为母本(自交苗)种子，“I”所表示的为其他品种杂粒。可以看出，用本发明方法进行农华101
蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳，条带清晰，母本种子和杂粒易于辨识。对比例ISSR检测农华101种子纯度一处理种子I.随机取100-200粒种子，放入自封袋中，注名编号。2.将装有玉米种子的自封袋放入沸水中煮5分钟，热水泡1-2小时，以便于切胚。二样本DNA提取I.随机取泡软的种子96粒，切胚于96孔深孔板中，每孔加200 U I DNA提取液I (0. lmol/L NaOH)，煮沸 10 分钟；2.每孔分别加入200 u I DNA提取缓冲液II (pH为8. 0的TE缓冲液+0. 5mol/LHCL)形成样品DNA溶液，提取完毕，样品DNA溶液可以直接进行PCR扩增或在4°C冰箱中保存。三基因扩增I.取96孔PCR板一块，每孔中依次加入超纯水、PCR MagicMix2. 0 (A型，含酶)、引物，混匀；
2.每孔再加入2 ill样品DNA溶液，盖封板膜后放入PCR仪，扩增。四电泳(注意，此环节应在单独的工作区/台进行，戴手套操作。条件允许，应配备单独的电泳室。)I.用电子天平称取Agrosel2g,倒入350mll XTAE缓冲液中；2.放入微波炉加热溶化，稍冷(以烫手但能拿住为标准)加入Gelsafe35 yl (重复利用的胶加30 ii I)，混匀；3.倒入制胶槽,插入胶梳,冷却0. 5h ； 4.拔除胶梳，将凝胶连托板一并放入加好电泳缓冲液的电泳槽，点样，电泳，30-45min后停止电泳。 五凝胶成像及数据处理I.将电泳后凝胶放入凝胶成像仪，启动电脑，打开凝胶成像软件，成像并保存；2.观察电泳图片，计算出母本自交株数、父本株数、其它杂株数，进而求出该样品纯度。纯度=(供试总株数-总杂株数)+供试总株数X 100% (见图3)。图3A、B分别表示在引物umcl705和umc2105下得到的两种农华101电泳谱带。虽然SSR的方法也能鉴定出农华101，但效率较低，而且EB有毒，成本较高，不利于大规模的开展。对比例2盐溶PAGE检测农华101种子纯度所需试剂丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、抗坏血酸、硫酸亚铁、蔗糖、氯化钠、甲基绿、考马斯亮蓝R250、甘氨酸、过硫酸铵、琼脂、乳酸钠、乳酸、无水乙醇、三氯乙酸、异丙醇。 :本实验试剂均采用分析纯、水均采用去离子水(蒸馏水)所需仪器物品砸样器、单粒粉碎器、离心管、移液枪、PH计、高速离心机、磁力搅拌器、电炉、天平、电冰箱、观片灯、微量进样器、电泳仪、电泳槽、移液管、烧杯等。具体操作步骤各药品的制备I)提取液配置取I. 753gNacl、0. 03g甲基绿、15g鹿糖溶于IOOml蒸懼水中。2)凝胶系统的配置SI 95g丙烯酰胺、3. Sg甲叉双丙烯酰胺溶于500ml蒸馏水中搅拌并过滤。S2 :2. 8g乳酸钠溶于9ml蒸馏水中，用乳酸调pH值到3. 2，定容全100ml。S3 0. 48g抗坏血酸、0. 008g硫酸亚铁溶于IOOml蒸馏水中。S4 3ml乳酸钠溶于95ml蒸懼水中，定容至100ml。S5 26g丙烯酰胺、5. 2g甲叉丙烯酰胺溶于200ml蒸馏水中搅拌并过滤。S6 :11. 41g过硫酸铵溶于IOOml蒸馏水中。3)电极缓冲液的配置3. 6g甘氨酸、0. 9ml乳酸溶于1800ml蒸馏水中。4)染色液的配置染色液为A : B = I 4( 一般为25mlA溶于IOOmlB中)
A :取0. 7g考马斯亮蓝溶于500ml乙醇溶液中。B :取500g三氯乙酸溶于4000ml蒸馏水中。样品制备用四分法或分样器从送验样品中随机分出所需数量的种子，用砸样器或单粒粉碎机研碎(每砸一粒都应将砸样器彻底清扫干净，防止粒与粒间的混杂)，放入
I.5ml离心管中放于离心架上，做好记录；用移液枪加入与样品等体积的样品提取液，放入冰箱中提取。20-40min后离心备用。制备胶室将预先洗净晾干的玻璃板装入胶条中(安装时手不能接触玻璃板内壁)，然后把胶条固定在垂直板电泳槽内，保持水平，短板向正极，拧紧螺栓，并用琼脂封边 缝防止漏夜。封底胶是S5 S2 S3 = 2 I I取封底胶于烧杯中(约12ml)，加入适量催化剂，迅速摇匀，沿长玻璃板外侧倒入，振动放平。灌分离胶SI : S2 : S3 :水=7 : I : I : I底缝封住后你，用滤纸吸去析出的水。取分离胶(约50ml)，加入适量催化剂迅速摇匀，倾斜电泳槽，将分离胶溶液倒入两个玻璃板之间，迅速加入适量异丙醇封住胶面。待凝胶聚合后，吸出分离胶表面的异丙醇，并用蒸馏水冲洗胶面后用滤纸吸干。灌浓缩胶S5 S4 S3 = 2 I I取浓缩胶(约10ml)，加入适量催化剂迅速摇匀，倾斜电泳槽，将浓缩胶溶液倒入两个玻璃板之间，迅速插入样品梳，注意不要插反。点样浓缩胶聚合后，倒入电极缓冲液，轻轻将样品梳拔出，用微量进样器在每个样品槽中加入10-20ul不同籽粒的样品上清液，每点一粒都要用蒸馏水清洗1-2次进样器。电泳先接电泳槽再接电源，电极不要插反。电泳直至甲基绿指示剂下移至胶底部边缘时，时间约90min左右,切断电源。卸板倒出电极缓冲液，从电泳槽中取出胶室，卸下胶条，浸入染色液中染色，根据品种的不同染色时间为4_12小时。洗板取出胶片用清水洗净，标记存放。结果计算待整个供检验品电泳结束后，看电泳谱带的特征和一致性，计算供检样品粒数和非本品种粒数。
J3 O、油丨^油V /n/、 供检样品粒数-非本品种粒数电冰测定值X ( % ) =-XIUU
供检样品粒数样品纯度值Y = 52. 9+0. 46IX。然而，从图4可以看出，用此方法无法得出101的特异性谱带，进而无法进行纯度鉴别。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.ー种玉米农华101种子纯度检测方法，其特征在于，包括如下步骤 1)种子蛋白质提取取单粒种子粉碎后，加入0.6-0. 8ml蛋白提取液，摇匀，盖好后在室温放置 20-40min，加样前 4000_8000rpm 离心 10_20min ； 2)取步骤I)离心后的上清，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳； 3)电泳后将胶板进行染色，按农华101的标准谱带鉴别出异品种种子粒数，计算品种纯度， 其中，所述的蛋白提取液为含有质量分数为15-20%和体积分数为15-20%的冰醋酸的水溶液。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，聚丙烯酰胺凝胶电泳的电极缓冲液为含有体积分数为0. 3-0. 5%冰醋酸和质量分数为0. 03-0. 05%甘氨酸的水溶液。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，聚丙烯酰胺凝胶电泳的分离胶按如下方式制备 1)制备制I父液 I号90g丙烯酰胺+3g甲叉双丙烯酰胺加水溶解并定容至500ml ； 2号60g脲加水溶解并定容至200ml ； 3号48ml IM氢氧化钾+17. 2ml冰こ酸加水溶解并定容至IOOml ； 5号四甲基こニ胺的原液； 6号IOg过硫酸铵加水溶解并定容至IOOml ； 2)灌分离胶 依次取I号22. 5ml、2号5ml、3号3. 75ml、6号I. 6ml、5号0. 2ml混合摇勻后，灌入胶室至距顶端2-3cm为止，避免形成气泡，胶聚合后，用滤纸或注射器吸去析出的水。
4.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓缩胶按如下方式制备 1)制备制I父液 I号90g丙烯酰胺+3g甲叉双丙烯酰胺加水溶解并定容至500ml ； 2号60g脲加水溶解并定容至200ml ； 4号48ml IM氢氧化钾+2. 9ml冰こ酸加水溶解并定容至100ml。
5号四甲基こニ胺的原液； 6号10g过硫酸铵加水溶解并定容至IOOml ； 2)灌浓缩胶 依次取I号3ml、2号2ml、4号5ml、6号0. 3ml、5号0. 04ml迅速摇勻后灌入分尚胶上面，并立即插入样品梳，待浓缩胶聚合后拔出样品梳，用吸去各凹槽中多余的水分。
5.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，聚丙烯酰胺凝胶电泳中，每个样品加样25_30u Io
全文摘要
本发明公开了一种玉米农华101种子纯度检测方法，其包括如下步骤1)种子蛋白质提取取单粒种子粉碎后，加入0.6-0.8ml蛋白提取液，摇匀，盖好后室温放置20-40min，在加样前4000-8000rpm离心10-20min；2)取步骤1)离心后的上清，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；3)电泳后将胶板进行染色，按农华101的标准谱带鉴别出异品种种子粒数，计算品种纯度，其中，所述的蛋白提取液为含有质量分数为15-20％和体积分数为15-20％的冰醋酸的水溶液。本发明方法快速、简便、电泳谱带清晰、可长期保存、节约成本、有很好的应用推广价值。
文档编号G01N27/447GK102788830SQ20121018979
公开日2012年11月21日 申请日期2012年6月8日 优先权日2012年6月8日
发明者兰星, 王玺 申请人:北京金色农华种业科技有限公司