专利名称：金银异金属簇合物在制备细胞核仁荧光染色试剂中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种荧光染色试剂，尤其是涉及一种金银异金属簇合物在制备细胞核仁荧光染色试剂中的应用。
背景技术：
核仁(nucleolus)是真核细胞间期核中最显著的结构，其呈单个或多个均质的球形小体。核仁的大小、形状和数目随生物的种类、细胞类型和细胞代谢状态而变化。在真核细胞中的核仁具有很重要的功能，它是rRNA合成、加工和核糖体亚单位的装配场所。因此对核仁结构、动态和功能的研究，不仅为早期细胞学家所密切关注，而且自上世纪60年代发现核仁的重要功能以来，也一直备受各相关领域研究者的高度重视。最早对细胞核仁的结构观察是通过电镜进行的，由于需对生物样品进行脱水、染色、包埋等处理，所观察到的 是一个静态的结构，因此限制了对核仁的生理功能的进一步研究。荧光成像是一项灵敏的、非侵入式、费用相对低廉的可视化检测途径，其分辨率可达百纳米，可实现从细胞到动物的活体成像，是目前现代科学研究的一个重要方法。细胞的区域性荧光染色是非常重要的工作。然而，目前细胞荧光标记探针存在以下缺点首先，光稳定性差，在激发光连续照射下迅速发生光漂泊。其次，细胞易发生光损伤，特别是荧光团存在的情况下，发生光漂白时产生的自由基会对细胞样本造成损害。因此，发明光稳定的细胞荧光染色试剂是非常重要的工作。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有快速、稳定的对细胞核仁区域进行特异性染色优异效果的金银异金属簇合物在制备细胞核仁荧光染色试剂中的应用。所述金银异金属簇合物[Au6Ag2(C) (dppy)6] (BF4)4用文献Jian-HuaJia, Quan-Ming Wang; J. Am. Chem. Soc. 2009, 131, 16634-16635 的方法合成。dppy= 二苯基膦基-2-吡啶。所述金银异金属簇合物对细胞核仁区域具有荧光染色作用，其细胞核仁染色性能达到或超过现有已知的同类产品水平，可用于制备细胞核仁荧光染色试剂。本发明考虑到异金属簇合物具有丰富的构效关系，通过结构优化和筛选，得到的金银异金属簇合物具有快速、稳定的对细胞核仁区域进行特异性染色的优异效果。本发明所述金银异金属簇合物是一类液态发强光且稳定性高的化合物。细胞试验表明，本发明设计合成的金银异金属簇合物可实现对HeLa细胞核仁区域进行特异性染色，光稳定性良好，成像稳定，在相同激发光持续照射下，本发明荧光标记的细胞具有很强的抗光淬灭能力，不易发生光漂白。采用本发明方法标记细胞方便快捷，荧光信号标记时间长，并且适应范围广，发明的方法和试剂盒可用于活细胞，也可用于固定细胞标记。该系列簇合物，结构简单，合成工艺简易且效率高、成本低廉，在生物医药学中具有非常广阔的应用前
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图I为金银异金属簇合物在HeLa细胞中的激光共聚焦成像图。在图I中，标尺为10 μ m ；a为金银异金属簇合物，b为明场，c为叠加。图2为金银异金属簇合物在细胞内的发射光谱。在图2中，横坐标为波长Wavelength (nm),纵坐标为光谱强度 Luminescence intensity (a. u)。图3为金银异金属簇合物和染核仁试剂Syto Green RNA-select在HeLa细胞中的共定位突光成像图。在图3中，标尺为10 μ m ;a为Syto Green RNA-select, b为金银异金属簇合物，c为明场，d为叠加。图4为金银异金属簇合物和染核仁试剂Syto Green RNA Select在细胞内的发射光谱。在图4中，横坐标为波长Wavelength (nm),纵坐标为光谱强度Luminescenceintensity (a. u) ;a为染核仁试剂Syto Green RNA Select, b为金银异金属簇合物。·图5为金银异金属簇合物和有机染料DAPI的光稳定性比较(405nm激光持续照射，不同时间点采集为0，200s, 400s的经金银异金属簇合物和DAPI染色的HeLe细胞共聚焦荧光成像。在图5中，DAPI为有机染料，Jl为金银异金属簇合物。图6为金银异金属簇合物和有机染料DAPI的光稳定性比较的光漂白速率曲线。在图6中，横坐标为时间Time (s),纵坐标为强度Intensity(a. u);曲线a为DAPI (460±20nm)，曲线为金银异金属簇合物(570±20nm)。
具体实施例方式实施例I金银异金属簇合物的细胞核仁荧光染色I)人宫颈癌细胞株HeLa(购自中国科学院上海细胞库)，在含10%胎牛血清的DMEM培养液中，37°C，5%C02，饱和湿度条件下培养。每两天更换培养液，每3 4天传代一次。2)细胞培养玻片的处理。将Φ 14mm的盖玻片用水洗净，放入硫酸一重铬酸钾液浸泡24h，蒸馏水洗涤，泡入无水乙醇，备用。3)细胞爬片的制备。将盖玻片平铺于Φ35πιπι的培养皿中，以1父105细胞/11^接种，37 °C，5%C02，置培养箱培养。4)待细胞贴壁，用磷酸缓冲液(PBS)洗涤3次，加入终浓度为10 μ M金银异金属簇合物溶液室温孵育lOmin，随后吸出溶液，PBS洗涤细胞3次，每次3 5min。5)用405nm激光作为激发光(FV-LD40激光器，Olympus，25mW，日本)，对簇合物染色的细胞荧光信号进行收集(570 土 20nm)，观察细胞荧光成像。结果具体可以参见图I和2，从图I和2中可以观察到经本发明的簇合物标记的细胞核仁显示出很强的荧光，由此证明，本发明的标记方法能够特异性对培养的活细胞细胞核仁区域进行荧光标记。实施例2共定位荧光染色具体步骤见实施例1，经金银异金属簇合物染色后，PBS洗漆加4%的多聚甲醒固定液2mL,固定30min,加入商品化染核仁试剂Syto Green RNASelect (Invitrogen)进一步孵育20min,随后吸出溶液,PBS洗漆细胞3次,每次3 5min。分别用405nm和488nm激光对簇合物和Syto Green RNA Select孵育的细胞进行荧光信号收集(金银异金属族合物570±20nm; Syto Green RNA Select :530±20nm)结果具体可以参见图3和4，从图中可以观察到经本发明的簇合物标记的细胞核仁与商品化细胞核仁染色试剂Syto Green RNA Select能够很好的匹配，由此证明本发明的标记方法能够对活细胞核仁区域进行特异性荧光标记。实施例3簇合物和DAPI细胞内光稳定性具体步骤见实施例1，经簇合物染色后，PBS洗涤加4%的多聚甲醛固定液2mL，固定30min，加入有机染料DAPI进一步孵育20min，随后吸出溶液，PBS洗涤细胞3次，每次3 5min。经405nm激光连续照射细胞进行时间序列扫描。结果具体可以参见图5和6，从图中可以观察到经本发明的方法标记的细胞核仁 区域显示出很强的荧光信号，随着时间的推移(420s)，簇合物的光稳定性较有机染料DAPI高，由此证明，本发明的标记方法具有较高的荧光稳定性。
权利要求
1.金银异金属簇合物在制备细胞核仁荧光染色试剂中的应用。
全文摘要
金银异金属簇合物在制备细胞核仁荧光染色试剂中的应用，涉及一种荧光染色试剂。提供一种具有快速、稳定的对细胞核仁区域进行特异性染色优异效果的金银异金属簇合物在制备细胞核仁荧光染色试剂中的应用。所述金银异金属簇合物[Au6Ag2(C)(dppy)6](BF4)4用文献Jian-Hua Jia,Quan-Ming Wang;J.Am.Chem.Soc.2009,131,16634-16635的方法合成。dppy=二苯基膦基－2－吡啶。所述金银异金属簇合物对细胞核仁区域具有荧光染色作用，其细胞核仁染色性能达到或超过现有已知的同类产品水平，可用于制备细胞核仁荧光染色试剂。
文档编号G01N1/30GK102798561SQ20121027725
公开日2012年11月28日 申请日期2012年8月6日 优先权日2012年8月6日
发明者王泉明, 李富友, 雷振, 陈敏 申请人:厦门大学, 复旦大学