一种人乳铁蛋白夹心elisa检测试剂盒及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种人乳铁蛋白的夹心ELISA检测试剂盒，包括包被抗体和酶标抗体，其中所述包被抗体为人乳铁蛋白多克隆抗体，所述酶标抗体为人乳铁蛋白单克隆抗体。本发明可用于转基因成分定量检测，根据标准曲线在25～200ng/mL范围内线性良好，可实现对样品的高特异性和高灵敏度检测。该方法采用夹心ELISA法，敏感、特异、操作方便。
【专利说明】—种人乳铁蛋白夹心ELISA检测试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物检测领域，具体来说涉及人乳铁蛋白夹心ELISA检测试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002]在转基因生物新品种培育重大专项和国家其他经费的资助下，我国转基因猪、牛和羊新品种研发获得了蓬勃发展，多个转基因动物品种展示了良好的产业化前景，其中发展最为迅速的是乳腺生物反应器的利用，目前转人乳铁蛋白基因奶牛已经通过了农业部规定的中间试验、环境释放、生产性试验，距离获颁最终的农业转基因生物安全证书仅有一步之遥。
[0003]由于转基因生物及其产品存在风险，转基因生物及产品的管理一直受到各国政府的高度重视。牛奶和奶制品是人们餐桌上最常见的一类食物，食品安全直接关系民生，在没有足够的数据证明其安全之前，质检机构均有责任和义务去检测和监测这些已上市或即将上市的转基因产品。开发一种实用、灵敏、特异的人乳铁蛋白成分检测试剂十分必要。
[0004]目前用于检测乳铁蛋白的方法主要有高效液相色谱法、毛细管电泳法、放射性免疫法和酶联免疫吸附法等，但是检测人乳铁蛋白的报道却并不多。王燕平等建立了一种人乳中乳铁蛋白ELISA检测方法，为间接ELISA法，摸索了 ELISA操作的工作条件，检测人乳铁蛋白的限度为1.56?100ng/mL。该方法针对标准品检测灵敏度高，但针对样品的检测灵敏度低。双抗体夹心ELISA又称抗原捕捉ELISA，该方法已被大量用于动物疫病的临床诊断，该方法最关键的条件是制备高纯度的包被抗体，纯度越高，则特异性越好，但尚无人乳铁蛋白转基因成分双抗体夹心ELISA检测方法的报道。
【发明内容】
[0005]本发明目的是提供一种人乳铁蛋白夹心ELISA检测试剂盒用于定量检测转基因成分。
[0006]本发明另一目的是提供人乳铁蛋白夹心ELISA检测试剂盒检测人乳铁蛋白的方法。
[0007]本发明再一目的是提供人乳铁蛋白夹心ELISA检测试剂盒在检测转基因牛奶及奶制品中人乳铁蛋白含量中的应用。
[0008]本发明提供的人乳铁蛋白的夹心ELISA检测试剂盒，包括包被抗体和酶标抗体，其中所述包被抗体为人乳铁蛋白多克隆抗体，所述酶标抗体为人乳铁蛋白单克隆抗体。
[0009]其中，所述人乳铁蛋白单克隆抗体由保藏号为CGMCC N0.6394的杂交瘤细胞株分泌获得。
[0010]用重组蛋白hLF免疫雌性BALB/c小鼠,取脾细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合,经ELISA法进行阳性克隆筛选、通过有限稀释法进行亚克隆，获得稳定分泌抗hLF的4株细胞1C2、2G11、3A6、3D12。取杂交瘤细胞(效价较高同时细胞状态好)注射至小鼠腹腔，收集腹水，亲和柱纯化得单克隆抗体。
[0011]经鉴定腹水制备前细胞上清效价检测显示细胞3D12效价最高。3D12细胞亚型为IgGl+kappa。3D12细胞能与免疫原hLF反应，不与筛选原牛乳铁蛋白(bLF)反应。用细胞3D12制备腹水，检测腹水效价为1:81000，腹水纯化检测单克隆抗体效价为1:81000，抗体纯度高于95%。
[0012]杂交瘤细胞ZZY hLF 3D12的保藏号为:CGMCC N0.6394 ;保藏时间:2012年7月20日；保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC);保藏地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所。
[0013]所述人乳铁蛋白单克隆抗体可用于检测转基因牛奶中表达量数量级为g/L的人乳铁蛋白。Western Blot检测显示抗体3D12只与转基因牛奶及奶粉反应，不与非转基因牛奶及奶粉反应。
[0014]其中，所述酶标抗体的标记酶为辣根过氧化物酶。
[0015]其中，所述人乳铁蛋白多克隆抗体是以人乳铁蛋白作为免疫抗原，分批次免疫正常家兔，加强免疫后7天收集血清，分离纯化得到。
[0016]纯化抗体通过考马斯亮蓝验证，多克隆抗体能满足要求，浓度约为2mg/mL。采用间接ELISA法对抗体IgG进行鉴定，抗体效价达到1: 200，000。
[0017]其中，检测样本中免疫抗原检测限为25ng/mL。
[0018]所述人乳铁蛋白的夹心ELISA检测试剂盒还包括以下试剂中的一种或几种:
[0019]I)洗涤液；
[0020]2)底物显色液；
[0021]3)反应终止液；
[0022]4 )人乳铁蛋白标准品。
[0023]所述洗涤液为PBST，所述底物显色液为TMB，所述反应终止液为2mol/L H2S04。
[0024]所述试剂盒检测人乳铁蛋白的方法，包括如下步骤:
[0025]I)向包被人乳铁蛋白多克隆抗体的酶联板中加入人乳铁蛋白抗原标准品和待检测样品，洗涤液洗板；
[0026]2)加入酶标人乳铁蛋白单克隆抗体，洗涤液洗板；
[0027]3)加入底物显色液显色,加入反应终止液终止反应,测定0D450值；
[0028]4)以人乳铁蛋白抗原标准品的剂量-效应曲线为标准曲线，计算样品人乳铁蛋白的含量。
[0029]具体包括以下步骤:
[0030]I IgG标准曲线的建立:
[0031]将人乳铁蛋白多克隆抗体包被于酶联板上，洗板；封闭经包被的酶联板，洗板；力口入不同浓度的人乳铁蛋白抗原标准品溶液，洗板；加入酶标人乳铁蛋白单克隆抗体，洗板；加底物显色；终止反应；测定0D450值，以与阴性对照孔OD值的比值大于2.1为限，作为判断为阳性或确定效价的临界点，建立标准曲线；
[0032]II检测样品中人乳铁蛋白的含量:
[0033]将人乳铁蛋白多克隆抗体包被于酶联板上，洗板；封闭经包被的酶联板，洗板；力口入待检测样品，洗板；加入酶标人乳铁蛋白单克隆抗体，洗板；加底物显色；终止反应；测定0D450值，通过与标准曲线比对，定量检测人乳铁蛋白。
[0034]优选地，人乳铁蛋白多克隆抗体浓度为5 μ g/mL,包被液为pH9.6磷酸缓冲液，酶标人乳铁蛋白单克隆抗体稀释倍数为1:500。
[0035]具体实施步骤如下:
[0036]I IgG标准曲线的建立:
[0037](I)包被:浓度为5 μ g/mL兔多克隆抗体，100 μ L/孔，4°C过夜，洗液洗涤3次；
[0038](2)封闭:加150 μ L/孔封闭液，37°C 2小时后，洗涤3次，拍干，置4°C冰箱保存备用；
[0039](3)加标准样品:
[0040]混合转基因样品和非转基因样品制备人乳铁蛋白抗原标准品，标准品原始浓度为
0.2mg/mL，分别按照 1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000 稀释，PBS作为阴性对照；加入不同浓度的人乳铁蛋白抗原标准品溶液100 μ L/孔，37°C孵育30min，洗板4次，拍干；
[0041](4)加二抗:小鼠单克隆抗体-HRP抗体，按1:500的稀释比例加入，37 °C孵育20min,洗板4次，拍干；
[0042](5)显色:TMB 按 10(^17孔加入，37°〇`显色 15_30min ；
[0043](6)终止:加入终止液2M H2S0450 μ L/孔；
[0044](7)读数:以450nm单波长测定各孔OD值，以与阴性对照孔OD值的比值大于2.1为限，作为判断为阳性或确定效价的临界点，建立标准曲线；
[0045]II检测样品中人乳铁蛋白的含量:
[0046](I)包被:浓度为5 μ g/mL兔多克隆抗体，100 μ L/孔，4°C过夜，洗液洗涤3次；
[0047](2)封闭:加150 μ L/孔封闭液，37°C 2小时后，洗涤3次，拍干，置4°C冰箱保存备用；
[0048](3)加待测样品:
[0049]加入待测样品，100 μ L/孔，37°C孵育30min，洗板4次，拍干；
[0050](4)加二抗:小鼠单克隆抗体-HRP抗体，按1:500的稀释比例加入，37 °C孵育20min,洗板4次，拍干；
[0051](5)显色:TMB 按 10(^17孔加入，37°〇显色 15_30min ；
[0052](6)终止:加入终止液2M H2S0450 μ L/孔；
[0053](7)读数:以450nm单波长测定各孔OD值，通过与标准曲线比对，定量检测人乳铁蛋白。
[0054]本发明的有益效果:本发明的人乳铁蛋白单克隆抗体纯度高，效价高，灵敏度高，无交叉反应，专一性强，可特异性识别转基因样品，可直接对外源表达蛋白进行检测，同时避免了核酸检测方法中，基因提取费时费力且容易污染的问题。本发明可用于转基因牛奶及奶制品中人乳铁蛋白的定量检测，根据标准曲线在25~200ng/mL范围内线性良好，可实现对样品的高特异性和高灵敏度检测，检测成本低廉，结果迅速，灵敏可靠，而且可以稳定、方便地提供准化的试剂，便于实现工业化生产。
【专利附图】
【附图说明】[0055]图1为免疫后小鼠血清WB检测结果图；其中Al:l#l:1000 ;A2:1#1:3000 ;A3:2#1:1000 ；A4:2#1:3000 ；A5:3#1:1000 ；A6:3#1:3000 ;A7:4#1:1000 ;A8:4#1:3000 ；A9:5#l:1000 ；A10:5#1:3000 ；
[0056]图2为腹水制备前细胞上清WB检测结果图；其中1:1C2 ；2:2G11 ；3:3A6 ；4:3D12 ；5:1C2 ；6:2G11 ；7:3A6 ；8:3D12 ；
[0057]其中，1-4道上样 hLF 4 μ g ;5_8 道上样 bLF 4 μ g ;
[0058]图3为SDS-PAGE检测纯化后抗体纯度检测结果图；其中1:蛋白marker ；2:3D12小鼠单克隆抗体；
[0059]图4为单克隆抗体检测样品结果图；其中1:转基因牛奶；2:转基因牛奶；3:转基因牛奶；4:转基因奶粉(管壁)；5:转基因奶粉(管顶)；6:非转基因脱脂奶粉；7:非转基因脱脂奶粉；8:非转基因牛奶；9:非转基因牛奶；
[0060]图5为hLF多克隆抗体纯化考马斯亮蓝染色图；
[0061 ]其中，1-1:BSA2mg/mL ； 1-2:BSAlmg/mL ； 1-3:BSA0.5mg/mL ； 1-4:BSA0.25mg/mL ；
1-5:BSA0.125mg/mL ;1_6:BSA0.0625mg/mL:2~1:洗脱管 I ;2_2:洗脱管 2 ;2_3:洗脱管 3 ；
2-4:洗脱管4 ；2-5:洗脱管5 ；2-6:洗脱管6 ；
[0062]图6为hLF多克隆抗体效价图；
[0063]图7为hLF标准品检测标准曲线；
[0064]图8为模拟样品检测标准曲线。
【具体实施方式】
[0065]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0066]转人乳铁蛋白基因奶牛样品来自中国农业大学农业生物技术国家重点实验室；日本大耳白兔购自军事医学科学研究院实验动物中心；人乳铁蛋白购自Sigma公司。
[0067]人乳铁蛋白(hLF)，牛乳铁蛋白(bLF)、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂购自Sigma公司；96孔酶标板购自北京宏捷成生物科技有限公司；四甲基乙二胺(TEMED)购自Amresca公司；96孔培养板、25孔培养板、6孔培养板、T-25培养瓶、T-75培养瓶、250mL培养瓶、2mL冻存管购自corning公司；超滤管购自Millipore公司；HAT、100XHT、PEG4000购自Sigma公司；RPMI1640培养基购自Hyclone公司；胎牛血清购自Gibico公司；层析柱购自Phamacia公司，石腊油购自BBI公司；HRP标记试剂盒(CatNo31488)购自Pierce公司；山羊抗小鼠IgG-HRP、山羊抗兔IgG-HRP购自中杉金桥生物公司；TMB (可溶型)购自天根生物公司；IgG纯化试剂盒购自嘉兴行建生物科技有限公司。
[0068]层析柱购自Phamacia公司；涡旋仪购自江苏海门市其林贝尔公司；高速微量离心机购自美国Sigma公司；ElixRMilliQRBiocelTM纯水系统购自美国Millipore公司；舒适性恒温仪购自eppendorf公司；台式冷冻离心机、真空浓缩仪购自eppendorf公司；电热恒温水浴锅购自PolyScience公司；NanoDropl000紫外/可见分光光度计购自NanoDrop公司；恒温鼓风干燥箱、摇床购自中国智成公司；紫外凝胶成像系统购自UVP公司；PYY-6C型稳压稳流电泳仪、DYCP-31C微型水平电泳槽购自北京六一厂；高压灭菌锅、_80°C冰箱购自日本三洋公司；混合型球磨仪购自Retsch公司；酶标仪，BIO-RAD ;二氧化碳培养箱，购自SANYO ;蛋白电泳装置,购自BioRad公司；蛋白定量检测仪,购自AmershamBiosciences公司。
[0069]转基因牛奶、奶粉样品来自中国农业大学农业生物技术国家重点实验室，非转基因牛奶及脱脂奶粉购自超市。
[0070]实施例1hLF单克隆抗体的制备
[0071]1、小鼠抗体的制备
[0072]选择6周龄同一批次健康的雌性Balb/c小鼠10只作为实验动物，随机分为2组，实验组5只(1#、2#、3#、4#、5#小鼠)，对照组2只。实验组用hLF进行免疫，用PBS缓冲液代替hLF进行免疫作为阴性对照。每只小鼠皮下注射总量为100 μ L用佐剂乳化好的抗原(250 μ LPBS溶解400 μ g抗原后与250 μ L弗氏不完全佐剂混合，共500 μ L，每只小鼠注射100 μ L)。第一次基础免疫剂量为每只小鼠80 μ g，加强免疫免疫剂量为每只小鼠40 μ g，基础免疫时使用弗氏完全佐剂乳化，加强免疫时用弗氏不完全佐剂乳化。基础免疫后间隔10天进行加强免疫。共免疫3次，小鼠在第3次加强免疫后7天，尾静脉采血，检测血清中抗体滴度(间接ELISA法)，如滴度未达到1: 104，0D1.0以上，则再加强免疫。在抗体滴度达到1:1O4后的第10天眼眶采血，分离血清，-20°C保存备用。
[0073]2、间接ELISA法检测免疫小鼠的抗体水平
[0074]以hLF作为包被抗原，包被浓度:20 μ g/mL,利用间接ELISA法检测血清抗体水平。实验组血清稀释倍数依次为:1:1000、1:3000、1:9000、1:27000、1:81000、1:240000、1:720000 ;对照组血清1:3000稀释。
[0075]hLF间接ELISA法测定的基本操作步骤如下:
[0076](I)包被:将hLF用包被液(磷酸缓冲液pH9.6)稀释至20 μ g/mL，用微量加样器吸取稀释后的抗原加入96孔酶标板，100 μ L/孔，置4°C冰箱过夜。
[0077](2)洗涤:取出ELISA板，弃去孔内液体，在纸巾上轻轻叩打以除去残留液体，加入PBST洗涤液，300 μ L/孔，静置Imin，重复操作3?5次。
[0078](3)封闭:用微量加样器按200 μ L/孔加1%BSA，放入37°C温箱2h。
[0079](4)洗涤:同步骤2)。
[0080](5)加待检样本:用PBS缓冲液将血清稀释，血清稀释倍数依次为:1:1000、1:3000、1:9000、1:27000、1:81000、1:240000、1:720000 ;对照组血清 1:3000 稀释，放入37°C温箱 Ih ；
[0081](6)洗涤:同步骤2)。
[0082](7)加酶标抗体:用PBST洗涤液将HRP标记的山羊抗小鼠二抗稀释到工作浓度1:5000，每孔加 100 μ L，37°C温箱孵育 45min。
[0083](8)洗涤:同步骤2)。
[0084](9)加底物溶液:避光按100 μ L/孔加入TMB底物溶液，室温孵育15min。
[0085](10)终止反应:室温下加终止液50 μ L/孔,终止反应。
[0086](11)测0D450值:检测450nm波长下的OD值。
[0087]表1.经三次免疫后小鼠血清效价的测定结果
[0088]
~1:1000 ~1:3000 ~1:9000 ~1:27000 ~1:81000 ~1:240000 ~1:720000 ~PBS~
【权利要求】
1.一种人乳铁蛋白的夹心ELISA检测试剂盒，包括包被抗体和酶标抗体，其中，所述包被抗体为人乳铁蛋白多克隆抗体，所述酶标抗体为人乳铁蛋白单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述人乳铁蛋白单克隆抗体由保藏号为CGMCC N0.6394的杂交瘤细胞株分泌获得。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述酶标抗体的标记酶为辣根过氧化物酶。
4.根据权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于，还包括以下试剂中的一种或几种: 1)洗涤液； 2)底物显色液； 3)反应终止液； 4)人乳铁蛋白标准品。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述洗涤液为PBST，所述底物显色液为TMB，所述反应终止液为2mol/L H2S04。
6.利用权利要求1-5任一项所述的试剂盒检测人乳铁蛋白的方法，包括如下步骤: 1)向包被人乳铁蛋白多克隆抗体的酶联板中加入人乳铁蛋白标准品和待检测样品，洗漆液洗板； 2)加入酶标人乳铁蛋白单克隆抗体，洗涤液洗板； 3)加入底物显色液显色，加入反应终止液终止反应，测定0D450值； 4)以人乳铁蛋白标准品的剂量-效应曲线为标准曲线，计算样品人乳铁蛋白的含量。
7.权利要求1-5任一项所述的试剂盒在检测转基因牛奶及奶制品中人乳铁蛋白含量中的应用。
【文档编号】G01N33/577GK103575903SQ201210279850
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2012年8月7日 优先权日:2012年8月7日
【发明者】朱振营, 刘建, 林祥梅, 吴绍强, 付伟, 李风翠, 仇松寅 申请人:中国检验检疫科学研究院